Name: Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Apprenez à manipuler la ploïdie chez les embryons de zebrafish par choc thermique pour induire une diploïdisation efficace. Cette méthode simple permet l'homozygotie directe et facilite les études génétiques en biologie du développement.

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Ce travail a été soutenu par les subventions R21 HD068949-01 et RO1 GM065303 des NIH.

Toutes les expériences animales ont été réalisées selon l&#39;Université du Wisconsin - Madison et institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Commission (IACUC) des lignes directrices (Université du Wisconsin - Madison Numéro d&#39;assurance A3368-01). 1. Sélection de femelles pour la collecte des oeufs via Mating Interrupted REMARQUE: des protocoles basés sur FIV reposent sur l&#39;extrusion d&#39;oeufs matures à partir des femelles par pression manuelle 9. protocoles précédents ont utilisé des femelles directement à partir de réservoirs ou conjugaisons paire sans les femelles subissant oeuf libération comportement, mais seulement une petite fraction de ces femmes (environ 20% ou moins, en fonction de la ligne de zebrafish) donnent des œufs extrudés et compétents à la pression manuelle. Dans une procédure améliorée, les femelles sont pré-triés pour la ponte des œufs par observation visuelle directe, suivie d&#39;une interruption immédiate de l&#39;accouplement. Cette procédure est très efficace, car presque toutes les femmes pré-sélectionnés par ce rendement de l&#39;étape d&#39;accouplement interrompue oeufs extrudés et compétentssur une pression manuelle. <ol><li> L&#39;après-midi avant l&#39;expérience, mis en place des paires d&#39;accouplement de la souche zebrafish souhaitée dans des boîtes d&#39;accouplement de poisson zèbre standard. Gardez les hommes dans la même chambre que les femelles encore physiquement séparés d&#39;eux, soit par une division de la boîte d&#39;accouplement ou en plaçant le mâle dans un insert de ponte et la femelle à l&#39;intérieur de l&#39;insert. </li><li> Le matin de l&#39;expérience, retirez la partition physique, en plaçant à la fois mâle et femelle dans le même insert de ponte, de sorte que l&#39;accouplement commence. </li><li> Inspecter visuellement les réservoirs contenant des paires d&#39;accouplement pour détecter l&#39;extrusion des œufs lors de l&#39;accouplement naturel. Dès les premiers signes d&#39;extrusions d&#39;œufs, séparés pour les hommes et les femmes d&#39;interrompre la reproduction. Après la séparation des mâles, garder les femelles pré-sélectionnés séparément ou regroupés dans le même réservoir. Utilisez plusieurs femelles en fonction du nombre d&#39;embryons désirés (typiquement 50-150 oeufs / femelle). </li></ol> 2. Préparer une solution de sperme NOTE: FIV rElies sur l&#39;exposition des oeufs matures à une solution de sperme. Cette solution peut être traitée, pour générer des zygotes diploïdes (qui, par traitement MT2 embryons tétraploïdes deviennent) ou UV-traitée, pour générer des zygotes haploïdes (qui, par traitement MT2 deviennent des embryons diploïdes homozygotes). Précédent protocoles de préparation de sperme ont suggéré l&#39;utilisation de tubes capillaires pour recueillir la laitance de la région anale des hommes vivants, mais cela a été un processus inefficace en tant que seule une petite fraction des hommes a abouti à la laitance 9. Le protocole présenté ci-dessous repose plutôt sur la préparation des spermatozoïdes des testicules disséqués cisaillées, ce qui donne des résultats plus fiables. <ol><li> Préparer une solution de Hank à l&#39;avance en tant que solution de prémélange de Hank, comprenant tous les composants (solutions 1, 2, 4 et 5) à l&#39;exception de la solution de bicarbonate de sodium (Solution 6). Préparer une solution fraîche 6 et ajoute au prémélange le matin de l&#39;expérience (tableau 1). Pour faire une solution de Hanks (solution finale, préparer le matin duprocédure de fécondation in vitro), mélanger 990 pi de prémélange de Hank et 10 ul de la solution fraîchement préparée 6. </li><li> Euthanasier mâles par une surexposition au Tricaine comme une solution de 0,016% dans l&#39;eau conditionnée. <ol><li> Préparer tricaïne comme une solution mère de 0,2% dans l&#39;eau (tampon à pH 7,0 avec 1 M Tris pH 9,0) et conserver à 4 ° C. Ajouter 8 ml de solution tricaïne mère par 100 ml d&#39;eau dans un bécher, et d&#39;utiliser un filet pour transférer les mâles à