Name: Rapid One-step Synthèse enzymatique et All-aqueuse Purification de tréhalose Analogues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Découvrez une synthèse enzymatique rapide en une étape et une purification entièrement aqueuse d'analogues du tréhalose. Cette méthode efficace et écologique permet de produire des sondes pour la détection des mycobactéries.

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Ce travail a été financé par une subvention des National Institutes of Health (R15 AI117670) à B.M.S et P.J.W, ainsi que par une bourse de recherche du Cottrell College de la Research Corporation (20185) à P.J.W. L.M.M. a été soutenu par une bourse du doyen de la CMU.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Analogues de tréhalose ont le potentiel d&#39;avoir un impact divers domaines, de la conservation des aliments et des produits pharmaceutiques pour le diagnostic et le traitement des infections microbiennes 6. Les méthodes existantes de synthèse en plusieurs étapes chimiques sont utiles pour produire des analogues de trehalose complexes avec de multiples sites de modification (par exemple, des glycolipides mycobactériens complexes d&#39; origine naturelle). Cependant, ces procédés sont t...

Trehalose est un disaccharide symétrique non réducteur consistant en deux fractions de glucose qui sont liés par un 1,1-α, une liaison α-glycosidique (figure 1A). Alors que le tréhalose est absent de l' homme et d' autres mammifères, on trouve communément dans les bactéries, les champignons, les plantes et les invertébrés 1. Le rôle principal de tréhalose dans la plupart des organismes est de protéger contre les contraintes environnementales, telles que la dessiccation 1. En outre, certains agents pathogènes humains exigent tréhalose pour la virulence, y compris le Mycobacterium tuberculosis tuberculosis causant, qui utilise le tréhalose en tant que médiateur de l' enveloppe cellulaire biosynthèse et comme un bloc de construction pour la construction de glycolipides immunomodulateurs 2. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg"> Figure 1: tréhalose et analogues tréhalose. (ALes structures de tréhalose) naturel et un analogue de tréhalose non naturel, où X est une modification structurelle. (B) Des exemples d'analogues de tréhalose dans la littérature qui ont des applications potentielles en imagerie biologique et biopréservation. En raison de sa structure unique et les fonctions physiologiques, tréhalose a attiré beaucoup d' attention pour une utilisation en bio (techno) logique et applications biomédicales 3. Les propriétés protectrices du tréhalose observée dans nature- par exemple, sa capacité de frappe pour aider à maintenir la vie dans les plantes "résurrection" qui ont subi une déshydratation extrême 4 -avoir stimulé son utilisation intensive dans des applications de biopréservation. Tréhalose a été utilisé pour conserver une grande variété d'échantillons biologiques, tels que des acides nucléiques, des protéines, des cellules, des tissus et 3. Par exemple, le tréhalose est utilisé comme additif stabilisant dans un certain nombre de produits pharmaceutiques tchapeau sont sur le marché, y compris plusieurs anticorps monoclonaux anti-cancer 3. De plus, le tréhalose est utilisé comme édulcorant dans l'industrie alimentaire, et il est largement utilisé pour la conservation des produits dans les deux industries alimentaires et cosmétiques. L'adoption de tréhalose pour ces types d'applications commerciales était initialement limitée par l'impossibilité d'obtenir des quantités en vrac de tréhalose pur à partir de sources naturelles ou par synthèse. Cependant, un procédé enzymatique efficace pour la production économique de tréhalose à partir d'amidon a été récemment mis au point, ce qui a stimulé son utilisation commerciale à grande échelle 5. Les dérivés de tréhalose chimiquement modifié, désigné ici comme analogues de tréhalose, ont acquis un intérêt croissant pour des applications diverses (structure générale représentée sur la figure 1A, des exemples spécifiques d'analogues de trehalose représentées sur la figure 1B) 6. Par exemple, le lacto-tréhalose est un analogue de tréhalose avec l'une de ses unités de glucose remplacé par le galactose, donc son groupe hydroxyle en position 4 a une configuration stéréochimique inversée. Lacto-tréhalose a les mêmes propriétés stabilisantes que le trehalose mais résiste à la dégradation par les enzymes intestinales, ce qui rend attrayant comme additif alimentaire non calorique 6, 7. L'intérêt de notre groupe dans les analogues de tréhalose est principalement liée à leur valeur en tant que sondes et des inhibiteurs spécifiques de mycobactéries. Les groupes Barry et Davis ont développé un céto-analogue de tréhalose conjugué à la fluorescéine, du nom FITC-céto-tréhalose, qui a été montré pour étiqueter métaboliquement la paroi cellulaire de M. tuberculosis en temps réel, permettant sa détection par microscopie à fluorescence à 8. Le laboratoire Bertozzi développé plus petit azido-tréhalose (TreAz) analogues qui pourraient métaboliquement étiqueter la paroi cellulaire et ensuite être detète utilisant clic chimie et analyse de fluorescence 9. Ces progrès indiquent la possibilité d'utiliser des sondes à base de trehalose comme agents d'imagerie de diagnostic de la tuberculose. Analogues de tréhalose ont également été poursuivis comme inhibiteurs de M. tuberculosis en raison de leur potentiel de perturber les voies de la bactérie qui sont essentiels pour la viabilité et la virulence 10, 11, 12. Jusqu'à présent, le principal obstacle au développement des analogues de tréhalose pour les bio (techno) applications