Name: Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez comment mesurer simultanément l'oxydation du glucose et des acides gras dans le cœur isolé de rat de travail. Cette méthode permet d'évaluer la fonction cardiaque et les adaptations métaboliques en temps réel.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole précédent décrit en détail les méthodes pour quantifier simultanément le flux du substrat à travers l&#39;oxydation du glucose et de l&#39;oxydation des acides gras dans le coeur de rat isolé de travail. Les mesures peuvent ensuite être superposées aux paramètres fonctionnels cardiaques enregistrés pour déterminer la relation entre les substrats du métabolisme et du travail cardiaque sous base et le stress des conditions (changement dans la charge de travail, l&#39; ischémie-reperfusion, etc ...). ...

Pertinence clinique Au coeur des mammifères, il existe une forte relation positive entre le flux de substrats par les voies métaboliques oxydatives, la génération d&#39; ATP et le travail cardiaque 1. Au cours des deux dernières décennies, l&#39;enquête sur le lien complexe entre le métabolisme et la fonction cardiaque a conduit à reconnaître que des altérations du métabolisme cardiaque sont une cause de dysfonctionnement contractile et le remodelage structurel éventuellement pathologique dans le cadre de différents types de maladies cardiaques 2-4. Par conséquent, il est prévu que notre compréhension des mécanismes qui régissent le remodelage métabolique du cœur souligné conduira à l&#39;identification de cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement de l&#39; insuffisance cardiaque 5-7. La récente publication d&#39;une déclaration scientifique de l&#39;American Heart Association sur «l&#39;évaluation cardiaque du métabolisme», souligne l&#39;intérêt croissant de la communauté scientifique pour tson domaine de recherche 8. Mais alors que les avancées technologiques en imagerie cardiaque permettent maintenant d&#39;une évaluation rapide et précise de la morphologie et de la fonction cardiaque, l&#39;étude in vivo du métabolisme cardiaque reste limitée et lourde: résonance magnétique (RMN) et nucléaire tomographie par émission de positons (TEP) peut être utilisés pour suivre le métabolisme du phosphate de haute énergie cardiaque et l&#39; activité du cycle de Krebs, mais ces techniques sont en proie à des coûts d&#39;exploitation élevés et par leur incapacité à déterminer la contribution des différents substrats au métabolisme oxydatif dans des conditions stables 9 .Pour cette date , l&#39;ex vivo travail de préparation cardiaque représente la technique seule et unique disponible pour étudier, simultanément et en temps réel, la fonction contractile et flux de substrats dans des voies métaboliques oxydatives 7,9. Le protocole suivant a pour but de fournir des lignes directrices pour la préparation et l&#39;utilisation des réactifs utilisés pour déterminer le rates de substrats utilisation dans le coeur de rat de travail isolé. Le Coeur Appareil Rongeur de travail isolé Bien que la technique est vieille presque un demi-siècle, le travail isolé préparation de coeur de rat reste une méthode de choix pour la recherche cardiovasculaire. Comme pour la préparation cardiaque Langendorff, le cœur de rongeur de travail offre un moyen relativement simple, fiable et peu coûteux pour mesurer une large gamme de paramètres cardiaques, indépendamment des effets de confusion d&#39;autres organes, neurohormonales et d&#39;autres facteurs qui circulent. Mais contrairement au coeur Langendorff perfusé, le cœur de travail continue d&#39;effectuer le travail cardiaque quasi-physiologique, une condition préalable à la génération de flux métabolique oxydative à des niveaux qui sont pertinents pour les conditions in vivo. Ceci est réalisé en fournissant le tampon de perfusion dans le ventricule gauche (VG) par l&#39;intermédiaire d&#39;une canule reliée à l&#39;oreillette gauche, et que le LV se remplit et se contracte, letampon est éjecté à travers la ligne aortique contre une pression hydrostatique de postcharge déterminée. La conception de l&#39;appareil de perfusion décrit initialement par Neely et ses collègues 10 a ensuite été