la solution de tricaïne. </li><li> Utiliser l&#39;équivalent des testicules pour un homme par l&#39; embrayage nécessaire pour être fécondé dans un volume de solution de Hank correspond à 100 ul par mâle (par exemple , les testicules de 10 mâles collectés dans 1 ml de solution de Hank, pour fertiliser 10 embrayages avec 100 pl / embrayage). </li><li> Confirmer l&#39;euthanasie par la cessation des mouvements maillants pendant 15 minutes. Après l&#39;euthanasie, retirer les hommes du bêcher avec une cuillère. Rincer les mâles brièvement avec de l&#39;eau conditionnée et les sécher légèrement en les plaçant brièvement plusieurs emplacements d&#39;unessuie-tout. </li></ol></li><li> Pour enlever les testicules, les premiers Décapitez euthanasiés mâles avec des ciseaux de dissection ou une lame de rasoir, et faire une coupe longitudinale le long de l&#39;abdomen avec dissection scissors.Under un microscope à dissection avec une source de lumière réfléchie, retirer les organes internes avec des pinces à dissection. Tirez sur chacune des testicules masses avec des pinces et les placer à l&#39;intérieur du tube de microcentrifugation contenant la solution de Hank. NOTE: Testicules peuvent être identifiés comme chacune des deux structures allongées d&#39;aspect translucide trouvés le long des parois du corps et qui convergent près du cloaque. Testicules peuvent rester 2-3 min sur une surface de la plaque de Pétri après dissection et avant de les placer dans la solution de Hank. </li><li> Relâchez le sperme dans la solution par cisaillement les testicules avec une spatule étroite et / ou légèrement pipetage de haut en bas 5-6 fois les testicules en solution avec une micropipette 1000 ul-pointe, tout en évitant la formation de bulles d&#39;air. Laisser déposer les testicules des débris. </li><li> Conserver la solution de sperme dans la glace, où il peut garder sa puissance jusqu&#39;à 2-3 heures. Si procédant aux UV-traitement de la solution de sperme, transférer la solution dans un tube propre en laissant les morceaux de testicules derrière. </li></ol> 3. Traitement UV REMARQUE: traitement aux UV est utilisé pour réticuler l&#39;ADN des spermatozoïdes afin de le rendre inactif dans l&#39;embryon. Cette étape est uniquement utilisé lors de la production d&#39;embryons diploïdes gynogénétiques haploïdes ou homozygotes gynogénétiques. solution de sperme pour le traitement UV doit être séparé des morceaux de testicules (étape 2.4), comme de gros morceaux peuvent protéger le sperme du traitement UV. <ol><li> Transférer la solution de sperme à un puits sec et propre d&#39;une plaque de verre de dépression assis sur un lit de glace (par exemple glace à l&#39; intérieur d&#39; une boîte de Pétri). Utilisez jusqu&#39;à 1 ml de solution de spermatozoïdes par plaque de verre ainsi. </li><li> Exposer la solution de sperme aux UV en plaçant la plaque de verre creux sur le lit de glace sous une lampe UV. Traiter la solution de sperme pendant 90 secondes avec un 115 V (60 Hz, 0.68A) lampe UV à un 19 cm (7,5 pouces) distance. Avec la fin d&#39;une pointe de pipette, mélanger délicatement la solution toutes les 30 secondes pendant le traitement UV (utiliser une pointe de pipette propre toutes les 30 secondes). </li><li> En utilisant une pointe de pipette propre et micropipette, transférer la solution de sperme traité à un nouveau tube. Stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire pour la FIV (pas plus de 2-3 heures d&#39;extraction). </li></ol> 4. Manuel Extrusion des oeufs d&#39;âge mûr NOTE: Les femelles obtenues par interruption de croisements naturels seront facilement obtenir des œufs sous anesthésie et une pression manuelle. Pendant cette procédure, le traitement tricaïne doit être soigneusement contrôlée pour éviter une surexposition qui peut empêcher la récupération des femelles. <ol><li> Anesthésier femelles par exposition à la lumière à la solution de tricaïne: femelles de transfert avec un filet à Tricaine solution dans l&#39;eau conditionnée (fait en ajoutant 8 ml de Tricaine 0,2% solution mère à 100 ml d&#39;eau de poisson conditionné) pendant environ 2-5 min, jusqu&#39;à l&#39;arrêt de poisson mouvement branchies. </li> &lt;li&gt; Dès qu&#39;une femme arrête le mouvement des branchies, utilisez une cuillère pour recueillir et rincer à l&#39;eau conditionnée brièvement. Toujours à l&#39;aide de la cuillère pour déplacer le poisson, sécher légèrement en le plaçant brièvement et à plusieurs reprises sur