logiques et biomédicales est le manque de méthodes de synthèse efficaces. Les deux voies traditionnelles de la production d' analogues de tréhalose reposent sur la synthèse chimique (figure 2). Une voie consiste désymétrisation / modification du tréhalose naturel, tandis que l'autre consiste à commencer par convenablement fonctionnalisés, des blocs de construction monosaccharides et à effectuer la glycosylation chimiqueforger le 1,1-α, liaison α-glycosidique. Ces approches, qui ont été récemment abordés dans les articles de revue 13, 14, se sont avérées utiles pour accomplir la synthèse multi - étapes de petites quantités de produits naturels complexes contenant du tréhalose, tels que sulfolipide-1 de M. tuberculosis 15. Cependant, les deux approches sont généralement inefficaces, de temps, inaccessible aux non-chimistes, et, en outre, ne sont pas considérés comme respectueux de l'environnement. Ainsi, pour la synthèse de certains types d'analogues de trehalose, ces stratégies ne sont pas idéales. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg"> Figure 2: Approches à la synthèse du tréhalose analogique. approches chimiques pour la synthèse du tréhalose analogique, montré sur la gauche, utiliser les procédures qui impliquent plusieurs étapes protec difficiletion étapes / déprotection, Desymmetrization et / ou glycosylation. Synthèse enzymatique, illustré à droite, utilise une enzyme (s) pour convertir stéréosélectivement substrats simples, non protégés à trehalose analogues en solution aqueuse. Le protocole enzymatique rapportée ici utilise une enzyme tréhalose synthase (TRET) pour convertir le glucose et les analogues de l'UDP-glucose dans les analogues de tréhalose en une seule étape. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Une biocatalytique voie efficace aux analogues tréhalose faciliterait la production, l'évaluation et l'application de cette classe prometteuse de molécules. Bien que le procédé enzymatique commerciale pour la production de tréhalose 5 ne sont pas adaptables à la synthèse des analogues car il utilise l' amidon comme substrat, il existe un autre chemin biosynthétiquedes moyens dans la nature qui peuvent être exploitées pour la synthèse de l'analogue de tréhalose. Cependant, la recherche dans ce domaine, qui a été récemment examiné 6, a été limitée. Un rapport a utilisé une méthode inspirée de la voie de biosynthèse du trehalose Escherichia coli pour accéder à un analogue de la fluoro-tréhalose à partir du fluoro-glucose correspondante. Cependant, cette approche nécessite un système à trois enzymes qui a l' efficacité et de la généralité 8 limitée. Une autre approche a été explorée consiste à utiliser tréhalose - phosphorylase (PRT) dans le sens inverse, ce qui permet , en principe , la synthèse une étape d'analogues de tréhalose à partir d' analogues de glucose et de glucose-1-phosphate de 6, 16, 17. Bien que cette approche peut avoir un avenir prometteur, les deux TREPS inverseurs et de retenue ont actuellement des inconvénients pour la synthèse analogique. Par exemple, TREPS inverseurs ont une expé prohibitifnsive molécule donneuse (β-D-glucose-1-phosphate) et TREPS de retenue ont une faible rendement d'expression d'une enzyme / stabilité et la promiscuité de substrat limitée. Des améliorations significatives (par exemple, par l' intermédiaire de l' ingénierie enzymatique) seront nécessaires avant que la synthèse analogique TREP-médiée est pratique. À l' heure actuelle, l'approche la plus pratique pour la synthèse enzymatique des analogues de tréhalose est d'utiliser une tréhalose synthase (TRET) une enzyme qui convertit le glucose et l' uridine diphosphate (UDP) Glucose dans le tréhalose en une seule étape 6. Nous avons récemment rapporté l'utilisation de Thermoproteus tenax Tret-une enzyme thermostable et unidirectionnel 18 -à synthétiser des analogues de tréhalose des analogues de glucose et UDP-glucose (Figure 3) 19. Cette enzyme ne fonctionne que dans le sens synthétique et évite le problème de la dégradation de la tréhalose trouve dans le système PRT. Cette réaction coul en une étaped être achevée en 1 heure, et une grande variété d'analogues de tréhalose ont été consultées avec un rendement élevé (jusqu'à&gt; 99% telle que déterminée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)) à partir de facilement disponibles substrats analogues de glucose (voir le tableau 1 dans les résultats représentatifs section). <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg"> Figure 3: Tret-synthèse catalysée par une étape d'analogues de tréhalose. TRET l'enzyme de T. tenax peut se joindre stéréosélectivement facilement disponibles analogues du glucose et UDP-glucose pour former des analogues de tréhalose en une seule étape. R 1 -R 4 = modification structurelle variable, par exemple azido-, fluoro-, désoxy-, thio-, stéréochimique ou modifications d'étiquettes isotopiques; Y = hétéroatome variable, par exemple de l'oxygène ou du soufre, ou un hétéroatome isotope. Ici, nous fournissons adetailed protocole pour le procédé de synthèse TRET, y compris l' expression et la purification de TRET de E. coli, optimisé les conditions de réaction TRET et un procédé amélioré de purification qui est réalisée entièrement dans la phase aqueuse. Ce protocole modifié permet la synthèse et la purification rapide et efficace des analogues de tréhalose diverses sur une échelle semi-préparative (10-100 mg). Nous démontrons également l'utilisation de ce protocole pour la préparation et l'administration d'une sonde à base de trehalose à mycobactéries en moins de 1 heure, ce qui a permis la détection de fluorescence rapide des cellules mycobactériennes.

