Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir simultanément des mesures en temps réel des taux myocardiques d'oxydation du glucose et d'oxydation des acides gras, ainsi que de la fonction contractile cardiaque, chez un cœur de rat isolé en mode de travail. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiovasculaire, telles que la manière dont le cœur s'adapte métaboliquement à des changements aigus des besoins énergétiques et comment ces réponses sont modifiées dans des conditions pathologiques.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre à l'expérimentateur un contrôle total sur les variables environnementales telles que la nature et les concentrations des substrats, des médicaments ou des hormones administrés au cœur. La plus concernée serait Bhavisha Bakrania, une boursière postdoctorale du centre de ressources cardiovasculaires Reno du centre médical de l'Université du Mississippi. Pour commencer, mettez en marche la pompe afin de purger l'appareil de perfusion et d'oxygéner le tampon.

Après avoir préparé les matériaux, anesthésiez un rat et préparez-le pour la chirurgie. Rasez l'abdomen et pratiquez une incision médiane avec extension latérale. Déplacez l'estomac et l'intestin pour accéder à la veine cave inférieure et injectez 200 unités USP d'héparine.

Attendre cinq à dix secondes, puis, à l’aide de ciseaux, couper le diaphragme et les côtés de la cage thoracique afin d’exposer le contenu de la cavité thoracique. Ensuite, saisir délicatement le cœur à la main et exciser ensemble le cœur et les poumons. Sectionner au niveau de l’aorte descendante, en prenant soin de ne pas endommager l’arc aortique et l’aorte ascendante au cours de cette manipulation.

Transférez immédiatement le cœur et les poumons dans une boîte de dissection remplie de tampon KH glacé. Une fois que le cœur a cessé de battre, apprenez à travailler rapidement afin qu'il puisse être redémarré en une ou deux minutes. Immergez maintenant le cœur et les poumons dans une nouvelle boîte contenant du tampon KH glacé.

Retirez rapidement les grosses pièces de tissu pulmonaire, puis sectionnez l'aorte descendante juste au-dessus de l'arc aortique. Pour les étapes suivantes, prenez les précautions nécessaires lors de l'utilisation de substances radioactives. Ensuite, à l'aide de pinces, ouvrez délicatement l'aorte et faites glisser le cœur vers le haut sur la canule.

Soit très prudent de ne pas obstruer l'artère aorte avec une canule, car cela pourrait provoquer une hypoperfusion du cœur et des lésions des valves aortiques. Maintenant, fixez la jonction à l’aide d’un clip microchirurgical et commencez la perfusion de Langendorff du cœur. Sans précipitation, fixez l’aorte à la canule aortique à l’aide d’un fil de soie 3/0 et retirez le clip microchirurgical.

Ensuite, localisez la veine pulmonaire et retirez les tissus non cardiaques selon les besoins. Laissez suffisamment de tissu pour fixer l'oreillette gauche à la canule. La canulation de l'oreillette gauche est la deuxième étape la plus critique du protocole, car une insertion incorrecte de la canule ou la présence d'une fuite affaiblirait les contractions et compromettrait la quantification des taux métaboliques.

Ensuite, préparez la canule de la ligne auriculaire gauche, comme effectué pour la canule droite. Puis, à l’aide de la pince, saisissez délicatement l’ouverture de la veine pulmonaire et faites glisser le cœur vers le haut sur la canule auriculaire. Déplacez les tissus selon les besoins sans fléchir l’aorte ni trop tendre le cœur.

Ensuite, fixez la canule avec un fil de soie 3 0. Enfin, ouvrez la ligne atriale tout en basculant simultanément la ligne aortique en mode de fonctionnement. Si du tampon s'échappe par l'oreillette gauche, fermez la ligne atriale et revenez au mode Langendorff.

Ensuite, utilisez davantage de points de suture pour fixer plus solidement la canule et essayez de repasser en mode de fonctionnement. Si l'expérience comprend une mesure directe de la fonction du VG à l'aide d'un cathéter, commencez par piquer l'apex du VG à l'aide d'une aiguille de calibre 26, introduisez un cathéter pression-volume et alignez la tige avec l'axe longitudinal du VG. Positionnez ensuite l'électrode distale E1 juste en dessous de la valve aortique, adjacente à la limite endocardique, et placez l'électrode proximale E4 juste à l'intérieur de la paroi ventriculaire.

Scellez maintenant le cœur dans une chambre à double enveloppe contenant de l'eau. Ensuite, commencez à surveiller les paramètres fonctionnels dans le logiciel. Une fois que les paramètres de base sont stables depuis au moins cinq minutes, commencez l'enregistrement des données.

Pour mesurer le débit coronaire, enregistrez le temps nécessaire pour recueillir 20 millilitres d'effluent. Ensuite, prélevez deux millilitres de l'effluent dans une seringue à l'aide du robinet en té et jetez le reste. Transférez immédiatement l'échantillon de deux millilitres dans un tube de microcentrifugeuse et prélevez une aliquote d'un demi-millilitre pour déterminer le taux d'oxydation du glucose.