plusieurs endroits d&#39;une serviette en papier, puis le transférer à un sèche 10 cm assiette propre, diamètre de Pétri. Approchez le poisson avec la cuillère dans la partie antérieure à la direction postérieure, afin d&#39;éviter d&#39;endommager potentiellement l&#39;opercule des branchies. </li><li> Utilisez des lingettes de laboratoire ou d&#39;un tissu doux pour sécher doucement en outre la zone anale, pour éviter tous les oeufs libérés prématurément étant activé par l&#39;eau. Mouillage les doigts légèrement avec de l&#39;eau (pour éviter de les coller à des écailles de poisson), placez un doigt d&#39;une main sur le dos de la femelle comme support, et avec un doigt de l&#39;autre main applique une légère pression le long de l&#39;abdomen de la femelle jusqu&#39;à ce que les œufs deviennent extrudée. </li><li> Utiliser une spatule étroite pour déplacer les œufs à distance du corps de la femelle. Placez la femelle de retour dans un réservoir avec de l&#39;eau conditionnée pour la récupération. <br/&gt; NOTE: Une fois les œufs sont extrudés tandis que la femelle est couché sur un côté de son corps, elle peut être retournée et le processus est répété sur son autre côté pour obtenir des œufs supplémentaires. Pour assurer la récupération complète de la femelle, appliquer seulement une pression manuelle douce sur l&#39;abdomen, et mener à bien la procédure de branchies arrêt de mouvement pour retourner à l&#39;eau en moins de 2 min. </li><li> Activer (avec exposition à l&#39;eau) et fertiliser (avec addition de sperme de solution) des œufs en même temps et dans les 90 secondes après extrusion (voir section 5). </li></ol> 5. Fécondation In Vitro NOTE: la fécondation Zebrafish dans les croisements naturels est externe, en fonction de la libération et l&#39;activation simultanée par l&#39;eau des oeufs et du sperme lors de l&#39;accouplement. Dans mimétiques de fécondation in vitro de ce processus en exposant les oeufs à une solution de sperme en présence d&#39;eau. Le volume d&#39;eau est initialement faible (1 ml) afin d&#39;accroître la concentration des spermatozoïdes efficace. La liaison par le sperme se produit dans les 15 à 20 secondes 10 &lt;/ Sup&gt;, et le volume d&#39;eau peut alors être augmenté. Chorion levage contribue en outre à la synchronisation à proximité de l&#39;embrayage en limitant la fenêtre de compétence pour la fixation du sperme 11,12. Les embryons ainsi obtenus présentent donc des cycles de division cellulaire largement simultanées au cours des étapes de clivage précoce. <ol><li> Ajouter 100 pi de solution de sperme (correspondant à l&#39;équivalent des testicules de un mâle - voir partie 2) à l&#39;embrayage d&#39;œufs extrudés sur une plaque de Pétri. Remuer doucement la pointe de la pipette utilisée pour ajouter la solution de sperme parmi les oeufs pour mélanger le sperme et les oeufs ensemble, en étant sûr de ne pas soulever la pointe de la surface de la plaque de Pétri pour éviter des dommages aux œufs. </li><li> activer immédiatement les œufs en ajoutant 1 ml de milieu embryonnaire (E3) solution (eau conditionnée est également acceptable comme un substitut à l&#39;E3 dans les parties 5 à 7) et encore les œufs délicatement mélanger et de sperme en remuant doucement avec la pointe de la pipette. Démarrer une minuterie pour amorcer le calendrier par rapport à la fécondation. </li&gt; <li> A 1 mpf dans le volume 1 ml, inonder la plaque avec E3. Avant de continuer, laisser reposer jusqu&#39;à 10-12 mpf pour permettre l&#39;activation de l&#39;œuf, y compris l&#39;expansion de chorion complète. </li></ol> 6. Heat Shock Treatment NOTE: Un choc thermique appliqué dans l&#39;embryon précoce inhibe centriole duplication, ce qui entraîne un complément incomplet de centrioles pour conduire la formation du fuseau au cours du cycle cellulaire ultérieure 2. L&#39;absence de broche dans son tour entraîne l&#39;absence de formation de sillon 13. <ol><li> Après l&#39;expansion des chorions (10-12 mpf), verser les embryons à partir de la plaque de Pétri dans une passoire à thé. Rincer la plaque de Pétri en utilisant une bouteille de lavage avec E3 afin de recueillir tous les embryons restants dans la passoire à thé. </li><li> Placez la passoire à thé avec les embryons à l&#39;intérieur d&#39;un bêcher dans un bain préchauffé avec E3 à 28,5 ° C. Pré-équilibrer le bécher et E3 à la température du bain d&#39;eau, et assurez-vous qu&#39;il ya assez E3 de telle sorte que tous les embryons