Développement d'un plus sensible et spécifique chromogénique Agar moyen pour la détection de Vibrio parahaemolyticus Et autres Vibrio espèces

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la sensibilité et la spécificité d’un nouveau milieu chromogène pour la capacité de détecter et d’isoler Vibrio parahaemolyticus par rapport aux milieux conventionnels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie alimentaire et environnementale, telles que quelle est la prévalence des espèces de Vibrio dans les environnements alimentaires et de récolte ? Le principal avantage de notre procédure est que de nombreux isolats bactériens peuvent être utilisés, y compris en présence d’une matrice alimentaire.

Avant de cultiver les bactéries, autoclavez tout le milieu gélosée. Ensuite, refroidissez la gélose à 45 à 50 degrés Celsius au bain-marie. Lorsque la gélose est prête, disposez les plaques de Pétri vides en piles de cinq à six plaques.

Ensuite, en partant du bas de la pile, versez l’agar fondu dans chaque assiette jusqu’à ce qu’elle soit à moitié pleine, en replaçant les couvercles après avoir versé. Laissez la gélose se solidifier à température ambiante pendant au moins 12 heures. Pour mettre en place les cultures de souches microbiennes, lorsque la gélose est prête, utilisez une boucle d’inoculation stérile pour transférer les cultures sur les plaques de gélose non sélectives appropriées, en striant les bactéries de manière à permettre l’observation de colonies isolées.

Lorsque toutes les colonies ont été placées, incubez les cultures à l’envers à une température de 35 à 37 degrés Celsius pendant une période pouvant aller jusqu’à 48 heures, à l’exception des espèces de Campylobacter, qui doivent être incubées dans un bocal à couvercle fermé contenant une poche de gaz pour produire un environnement microaérophile. Observer la morphologie de la colonie à la fin de l’incubation. Les cultures pures devraient produire des colonies qui présentent une morphologie de colonie similaire.

Pour faire pousser les colonies d’intérêt sur des milieux sélectifs et différentiels, transférez quelques colonies isolées dans cinq millilitres de bouillon approprié et réincubatez les cultures à 35 à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Le lendemain, étalez une boucle de cultures de nuit sur au moins une plaque de gélose au thiosulfate-citrate-sels biliaires-saccharose, ou TCBS, et au moins une plaque de gélose chromogène pour un maximum de 96 heures d’incubation à 35 à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, examinez à la fois la densité de culture sur la plaque et la taille des colonies isolées pour déterminer la croissance globale des souches, en notant la couleur des colonies sous la lumière ambiante ou UV, selon le cas, et en notant toute autre caractéristique importante des colonies.

Pour effectuer un test de récupération, inoculez de jeunes cultures de Vibrio parahaemolyticus dans cinq millilitres de bouillon de soja tryptique, complété par deux pour cent de chlorure de sodium, ou TSBS, et placez les tubes à 35 à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Le lendemain, vortex les cultures de nuit et installez une fois 10 puissance moins un, puis une fois 10 puissance moins sept dilutions des bactéries dans le PBS. En utilisant les dilutions un fois 10 puissance moins quatre à une fois 10 puissance moins sept, plaquez uniformément 100 microlitres de chaque dilution sur des plaques individuelles de gélose de soja chromogénique, TCBS et tryptique complétée par deux pour cent de gélose au chlorure de sodium, ou TSAS.

Incuber toutes les plaques à une température de 35 à 37 degrés Celsius pendant une période allant jusqu’à 96 heures. Comptez ensuite les colonies, en ignorant les plaques portant des colonies trop nombreuses pour être comptées ou contenant moins de 25 colonies. Pour effectuer un essai de compétition, sélectionnez une souche de V. Parahaemolyticus qui produit les colonies turqouises attendues sur le TCBS et les colonies cyan sur la gélose chromogène, et une non-V.

Espèce de Parahaemolytius qui ne pousse sur aucun des milieux ou qui présente une couleur de colonie différente. Transférez quelques colonies isolées de V. Parahaemolyticus et V. Metschnikovii d’une agriculture TSAS, à cinq millilitres de TSBS pour une incubation de 16 à 24 heures à 35 à 37 degrés Celsius. Transférez quelques colonies isolées de Shigella sonnei de gélose Brain Heart, ou BHI, dans cinq millilitres de bouillon BHI pendant 16 à 24 heures à 35 à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, effectuez une dilution en série pour chaque souche, en plaçant les dilutions sur des plaques de gélose non sélectives pour déterminer les unités formant des colonies par millilitre des cultures de nuit. Ensuite, utilisez les cultures de nuit et les tubes de dilution pour mélanger différents volumes d’une souche de V. Parahaemolyticus et d’une souche non-V. Parahaemolyticus et d’étaler 100 microlitres du mélange bactérien sur des plaques individuelles de gélose chromogénique, TCBS et TSAS.