<table><tbody><tr><td>LB</td><td>agar Research Products International</td><td>L24021</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon Luria</td><td>Research Products International</td><td>L24045</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Research Products International</td><td>T15050</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30256</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium, monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, 0,45 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09719D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-comprimés inhibiteurs de protéase, sans EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP nickel affinity, 5 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base ultrapure</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dialyse, MWCO 12&ndash ; 14 000</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-16</td><td></td></tr><tr><td>Analogues du glucose</td><td>CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiomarked Chemicals</td><td></td><td>Exemples de fournisseurs qui proposent de nombreux analogues du glucose</td></tr><tr><td>6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)</td><td>CarboSynth</td><td>MA02620</td><td></td></tr><tr><td>UDP-Glucose</td><td>abcam Biochemicals</td><td>ab120384</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Unité de filtration</td> centrifuge <td>EMD Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rex RG 501-X8 résine échangeuse d’ions à lit mixte</td><td>Bio-Rad</td><td>444-9999</td><td></td></tr><tr><td>Média extra-Fine Bio-Gel P2</td><td>Bio-Rad</td><td>150-4118</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de chromatographie à couche mince en gel de silice à dos de verre</td><td>EMD Millipore</td><td>1056280001</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0145</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium, 99,8 %</td> <td>Acros Organics</td><td>351430075</td><td></td></tr><tr><td>Colonne HPLC aminopropylique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58338</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Para-formaldéhyde</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Alcyne-488</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761621</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl]amine (TBTA)</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Medium de montage</td><td>Southern Biotechnology</td><td>10001</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid one-step synthèse enzymatique et all-aqueuse purification de tréhalose analogues