dans le thécrépine sont exposés au milieu. </li><li> A 22 mpf, retirez la passoire à thé du bain d&#39;eau à 28,5 °, brièvement épongez sur une serviette en papier pour enlever l&#39;excès d&#39;humidité, et le placer dans un bécher E3 préchauffé similaire dans un bain de chaleur à 41,4 ° C. </li><li> A 24 mpf, transférer la passoire à thé de retour à l&#39;E3 dans le bain d&#39;eau à 28,5 ° C après une brève blot. A 29 mpf, utilisez une bouteille de lavage avec E3 pour transférer les embryons de la passoire à thé sur une plaque de 10 cm de Pétri. </li></ol> 7. Sélection des embryons avec un One cycle Cytocinèse Stall <ol><li> Au cours de la mpf période 35-45, sous un microscope binoculaire avec une source de lumière transmise, sélectionner les embryons qui subissent un clivage symétrique dans le stade 2 cellules, et qui sont donc fertilisés. Retirer les embryons qui ne subissent pas de clivage cellulaire. </li><li> Continuer en observant les embryons fécondés, sélectionnés pour la division cellulaire normale au cours du premier cycle cellulaire, et pendant le second cycle cellulaire (50-65 mpf). </li><li> Trier les embryons selon les catégories suivantes (figure 2C): 4 cellules ( &quot;no décrochage&quot;, dans le 2: standard arrangement 2 pour un embryon 4 cellules); 3 cellules ( &quot;décrochage partiel&quot;, dans un aberrants 2 petites cellules: 1 grand arrangement cellulaire); et 2 cellules ( &quot;bloqués&quot;, les embryons présentant un retard de cycle d&#39;une cellule dans un mélange 1: 1 disposition identique à celui d&#39;un embryon de 2 cellules). Trier les embryons bloqués dans une plaque de Pétri frais. NOTE: A ce stade, les embryons dans le 2: 2 arrangement correspondent à ceux qui, au cours du deuxième cycle cellulaire ni blastomère a subi un décrochage de la division cellulaire; embryons dans un aberrants 2 petites cellules: 1 grand arrangement de cellules correspondent à ceux où le choc thermique provoqué un décrochage du cycle cellulaire au cours du deuxième cycle cellulaire dans un blastomère mais pas l&#39;autre; et les embryons &quot;bloqués&quot; dans un mélange 1: 1 disposition correspondent à celles où, au cours du deuxième cycle cellulaire, les deux blastomères ont subi la division cellulaire désiréestalle. les embryons bloqués doivent reprendre le clivage cellulaire pendant la période du cycle cellulaire suivant (65-80 MPF). L&#39;agencement des blastomères peut être variable, en raison des indices incomplets à partir du cycle de la cellule précédente pour stabiliser la broche 2,14, mais la plupart des embryons formera une blastula relativement normale qui peut subir un développement normal. </li><li> Permettre aux embryons de se développer dans la boîte de Petri, avec une limite de 80 embryons par 10 cm plaque. À 24 HPF, observer les embryons afin de déterminer si elles ont une morphologie caractéristique normale des embryons diploïdes diploïde homozygote ou 6 (mesure normale du prolongement de l&#39; axe (figure 3A, 3C)), par opposition à l&#39; extension axiale réduite et une plus grande épaisseur de corps caractéristique de haploïdes (figure 3B)), et / ou évaluer diploïdisation en utilisant des marqueurs génétiques de pigment à 36 FPM, comme d&#39; or ou albinos et d&#39; autres dosages (figure 3 et ci-dessous) 2,6,9. </li&gt; <li> Retirez tous les embryons qui semblent avoir une morphologie haploïde, ou qui ont lysées ou présentent d&#39;autres défauts grossièrement anormaux. NOTE: Si vous le souhaitez, laisser les embryons se développer jusqu&#39;à 5 jours après la fécondation, tout en continuant à éliminer les embryons lysées ou grossièrement anormales sur une base quotidienne et en ajoutant frais E3 pour rafraîchir le milieu. NOTE: Survivre embryons peuvent également être cultivées après inflation vessie natatoire au jour 5 en transférant à un système d&#39;écloserie et d&#39;alimentation dans des conditions standard. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les étapes critiques Il est essentiel de travailler dans des conditions d&#39;efficacité dans la fécondation in vitro. Pour assurer un bon approvisionnement d&#39;oeufs matures (étape 1), les femelles mis en place pour l&#39;accouplement ne doivent pas avoir été mis en place dans les croisements d&#39;accouplement pendant au moins 5 jours et devrait apparaître gravide. Pendant l&#39;interruption de la reproduction, un observateur peut surveiller 15-30 réservoirs de manière adéquate pour la prem...