améliorée par Taegtmeyer, Hems et Krebs 11, mais a très peu changé depuis. Comme décrit dans l&#39;appareil d&#39; origine, la fonction contractile peut être évaluée grâce à la détermination du débit cardiaque, sans utiliser des cylindres de plus de diplômés et un chronomètre pour mesurer aortique et coronaire flux 10,11. Plusieurs fournisseurs offrent maintenant des systèmes complets coeur de perfusion de rongeurs de travail. Ces appareils disponibles dans le commerce peut être acquise avec flowprobes, transducteurs de pression, un cathéter pression-volume et tout l&#39;équipement nécessaire à l&#39;acquisition de données fonctionnelle cardiaque et d&#39;analyse. Les vendeurs offrent de nombreuses sessions de documentation et de formation pour familiariser le nouvel utilisateur avec leur équipement. Plusieurs articles de revue également les protocoles de détail sur le instrum travail cardiaqueentation et sur l&#39;utilisation de cathéters pour mesurer la fonction cardiaque chez les rongeurs 12-15. Pour cette raison, nous allons brièvement parler de la mise en place de l&#39;appareil de perfusion et de l&#39;équipement d&#39;enregistrement. Le présent protocole vise plutôt à compléter les informations déjà disponibles avec une description des méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour mesurer simultanément les taux de glucose et de l&#39;oxydation des acides gras à longue chaîne, les deux substrats énergétiques fournissant majeurs dans le cœur normal. Nous décrivons ici toutes les étapes impliquées dans l&#39;utilisation des substrats énergétiques radiomarqués pour l&#39;évaluation du métabolisme oxydatif du myocarde, de la préparation des réactifs et des tampons à la récupération et le traitement des échantillons, à l&#39;analyse des données. Principes de la méthode Cardiomyocytes génèrent la plus grande partie de leur énergie pour la contraction de la phosphorylation oxydative d&#39;acides gras (principalement des acides gras à longue chaîne) et des glucides (glucose et de lactate). Le cœur a très limité des réserves énergétiques et repose sur un approvisionnement constant de ces énergies fournissant des substrats de la circulation. Le catabolisme du glucose par la voie glycolytique donne pyruvate, qui est ensuite décarboxylé par le complexe pyruvate déshydrogénase de la membrane mitochondriale interne. Les acides gras à longue chaîne, extraits de l&#39;albumine circulante ou des triglycérides de lipoprotéines sont d&#39;abord activés dans des molécules d&#39;acyl-CoA dans le cytosol et ensuite transporté à l&#39;intérieur de la matrice mitochondriale par l&#39;intermédiaire de la navette carnitine pour entrer dans la voie bêta-oxydation. Les molécules d&#39;acétyl-CoA produites par le catabolisme du glucose et des acides gras alimentent le cycle de Krebs pour générer les équivalents réducteurs (NADH et FADH 2) qui sont utilisés par la chaîne de transport d&#39;électrons pour créer la force proton motrice à travers la membrane mitochondriale interne et générer l&#39;ATP par l&#39;activité de l&#39;ATP synthase. L&#39;eau et le dioxyde de carbone sont les sous-produits d&#39;extrémité deles réactions enzymatiques qui se déroulent à l&#39;intérieur du cycle de Krebs. La fourniture de 14 C et 3 H- substrats radiomarqués (tels que le glucose 14 C-radiomarquée et l&#39; acide oléique radiomarqué 3 H) au travail cardiaque isolé sera par conséquent conduire à la production de 14 CO 2 et de H 2 O 3 qui peut être quantitativement récupéré de l&#39;effluent coronaire. La collecte de 14 CO 2 est réalisée en maintenant le cœur isolé perfusé dans une chambre étanche et en récupérant immédiatement l&#39;effluent coronaire à sa sortie du coeur. Une petite colonne d&#39;échange d&#39;anions est utilisée pour séparer et récupérer 3 H 2 O dans l&#39;effluent coronaire. La radioactivité des échantillons traités est mesurée avec un compteur à scintillation liquide, et avec la connaissance de l&#39;activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d&#39;acide gras dans laoxydation pathways 16,17.