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

versions de tréhalose, ou analogues tréhalose modifiés chimiquement, des applications de la biologie, de la biotechnologie et de la science pharmaceutique, entre autres domaines. Par exemple, les analogues tréhalose portant des étiquettes détectables ont été utilisées pour détecter Mycobacterium tuberculosis et peuvent avoir des applications telles que la tuberculose des agents d&#39;imagerie de diagnostic. versions Hydrolytiquement stables de tréhalose sont également poursuivis en raison de leur potentiel d&#39;utilisation comme édulcorants non caloriques et agents bioprotectrices. Malgré l&#39;attrait de cette classe de composés pour diverses applications, leur potentiel reste inexploité en raison de l&#39;absence d&#39;une voie solide pour leur production. Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour la synthèse en une étape biocatalytique rapide et efficace des analogues de tréhalose qui évite les problèmes associés à la synthèse chimique. En utilisant la thermostable tréhalose synthase (TRET) enzyme de Thermoproteus tenax, les analogues de tréhalose peuvent être generated en une seule étape à partir des analogues de glucose et uridine diphosphate glucose avec un rendement élevé (jusqu&#39;à conversion quantitative) en 15-60 min. Un protocole de purification chromatographique non simple et rapide, qui consiste à filer une dialyse et d&#39;échange d&#39;ions, peut offrir de nombreux analogues de tréhalose de concentration connue dans une solution aqueuse en aussi peu que 45 minutes. Dans les cas où l&#39;analogue du glucose qui n&#39;a pas réagi reste encore, la purification chromatographique du produit analogue tréhalose peut être effectuée. Dans l&#39;ensemble, cette méthode fournit un &quot;vert&quot; plate-forme de biocatalytique pour la synthèse accélérée et la purification des analogues de tréhalose qui est efficace et accessible aux non-chimistes. Pour illustrer l&#39;applicabilité de cette méthode, nous décrivons un protocole pour la synthèse, tout aqueuse purification, et l&#39;administration d&#39;un click chemistry sonde à base de tréhalose à mycobactéries, qui a pris moins de 1 heure et a permis la détection de fluorescence des mycobactéries. Dans l&#39;avenir, nous prévoyons que, entre OTHer les applications, ce protocole peut être appliqué à la synthèse rapide des sondes à base de trehalose pour le diagnostic de la tuberculose. Par exemple, de courte durée analogues de tréhalose radionucléide modifiés (par exemple, 18 tréhalose F modifié) pourrait être utilisé pour les modalités cliniques avancées d&#39;imagerie telles que la tomographie par émission de positons-calculée (PET-CT).

T. tenax TRET a été obtenue à partir de E. coli dans un rendement d'environ 4 mg / L en utilisant des techniques d'expression de protéines et de purification standard. Une étape de Chromatographie d'affinité de nickel seul était suffisant pour purifier TRET à partir de E. coli lysat (FPLC une trace représentative est représentée sur la figure 4). Comme établi dans notre publication initiale sur le processus de synthèse TRET, T. tenax r...

Les analogues du tréhalose apparaissent comme des molécules importantes pour les applications bio(technologiques)logiques et biomédicales. Nous décrivons un protocole optimisé pour la synthèse enzymatique et la purification des analogues du tréhalose, simple, efficace, rapide et respectueux de l’environnement. Son application à la production et à l’administration rapides d’une sonde pour la détection de mycobactéries est démontrée.