Ce protocole permet la manipulation des embryons de poisson zèbre dans la ploïdie, tels que la génération de diploïdes gynogénétiques homozygotes à partir haploïdes gynogénétiques (figure 1) ou la production de tétraploïdes. Ceci est réalisé en induisant un retard dans la cytocinèse correspondant exactement à un cycle cellulaire (figure 2A, 2B). Le retard touche un cycle cytokinèse est obtenu par le traitement par choc thermique. Le protocole standard de choc thermique (HS) tel que décrit à l&#39; origine par Streisinger et ses collègues impliqués une impulsion de température au cours de la période mpf 13-15, résultant en une un cycle de la division cellulaire décrochage au cours du premier cycle cellulaire 1. L&#39;efficacité de ce protocole a été récemment améliorée par balayage des cycles cellulaires début d&#39;une fenêtre temporelle de glissement du traitement par choc thermique. Cette analyse a identifié un point de temps plus tard pour un choc thermique, toujours dans le premier cycle cellulaire (22-24 mpf), qui se traduit par un taux de embr supérieuryos avec un cycle de division cellulaire décrochage, qui dans ce cas affecte le second cycle cellulaire 2. L&#39;observation selon laquelle des manipulations expérimentales pendant le premier cycle cellulaire interfèrent avec la division cellulaire au cours du deuxième cycle cellulaire et provoquer la duplication de l&#39; ADN contenu a également été rapporté dans d&#39; autres espèces de poisson 3,4. Nous nous référons à ce protocole modifié comme Heat Shock 2 (HS2 - le terme «2» signifie que l&#39;impulsion de chaleur se produit à un moment ultérieur de la méthode de HS standard, et que le retard du cycle cellulaire causé par HS2 se produit au cours du deuxième cycle cellulaire ). Ces études ont montré que la base de la cytokinèse arrestation après un choc thermique est l&#39;inhibition de la duplication centriole pendant l&#39;impulsion de chaleur, ce qui affecte la formation du fuseau et de l&#39;induction sillon dans le cycle cellulaire suivant. Résultats HS2 des rendements de l&#39; arrêt du cycle cellulaire approchant les 100%, et les taux de ploïdie duplication jusqu&#39;à 4 fois plus élevé que la norme HS 2. wit Embryons traitésha choc thermique au cours blastomère cycle cellulaire présentent de nombreux effets délétères, ce qui suggère que le choc thermique affecte plusieurs processus nécessaires à la division cellulaire 2. D&#39;autre part, si le choc thermique est appliqué avant le début du cycle cellulaire (période de temps 0-30 mpf), il semble avoir des effets cohérents avec l&#39; interférence spécifique avec la duplication centriole et ne semble pas affecter d&#39; autres processus cellulaires essentiels 2 . Ces études ont montré que le temps avant le début de la division blastomère semble être une période de développement prête à l&#39;utilisation de choc thermique comme un outil pour manipuler spécifiquement ploïdie par inhibition centriole. La cause sous - jacente de la sélectivité apparente pour le choc thermique sur la duplication centriole est inconnue, mais peut être liée à une dégradation sélective des structures centrosome observées sous contrainte thermique dans certains types de cellules, telles que les leucocytes 5. synchronisation temporelle de l&#39;embryon dedéveloppement est réalisé par la fécondation in vitro (FIV). Utilisation du sperme non traité au cours des résultats de fécondation chez les embryons diploïdes que lors de HS2-induits d&#39;un cycle cytokinesis décrochage se tétraploïde. Utilisation des traités-UV sperme, qui porte réticulations qui inactivent son ADN, les résultats dans les embryons haploïdes gynogénétiques 6, qui , après HSII induite par un cycle cytokinesis décrochage devenir diploïdes gynogénétiques 2. En raison de la duplication du génome entier résultant, ce dernier diploïdes gynogénétiques sont homozygotes à chaque locus unique à travers le génome. Pour la concision, nous nous référons à gynogénétiques embryons haploïdes comme «haploïdes», et les embryons diploïdes homozygotes gynogénétiques que &quot;diploïdes homozygotes&quot;. Si viables et fertiles, les diploïdes homozygotes peuvent être utilisés pour initier des lignes stériles et létaux-libre. homozygotie directe induite par HS2 devrait également être facilement incorporé dans l&#39;analyse génétique ou écrans génétiques, depuis diploïdes homozygotes des femelles qui sont porteurs hétérozygotes de mutations taux d&#39;exposition de homozygotie à (50%) 2 ratios élevés et fixes. Le protocole suivant décrit les étapes à effectuer HS2 et induire la duplication ploïdie en pleine homozygotie. Pour la production tétraploïde, solution de sperme doit être traitée. Pour la production diploïdes homozygotes, le sperme doit être inactivé par traitement UV. En outre, comme il est décrit dans l&#39;analyse, des marqueurs de pigment visible peuvent également être utilisés pour faciliter l&#39;identification des diploïdes homozygotes. Compagnon Zebrafish principalement durant les 3 premières heures de l&#39;ouverture de leur cycle de lumière 7, et les deux adultes et les œufs sont sensibles aux rythmes circadiens 8, donc pour obtenir les meilleurs résultats de la procédure de FIV devrait avoir lieu dans cette période de temps.