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4*7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8 résine, forme chlorure, 100 - 200 mailles sèches, 500 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1401441</td><td>Cet article peut être remplacé en achetant directement la forme d’hydoxide. (voir référence ci-dessous), mais cela coûtera presque 8 fois plus</td></tr> de <tr><td>résine AG 1-X8, forme hydroxyde, 100 - 200 mailles sèches, 100 g</td><td>de Bio-Rad</td><td>1432445</td><td>L’achat de cet article permet de contourner la conversion de la résine échangeuse d’anions de la forme chlorure à la forme hydroxyde (Voir section 1.2 du protocole)</td></tr><tr><td>Porte-filtre sous vide de microanalyse en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-2</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td>Corrosif. Consultez la fiche signalétique du produit pour la manipulation et le stockage appropriés.</td></tr><tr><td>Tube de dispersion de gaz avec cylindre fritté</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>Probumin Sérum bovin Albumine Sans acides gras, poudre</td><td>EMD Millipore</td><td>820027</td><td>Nous recommandons l’utilisation d’un BSA dégraissé au charbon de bois, car d’autres processus de purification tels que le fractionnement à froid de l’éthanol peuvent laisser des résidus toxiques pour le cœur.</td></tr><tr><td>Oléate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique, [9,10-3H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>Matière radioactive. Suivez les lignes directrices du bureau de radioprotection de votre établissement pour les commandes et les manipulations.</td></tr><tr><td>Tube à membrane de dialyse, 29 mm de diamètre,</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667E</td><td></td>,</tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>G7021</td><td></td></tr>, <tr><td>Glucose, D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>Matière radioactive. Suivez les lignes directrices du bureau de radioprotection de votre établissement pour les commandes et les manipulations.</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td><td></td></tr><tr><td>Hydrate d’inactine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>Substance contrôlée inscrite à l’annexe III de l’USDEA</td></tr><tr><td>3-0 Silk Black Braid</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x Hyamine Hydroxide</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>Hautement toxique et provoque de graves brûlures. Consulter la fiche signalétique du produit pour une manipulation et un stockage appropriés</td></tr><tr><td>Flacons en verre à scintillation de 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25F</td><td>Utiliser des flacons en verre pour la récupération quantitative des 14CO2</td></tr><tr><td>20 ml Flacons à scintillation en PEHD</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23B</td><td>Utiliser des flacons en PEHD pour la récupération quantitative des 3H2O</td></tr><tr><td>Rouge Bouchons à manchon en caoutchouc</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-126DD</td><td>Fit Flacons à scintillation de 20 ml ; Aiguille</td></tr><tr><td>réutilisable BD PrecisionGlide 23G x 40 mm</td><td>BD</td><td>305194</td><td>Permet d’injecter de l’acide perchlorique à travers le bouchon du manchon en caoutchouc du piège CO2</td></tr><tr><td>Acide perchlorique, 60</td><td> %Fisher Scientific</td><td>A228</td><td>Hautement corrosif et peut agir comme un oxydant et/ou provoquer un risque d’explosion. Consulter la fiche signalétique du produit pour une manipulation et un stockage appropriés</td></tr><tr><td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>Laine de verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean Détergent en poudre</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>Pour le nettoyage de la verrerie, des pièces en plastique et des tubes</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme Détergent à énergie enzymatique</td><td>Fisher Scientifique</td><td>16-000-115</td><td>Pour le nettoyage des surfaces « difficiles d’accès » (tubes, verrerie) contaminées par des résidus d’acides gras-BSA</td></tr></tbody></table>

méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Le coeur de mammifère est un grand consommateur d&#39;ATP et nécessite un apport constant de substrats énergétiques pour la contraction. Sans surprise, les altérations du métabolisme du myocarde ont été associés au développement d&#39;un dysfonctionnement contractile et l&#39;insuffisance cardiaque. Par conséquent, démêler le lien entre le métabolisme et la contraction devrait faire la lumière sur certains des mécanismes qui régissent l&#39;adaptation cardiaque ou maladaptation dans les états pathologiques. L&#39;isolement de travail de préparation de coeur de rat peut être utilisé pour suivre simultanément et en temps réel, la fonction contractile cardiaque et le flux d&#39;énergie fournissant des substrats dans des voies métaboliques oxydatives. Le présent protocole vise à fournir une description détaillée des méthodes utilisées dans la préparation et l&#39;utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d&#39;oxydation du glucose et des acides gras, l&#39;énergie principale fournissant des substrats du cœur. Les méthodes utilisées pour l&#39;analyse de l&#39;échantillon et l&#39;interprétation des données sont également discutés.En bref, la technique est basée sur la fourniture de 14 C- glucose radiomarqué et un acide gras à longue chaîne radiomarqué 3 H- à un cœur battant ex vivo par perfusion cristalloïde normothermique. 14 CO 2 et 3 H 2 O, fin des sous - produits de les réactions enzymatiques impliquées dans l&#39;utilisation de ces substrats énergétiques fournissant, sont ensuite quantitativement récupérées à partir de l&#39;effluent coronaire. Avec la connaissance de l&#39;activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d&#39;acide gras dans les voies d&#39;oxydation. la fonction contractile du cœur isolé peut être déterminée en parallèle avec l&#39;appareil d&#39;enregistrement approprié et directement corrélé aux valeurs de flux métaboliques. La technique est très utile pour étudier la relation métabolisme / contraction en réponse à diverses conditions de stress telles que des altérations de pré et après la charge et de l&#39;ischémie, un médicament ou un circulafacteur ting ou après la modification de l&#39;expression d&#39;un produit génique.

Deux expériences représentatives sont décrites dans les figures ci-dessous. Dans les deux cas, le coeur d&#39;un homme âgé de 16 semaines chez le rat Sprague Dawley a été isolé et perfusé dans le mode de fonctionnement avec un tampon KH préparé selon le protocole précédent. Dans chaque expérience, le cœur a été soumis à une condition de stress pour affecter le travail cardiaque. la fonction contractile cardiaque a été évaluée par enregistrement continu de la pression d&#39;impulsion par ...

Le protocole suivant décrit la préparation et l’utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d’oxydation du glucose et des acides gras dans le cœur isolé du rat actif. Les méthodes utilisées pour l’analyse des échantillons et l’interprétation des données sont également abordées.

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir simultanément des mesures en temps réel des taux myocardiques d'oxydation du glucose et d'oxydation des acides gras, ainsi que de la fonction contractile cardiaque, chez un cœur de rat isolé en mode de travail. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiovasculaire, telles que la manière dont le cœur s'adapte métaboliquement à des changements aigus des besoins énergétiques et comment ces réponses sont modifiées dans des conditions pathologiques.Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre à l'expérimentateur un contrôle total sur les variables environnementales telles que la nature et les concentrations des substrats, des médicaments ou des hormones administrés au cœur. La plus concernée serait Bhavisha Bakrania, une boursière postdoctorale du centre de ressources cardiovasculaires Reno du centre médical de l'Université du Mississippi. Pour commencer, mettez en marche la pompe afin de purger l'appareil de perfusion et d'oxygéner le tampon.Après avoir préparé les matériaux, anesthésiez un rat et préparez-le pour la chirurgie. Rasez l'abdomen et pratiquez une incision médiane avec extension latérale. Déplacez l'estomac et l'intestin pour accéder à la veine cave inférieure et injectez 200 unités USP d'héparine.Attendre