Conserver le reste sur de la glace. Continuer à prélever périodiquement des échantillons d'effluent coronaire et, avant de terminer, injecter 10 microlitres de solution saline hypertonique dans la ligne atriale, juste avant qu'elle ne soit raccordée à la canule.

Utilisez la réponse à cette bolus pour calculer la conductance parallèle afin de déterminer précisément le volume cardiaque. Ensuite, débouchez la chambre cardiaque et retirez le cathéter du VG. Puis, détachez le cœur des canules et plongez-le dans du tampon KH glacé. Maintenant, séchez rapidement le cœur avec une serviette en papier et mesurez son poids humide.

Une fois pesé, procéder à la dissection des échantillons de tissu requis, puis congeler le tissu restant à l’aide de pinces refroidies à la glace sèche. En préparation, charger des vials en verre de scintillation avec un millilitre d’hydroxyde de hyamine à 10x. En préparer un pour chaque échantillon d’effluent coronaire et deux pour les témoins.

Dès qu'un flacon-échantillon est chargé, le placer directement dans un flacon de scintillation chargé. Pour l'analyse, boucher délicatement le flacon avec un bouchon en manchon de caoutchouc et utiliser du parafilm pour sceller le flacon. Ensuite, à l'aide d'une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille longue de 23 gauge, injecter 200 microlitres d'acide perchlorique à 60 % à travers le manchon de caoutchouc.

Laisser tous les flacons d'échantillons reposer toute la nuit. Le lendemain, retirer délicatement chaque tube d'échantillon à l’aide de pinces et rincer leurs fonds au-dessus des flacons ouverts avec un millilitre de cocktail de scintillation afin de récupérer tout l'hydroxyde de hyamine. Puis ajouter neuf millilitres supplémentaires de cocktail de scintillation dans chaque flacon.

Pour obtenir l'activité spécifique, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de perfusion dans deux des vials. Agitez vigoureusement les vials, puis laissez-les reposer pendant au moins six heures avant de procéder aux mesures. Pour déterminer les taux d'oxydation du palmitate myocardique, préparez d'abord une colonne de résine échangeuse d'anions pour chaque échantillon.

Chargez simplement les embouts de tubes de seringue de trois millilitres avec de la laine de verre. Ajoutez ensuite la suspension aqueuse de résine jusqu'au trait de deux millilitres dans chaque colonne à l'aide d'une pipette de transfert. Lavez ensuite la résine en faisant passer deux millilitres d'eau ultra-pure à travers chaque colonne trois fois.

Ensuite, placer des vials de scintillation sous les colonnes et charger les colonnes avec un demi-millilitre d'effluent coronaire. Pour la mesure du fond, utiliser du tampon de perfusion à la place. Éluer ensuite les colonnes successivement avec un demi-millilitre, un millilitre, et enfin deux millilitres d'eau ultra-pure.

Jetez les colonnes. Ensuite, ajoutez 13 millilitres de cocktail de scintillation dans les vials. Ajoutez 0,5 millilitre de tampon de perfusion directement dans deux vials contenant 13 millilitres de cocktail de scintillation liquide pour la détermination de l'activité spécifique.

Agiter vigoureusement les flacons, les laisser reposer pendant plus de six heures puis effectuer les mesures. Des cœurs ont été isolés à partir de deux rats âgés de 16 semaines et soumis à différentes conditions de stress. Pour un cœur, une augmentation aiguë de la charge de travail a été simulée en augmentant la post-charge de 40 % et en ajoutant de l'épinéphrine au tampon de perfusion.

La fréquence cardiaque a immédiatement augmenté de plus de 50 % suite à l'induction du saut de travail. La puissance cardiaque a augmenté de plus de 40 % lors du saut de travail, ce qui a été accompagné par une augmentation des taux d'oxydation du glucose et de l'oléate. L'augmentation relative par rapport à la ligne de base pour l'oxydation du glucose a été remarquable.

L'autre cœur a subi 15 minutes d'ischémie globale et 30 minutes de reperfusion. Dans ces conditions expérimentales, une pression pulsée proche de la normale a été rétablie quelques minutes après le début de la reperfusion. Dans les 10 minutes, la puissance cardiaque a augmenté rapidement au-dessus des valeurs pré-ischémiques avant de revenir à des valeurs proches de la ligne de base.

Cela résultait d'une oxydation accrue de l'oléate. Alors que l'oxydation du glucose reprenait rapidement son activité pré-ischémique. Une fois maîtrisée, l'isolation du cœur jusqu'à la réperfusion initiale en mode travail peut être effectuée en moins de cinq minutes si elle est réalisée correctement.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que les analyses d'expression d'ARN et de protéines peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'effet d'un médicament ou d'une condition de stress sur les voies de signalisation moléculaire. N'oubliez pas que le travail avec des traceurs radioactifs peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle complets, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.