<table><tbody><tr><td>Boîtes d’accouplement pour poissons-zèbres</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaïne-D (MS 222)</td><td>Approuvé par la FDA (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>pour préparer 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>pour préparer 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Filet de pêche (maille fine) (4-5 in)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>disponible dans ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Cuillère</td><td></td><td></td> en plastique <td>disponible dans la plupart des magasins standard</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Outils de science fine</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>disponible à partir de Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Stéréoscope de dissection (avec source de lumière transmise)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Source de lumière réfléchissante (bras LED)</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Plaques de Petri de 10 cm de diamètre</td><td></td><td></td><td>n’importe quel fabricant</td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf 1,5 ml</td><td></td><td></td><td>n’importe quel fabricant</td></tr><tr><td>Seau</td><td></td><td></td> <td>à glacetout fabricant</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>tout fabricant</td></tr><tr><td>Pointes de pipette 1 000 & micro ; </td><td></td><td></td> l <td>n’importe quel fabricant</td></tr><tr><td>Spatule étroite</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Plaque en verre Dépression</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (Fisher cat. N° 13-748B)</td><td>disponible chez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>UVP</td><td>Modèle XX-15 (N° de cat. UVP18006201)</td><td>disponible auprès de Fisher Scientific. Bien que nous ne l’ayons pas observé avec ce modèle, on a observé que certaines sources UV subissent une diminution de leur intensité au fil du temps (si c’est le cas, voir Modifications et dépannage)</td></tr><tr><td>Lunettes</td><td></td><td></td> UV <td>n’importe quel fabricant</td></tr><tr><td>Essuie-tout</td><td></td><td></td><td>fabricant</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>disponible chez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chronomètre</td><td></td><td></td><td>n’importe quel fabricant</td></tr><tr><td>Flacon toilette</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>disponible chez Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Passoire</td><td></td><td></td><td>à thé disponible dans les magasins de cuisine</td></tr><tr><td>Béchers, 250 ml (2)</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>disponible auprès du</td></tr><tr><td>bain-marie Fisher Scientific (2)</td><td></td><td></td><td>n’importe quel fabricant, avec précision à 0,1 °C (par ex. Shel Lab H2O Bath Series)</td></tr><tr><td>Hanks' Solution 1</td><td>voir ci-dessus</td><td></td><td>8,0 g de NaCl, 0,4 g de KCl dans 100 ml de ddH2O. Conserver à 4°C.</td></tr><tr><td>Celui de Hanks Solution 2</td><td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td>0,358 g de Na2HPO4, 0,6 g de KH2PO4 dans 100 ml de jj2O. Conserver à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Celui de Hanks Solution 4</td><td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td>0,72 g de CaCl2 dans 50 ml de ddH2O. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Hank’s Premix</td><td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td>ajouter, dans l’ordre suivant : 10,0 ml Solution 1 ; &nbsp ; 1,0 ml Solution 2 ; &nbsp ; 1,0 ml Solution 4 ; &nbsp ; 86,0 ml de ddH2O ; &nbsp ; 1,0 ml Solution 5. Conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hanks Solution 6</td><td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td>0,33 g de NaHCO3 dans 10 ml de ddH2O. Préparez frais le matin de la procédure de FIV.</td></tr><tr><td>La solution de Hank (solution finale)</td><td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td>Combiner 990 &mu ; l de Hank' s Premix et 10 &mu ; l de la solution 6 fraîchement préparée (solution NaHCO3)</td></tr></tbody></table>