Rapid One-step Synthèse enzymatique et All-aqueuse Purification de tréhalose Analogues

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

L’objectif global de cette méthode est de synthétiser et de purifier rapidement des analogues du tréhalose qui ont des applications possibles allant de la détection de bactéries pathogènes à la préservation de biomatériaux. Il s’agit d’une méthode rapide et à haut rendement qui permet d’accéder à des analogues du disaccharide tréhalose. Ces composés ont diverses applications établies et émergentes dans la recherche biomédicale et biotechnologique.Cette méthode consiste en une synthèse enzymatique en une étape et une purification tout aqueuse. Ensemble, ces procédures aident à résoudre certains des inconvénients des synthèses chimiques traditionnelles d’analogues du tréhalose, qui peuvent être longues, à faible rendement et défavorables à l’environnement. Les implications de cette méthode peuvent s’étendre à l’étude et au diagnostic de la tuberculose, car des analogues modifiés du tréhalose ont été utilisés pour l’imagerie de Microbacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose.Cette méthode peut également aider à accélérer la synthèse et l’évaluation des analogues du tréhalose pour d’autres applications possibles telles que la conservation de produits biologiques et l’utilisation comme édulcorants non caloriques. Avant de commencer la procédure, préparez une culture nocturne d’E. coli exprimant TreT. Pour commencer la procédure d’expression de TreT, placez 750 millilitres de milieu de croissance de la tuberculose dans une fiole de culture Fernbach de 2 800 millilitres et autoclavez-la.Ajoutez de l’ampicilline au bouillon pour obtenir une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre. Procurez-vous des cuvettes pour la spectroscopie UV-vis et remplissez une cuvette avec le bouillon du ballon à blanc. Ensuite, ajoutez trois millilitres de la culture de nuit d’E. coli exprimant TreT préparée dans le ballon.Incuber le ballon à 37 degrés Celsius en le secouant à 200 tr/min. Vérifiez périodiquement l’absorbance du bouillon à 600 nanomètres contre le blanc de bouillon. Lorsque la valeur d’absorbance à 600 nanomètres est comprise entre 0,5 et 1,0, ajoutez 750 microlitres d’arabinose dans le ballon pour induire l’expression de TreT.Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit tout en secouant à 200 tr/min. Ensuite, placez la culture dans une bouteille à centrifuger en polypropylène d’un litre et centrifugez-la à 4 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate de 15 millilitres.Transférez la suspension dans un tube de centrifugation conique et centrifugez dans les mêmes conditions. Jetez ensuite le surnageant et, si nécessaire, conservez la pastille à moins 80 degrés Celsius. Dissoudre un mini comprimé d’inhibiteur de protéase dans 20 millilitres de tampon de lavage.Ajoutez la solution inhibitrice de protéase à la pastille et agitez le mélange pour remettre la pastille en suspension. Transférez la suspension dans un bécher de 100 millilitres. Ensuite, sonifiez la suspension pour lyser les cellules en positionnant la sonde à environ un centimètre du bas du bécher.Placez le lysat dans un tube conique métallique et centrifugez-le à 15 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. Filtrez le lysat à l’aide d’un filtre à seringue. Isolez TreT par chromatographie liquide protéique rapide et évaluez la pureté à l’aide de la page FDS.Ensuite, échangez TreT dans le tampon Tris par dialyse pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour former la solution TreT pour la synthèse analogique du tréhalose. Récupérez le blanc du lavage par dialyse. Déterminer la concentration de TreT par spectroscopie UV-vis contre le blanc de dialyse.Pour commencer la synthèse du 6-Azido-tréhalose à l’aide de TreT sur une échelle de 20 à 30 milligrammes, placez 0,08 millimole de 6-Azido-glucose, 0,16 millimole d’UDP-glucose et 0,08 millimole de dichlorure de magnésium dans un tube conique de 15 millimètres. Ajoutez les tampons TreT et Tris. Diluez le mélange avec un tampon Tris si nécessaire pour obtenir une concentration enzymatique de 300 microgrammes par millilitre dans un volume final de quatre millilitres.Boucher et retourner le tube pour dissoudre les solides. Incuber le mélange réactionnel pendant une heure à 70 degrés Celsius tout en l’agitant à 300 tr/min. Pendant l’incubation, placez trois