cinq à dix secondes, puis, à l’aide de ciseaux, couper le diaphragme et les côtés de la cage thoracique afin d’exposer le contenu de la cavité thoracique. Ensuite, saisir délicatement le cœur à la main et exciser ensemble le cœur et les poumons. Sectionner au niveau de l’aorte descendante, en prenant soin de ne pas endommager l’arc aortique et l’aorte ascendante au cours de cette manipulation.Transférez immédiatement le cœur et les poumons dans une boîte de dissection remplie de tampon KH glacé. Une fois que le cœur a cessé de battre, apprenez à travailler rapidement afin qu'il puisse être redémarré en une ou deux minutes. Immergez maintenant le cœur et les poumons dans une nouvelle boîte contenant du tampon KH glacé.Retirez rapidement les grosses pièces de tissu pulmonaire, puis sectionnez l'aorte descendante juste au-dessus de l'arc aortique. Pour les étapes suivantes, prenez les précautions nécessaires lors de l'utilisation de substances radioactives. Ensuite, à l'aide de pinces, ouvrez délicatement l'aorte et faites glisser le cœur vers le haut sur la canule.Soit très prudent de ne pas obstruer l'artère aorte avec une canule, car cela pourrait provoquer une hypoperfusion du cœur et des lésions des valves aortiques. Maintenant, fixez la jonction à l’aide d’un clip microchirurgical et commencez la perfusion de Langendorff du cœur. Sans précipitation, fixez l’aorte à la canule aortique à l’aide d’un fil de soie 3/0 et retirez le clip microchirurgical.Ensuite, localisez la veine pulmonaire et retirez les tissus non cardiaques selon les besoins. Laissez suffisamment de tissu pour fixer l'oreillette gauche à la canule. La canulation de l'oreillette gauche est la deuxième étape la plus critique du protocole, car une insertion incorrecte de la canule ou la présence d'une fuite affaiblirait les contractions et compromettrait la quantification des taux métaboliques.Ensuite, préparez la canule de la ligne auriculaire gauche, comme effectué pour la canule droite. Puis, à l’aide de la pince, saisissez délicatement l’ouverture de la veine pulmonaire et faites glisser le cœur vers le haut sur la canule auriculaire. Déplacez les tissus selon les besoins sans fléchir l’aorte ni trop tendre le cœur.Ensuite, fixez la canule avec un fil de soie 3 0. Enfin, ouvrez la ligne atriale tout en basculant simultanément la ligne aortique en mode de fonctionnement. Si du tampon s'échappe par l'oreillette gauche, fermez la ligne atriale et revenez au mode Langendorff.Ensuite, utilisez davantage de points de suture pour fixer plus solidement la canule et essayez de repasser en mode de fonctionnement. Si l'expérience comprend une mesure directe de la fonction du VG à l'aide d'un cathéter, commencez par piquer l'apex du VG à l'aide d'une aiguille de calibre 26, introduisez un cathéter pression-volume et alignez la tige avec l'axe longitudinal du VG. Positionnez ensuite l'électrode distale E1 juste en dessous de la valve aortique, adjacente à la limite endocardique, et placez l'électrode proximale E4 juste à l'intérieur de la paroi ventriculaire.Scellez maintenant le cœur dans une chambre à double enveloppe contenant de l'eau. Ensuite, commencez à surveiller les paramètres fonctionnels dans le logiciel. Une fois que les paramètres de base sont stables depuis au moins cinq minutes, commencez l'enregistrement des données.Pour mesurer le débit coronaire, enregistrez le temps nécessaire pour recueillir 20 millilitres d'effluent. Ensuite, prélevez deux millilitres de l'effluent dans une seringue à l'aide du robinet en té et jetez le reste. Transférez immédiatement l'échantillon de deux millilitres dans un tube de microcentrifugeuse et prélevez une aliquote d'un demi-millilitre pour déterminer le taux d'oxydation du glucose.Conserver le reste sur de la glace. Continuer à prélever périodiquement des échantillons d'effluent coronaire et, avant de terminer, injecter 10 microlitres de solution saline hypertonique dans la ligne atriale, juste avant qu'elle ne soit raccordée à la canule.Utilisez la réponse à cette bolus pour calculer la conductance parallèle afin de déterminer précisément le volume cardiaque. Ensuite, débouchez la chambre cardiaque et retirez le cathéter du