manipulation ploïdie de zebrafish embryons avec heat shock treatment 2

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation de ploïdie permet de transformations utiles, telles que les diploïdes à tétraploïdes ou haploïdes à diploïdes. Dans le Danio rerio zebrafish, en particulier la génération de diploïdes homozygotes gynogénétiques est utile dans l&#39; analyse génétique , car elle permet la production directe d&#39;homozygotes à partir d&#39; une seule mère hétérozygote. Cet article décrit un protocole modifié pour ploïdie duplication basée sur une impulsion de chaleur au cours du premier cycle cellulaire, Heat Shock 2 (HS2). Grâce à l&#39;inhibition de la duplication centriole, cette méthode se traduit par une division cellulaire précise décrochage au cours du deuxième cycle cellulaire. La précision d&#39;un cycle de division décrochage, couplé à pas affecté duplication d&#39;ADN, se traduit par la duplication du génome entier. Protocoles associés à cette méthode comprennent l&#39; oeuf et la collecte de sperme, traitement UV des spermatozoïdes, la fécondation in vitro et le pouls de la chaleur pour provoquer une division d&#39; une cellule de cycle retard et la duplication ploïdie. Une version modifiée de ce protocole peut être appliquépour induire des changements de ploïdie chez d&#39;autres espèces animales.