millilitres d’eau désionisée dans une unité de filtration centrifuge de 10 kilodaltons et centrifugez à 3 000 fois G jusqu’à ce que tout le liquide soit dans le tube.Répétez le lavage deux fois de plus pour assurer un rinçage complet de l’unité de filtration. Lorsque la réaction est terminée, refroidissez le mélange à température ambiante sur de la glace. Transférez ensuite le mélange de produit dans l’unité de filtration centrifuge.Rincez trois fois le tube de réaction avec un millilitre d’eau déminéralisée et transférez chaque rinçage dans l’unité de filtration centrifuge. Centrifugez le mélange à 3 000 fois G jusqu’à ce que tout le liquide soit passé dans le tube. Ajoutez trois millilitres d’eau déminéralisée dans l’unité de filtration et centrifugez-la à nouveau dans les mêmes conditions.Répétez le rinçage au besoin pour maximiser la récupération du produit. Ajoutez trois grammes de résine échangeuse d’ions à lit mixte dans le filtrat. Remuez le mélange avec un bâton d’agitation à température ambiante pendant une heure.Après avoir agité, décantez et filtrez le surnageant. Rincez la résine avec cinq millilitres d’eau déminéralisée et filtrez le rinçage. Répétez l’opération au besoin pour maximiser la récupération du produit et combinez tous les filtrats.Concentrez le filtrat combiné. Ensuite, pour vérifier la présence d’un précurseur de 6-GlcAz n’ayant pas réagi, préparez une plaque de TLC en gel de silice avec des taches de 6-GlcAz, de 6-TreAz, le produit concentré et un co-spot. Développer la plaque avec un mélange de n-butanol, d’éthanol et d’eau déminéralisée.Une fois que la plaque est sèche, visualisez les taches en trempant la plaque dans de l’acide sulfurique à 5 % et de l’éthanol et en chauffant la plaque sur une plaque chauffante à réglage élevé pendant environ cinq minutes. Si l’on observe un précurseur n’ayant pas réagi, purifier le mélange de produit sur une colonne d’exclusion granulométrique et répéter l’analyse CCM. Une fois l’analogue pur du tréhalose obtenu, retirez l’eau pour obtenir le produit 6-TreAz séché.L’enzyme TreT stéréo joint sélectivement l’analogue du glucose et l’UDP-glucose pour former l’analogue du tréhalose correspondant. La portée de la réaction comprend les modifications stéréochimiques désoxyfluoro, thio et azido. Cependant, les substituants en position quatre sur l’anneau sont moins bien tolérés.À l’aide de cette procédure, l’analogue du glucose 6-GlcAz a été converti quantitativement en l’analogue du tréhalose 6-TreAz en moins de 60 minutes, comme l’a confirmé la CCM. Le produit pur a été isolé par la méthode de purification par échange d’ions par dialyse de spin non chromatographique et caractérisé par RMN en HPLC. La solution pure de 6-TreAz a ensuite été utilisée pour effectuer le marquage azoté de la bactérie modèle M. smegmatis.Le marquage ultérieur au fluorophore par une réaction chimique clic avec les azides de surface cellulaire a montré que M. smegmatis avec un transporteur de tréhalose fonctionnel avait été marqué avec succès avec des azides alors que la souche sans ne l’était pas. Une fois maîtrisée, la réaction de catalyse TreT et la purification subséquente peuvent être effectuées en une à quatre heures selon le nombre d’étapes de rinçage utilisées pour maximiser la récupération de la production. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que le produit de réaction doit toujours être analysé par RMN et CCM ou HPLC pour confirmer sa pureté et sa structure.À la suite de cette procédure, l’analogue synthétisé du tréhalose peut être évalué ou utilisé comme sonde d’imagerie bactérienne, traceur métabolique, inhibiteur enzymatique ou agent stabilisateur de biomolécule. Cette méthode permet aux chercheurs de préparer des analogues du tréhalose avec des modifications telles que des marqueurs d’isotopes stables ou de radio-isotopes. Dans l’ensemble, les composés accessibles par cette méthode devraient être utiles dans la recherche sur la tuberculose et dans d’autres domaines de recherche biomédicale.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer et de purifier l’enzyme TreT, d’utiliser TreT pour synthétiser des analogues du tréhalose en une seule étape et de purifier les produits analogues du tréhalose.

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Rapid One-step Synthèse enzymatique et All-aqueuse Purification de tréhalose Analogues

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