Après une période allant jusqu’à 96 heures à une température de 35 à 37 degrés Celsius, comptez les colonies en fonction de leurs différences de croissance et de morphologie sur les plaques chromogènes et TCBS. Pour évaluer les effets des homogénats d’huîtres sur la croissance bactérienne sur des milieux sélectifs et différentiels, pesez d’abord au moins 50 grammes de chair d’huître provenant d’au moins 12 mollusques, y compris la chair et la liqueur. Ajoutez ensuite une masse égale de PBS aux tissus d’huîtres et mélangez le mélange à grande vitesse pendant 90 secondes.

Ensuite, ajoutez 100 grammes d’homogénat d’huître dilué à 400 grammes de PBS et mélangez le mélange à grande vitesse pendant une minute. Ensuite, autoclavez l’homogénat. Après refroidissement, ajoutez 100 microlitres de chaque nuit V.Parahaemolyticus et non-V.

Parahaemolyticus cultive jusqu’à la boue d’huîtres et utilise un homogénéisateur pour mélanger les cellules bactériennes avec l’homogénat d’huîtres. Faire une fois 10 puissance moins une à une fois 10 puissance moins trois dilutions de l’homogénat d’huître enrichi dans le PBS comme démontré, en étalant 100 microlitres de chaque dilution sur des plaques chromogènes, TCBS et TSAS individuelles. Après 96 heures à une température de 35 à 37 degrés Celsius, comparez le nombre réel de colonies sur les gélose chromogène et TCBS avec le nombre de colonies attendu déduit du nombre standard sur plaque effectué sur les cultures pendant la nuit.

Pour déterminer la croissance et la morphologie des colonies des souches utilisées dans cette étude, les bactéries ont été cultivées sur des milieux sélectifs et différentiels. Le TCBS est le milieu conventionnel utilisé pour l’isolement de certaines espèces de Vibrio, notamment le V. Parahaemolyticus turquoise et le V. Cholerae jaune. L’utilisation d’un milieu chromogène pour sélectionner des espèces de Vibrio cliniquement pertinentes à partir d’échantillons alimentaires et environnementaux permet de générer des V. Parahaemolyticus cyan et des V. Cholerae magenta.

Les colonies de V. Parahaemolyticus cultivées sur des plaques de gélose chromogène en présence d’un homogénat d’huître sont observées en nombre similaire à celles sur des milieux non sélectifs, ce qui suggère que la limite de détection du milieu chromogène est similaire à celle des milieux non sélectifs, même en présence d’une matrice alimentaire. La croissance et la récupération de V. Parahaemolyticus ne sont pas non plus affectées par la présence d’un non-V. Espèces de Parahaemolyticus, un attribut essentiel pour les milieux différentiels et sélectifs, car les échantillons environnementaux contiennent diverses espèces de Vibrio en grand nombre, surtout après une procédure d’enrichissement.

De plus, la comparaison du TCBS et des gélose chromogènes par PCR d’hémolysine thermolabile révèle une sensibilité et une spécificité plus élevées pour la gélose chromogène, indiquant une meilleure performance globale pour ce milieu différentiel et sélectif pour la détection et l’identification de V. Parahaemolyticus. Une fois maîtrisée, l’ensemble de la procédure, y compris les tests et les temps d’incubation d’environ 50 souches, peut être terminée en 30 jours lorsqu’elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’étiqueter diligemment toutes les cultures et d’utiliser une technique aseptique en tout temps.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme la PCR de colonie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que : cet isolat spécifique porte-t-il un gène de virulence ? Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la sécurité alimentaire et de la santé publique pour explorer la détection des espèces de Vibrio dans les crustacés et l’environnement estuarien. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une numération sur plaque standard et d’évaluer la sensibilité, la spécificité et la limite de détection d’un milieu de croissance.

N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes et des milieux chauds peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de vêtements de protection, la couverture des plaies ouvertes et la séparation des déchets biologiques dangereux doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.