En dépit de l&#39;une des cellules cytokinèse du cycle de décrochage, la replication de l&#39; ADN se produit normalement dans ces embryons, ce qui entraîne la duplication du contenu d&#39;ADN de l&#39;embryon (figure 1). Le protocole Streisinger Heat Shock (standard HS) implique une impulsion de chaleur au cours de la période 13-15 minutes après la fécondation (MPF) et induit principalement cytokinesis arrestation au cours de la première division cellulaire embryonnaire...

Un protocole modifié pour la manipulation ploïdie utilise un choc thermique pour induire un décrochage d&#39;un cycle cytokinèse dans l&#39;embryon précoce. Ce protocole est mise en évidence chez le poisson zèbre, mais il peut être applicable à d&#39;autres espèces.

Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

L'objectif général de cette procédure est de favoriser la diploïdisation dans l'embryon de poisson zèbre précoce en inhibant la cytocinèse correspondant à un cycle cellulaire embryonnaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique, par exemple en identifiant les gènes impliqués dans des caractères adultes ou reproducteurs, en générant des lignées consanguines ou en réalisant d'autres manipulations génétiques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est simple tout en étant efficace pour promouvoir la diploïdisation, permettant ainsi l'obtention directe de l'homozygotie des allèles présents chez un individu hétérozygote unique.La veille de l'expérience, installer des couples d'accouplement de la souche de zebrafish souhaitée dans des boîtes d'accouplement standard pour zebrafish, munies de séparateurs afin de distinguer les mâles des femelles. Le matin de l'expérience, retirer la cloison physique pour permettre la ponte. Examiner visuellement les aquariums contenant les couples d'accouplement afin de détecter l'expulsion des œufs lors de l'accouplement naturel.Aux premiers signes d'expulsion des œufs, séparer le mâle et la

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Research

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

C'est une méthode pour générer des embryons de poisson zèbre gynogénétiques diploïde (embryons dont la seule contribution génétique vient de la mère) en bloquant la seconde division méiotique immédiatement après la fécondation avec la lumière ultraviolette inactivé sperme. EP embryons ne sont pas entièrement homozygotes due à la recombinaison lors de la première division méiotique, cependant elles sont homozygotes à tous les loci qui n'ont pas été séparés de leur centromère par recombinaison.

Faire Zebrafish diploïdes gynogénétiques par Pression Early

Ici, nous rapportons un protocole pour mesurer le stress oxydatif chez les embryons de poisson-zèbre vivants. Cette procédure permet de détecter les espèces réactives de l’oxygène (ROS) à la fois dans les tissus embryonnaires entiers et dans les populations unicellulaires. Ce protocole permettra d’effectuer des analyses qualitatives et quantitatives.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

Le poisson-zèbre est un système modèle puissant pour la biologie du développement et la recherche sur les maladies humaines en raison de sa similitude génétique avec les vertébrés supérieurs. Ce protocole décrit une méthodologie permettant de créer des embryons de poisson-zèbre haploïde qui peuvent être utilisés pour des stratégies de dépistage avancé afin d’identifier les mutations récessives dans les gènes essentiels à l’embryogenèse précoce.

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

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Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

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Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

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Ce protocole décrit comment effectuer une édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM pour construire un modèle précis de maladie du poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e.

Édition de base efficace sans PAM pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zSpRY-ABE8e

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Apprenez à manipuler la ploïdie chez les embryons de zebrafish par choc thermique pour induire une diploïdisation efficace. Cette méthode simple permet l'homozygotie directe et facilite les études génétiques en biologie du développement.

Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2

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