VG. Puis, détachez le cœur des canules et plongez-le dans du tampon KH glacé. Maintenant, séchez rapidement le cœur avec une serviette en papier et mesurez son poids humide.Une fois pesé, procéder à la dissection des échantillons de tissu requis, puis congeler le tissu restant à l’aide de pinces refroidies à la glace sèche. En préparation, charger des vials en verre de scintillation avec un millilitre d’hydroxyde de hyamine à 10x. En préparer un pour chaque échantillon d’effluent coronaire et deux pour les témoins.Dès qu'un flacon-échantillon est chargé, le placer directement dans un flacon de scintillation chargé. Pour l'analyse, boucher délicatement le flacon avec un bouchon en manchon de caoutchouc et utiliser du parafilm pour sceller le flacon. Ensuite, à l'aide d'une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille longue de 23 gauge, injecter 200 microlitres d'acide perchlorique à 60 % à travers le manchon de caoutchouc.Laisser tous les flacons d'échantillons reposer toute la nuit. Le lendemain, retirer délicatement chaque tube d'échantillon à l’aide de pinces et rincer leurs fonds au-dessus des flacons ouverts avec un millilitre de cocktail de scintillation afin de récupérer tout l'hydroxyde de hyamine. Puis ajouter neuf millilitres supplémentaires de cocktail de scintillation dans chaque flacon.Pour obtenir l'activité spécifique, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de perfusion dans deux des vials. Agitez vigoureusement les vials, puis laissez-les reposer pendant au moins six heures avant de procéder aux mesures. Pour déterminer les taux d'oxydation du palmitate myocardique, préparez d'abord une colonne de résine échangeuse d'anions pour chaque échantillon.Chargez simplement les embouts de tubes de seringue de trois millilitres avec de la laine de verre. Ajoutez ensuite la suspension aqueuse de résine jusqu'au trait de deux millilitres dans chaque colonne à l'aide d'une pipette de transfert. Lavez ensuite la résine en faisant passer deux millilitres d'eau ultra-pure à travers chaque colonne trois fois.Ensuite, placer des vials de scintillation sous les colonnes et charger les colonnes avec un demi-millilitre d'effluent coronaire. Pour la mesure du fond, utiliser du tampon de perfusion à la place. Éluer ensuite les colonnes successivement avec un demi-millilitre, un millilitre, et enfin deux millilitres d'eau ultra-pure.Jetez les colonnes. Ensuite, ajoutez 13 millilitres de cocktail de scintillation dans les vials. Ajoutez 0,5 millilitre de tampon de perfusion directement dans deux vials contenant 13 millilitres de cocktail de scintillation liquide pour la détermination de l'activité spécifique.Agiter vigoureusement les flacons, les laisser reposer pendant plus de six heures puis effectuer les mesures. Des cœurs ont été isolés à partir de deux rats âgés de 16 semaines et soumis à différentes conditions de stress. Pour un cœur, une augmentation aiguë de la charge de travail a été simulée en augmentant la post-charge de 40 % et en ajoutant de l'épinéphrine au tampon de perfusion.La fréquence cardiaque a immédiatement augmenté de plus de 50 % suite à l'induction du saut de travail. La puissance cardiaque a augmenté de plus de 40 % lors du saut de travail, ce qui a été accompagné par une augmentation des taux d'oxydation du glucose et de l'oléate. L'augmentation relative par rapport à la ligne de base pour l'oxydation du glucose a été remarquable.L'autre cœur a subi 15 minutes d'ischémie globale et 30 minutes de reperfusion. Dans ces conditions expérimentales, une pression pulsée proche de la normale a été rétablie quelques minutes après le début de la reperfusion. Dans les 10 minutes, la puissance cardiaque a augmenté rapidement au-dessus des valeurs pré-ischémiques avant de revenir à des valeurs proches de la ligne de base.Cela résultait d'une oxydation accrue de l'oléate. Alors que l'oxydation du glucose reprenait rapidement son activité pré-ischémique. Une fois maîtrisée, l'isolation du cœur jusqu'à la réperfusion initiale en mode travail peut être effectuée en moins de cinq minutes si elle est réalisée correctement.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que les analyses d'expression d'ARN et de protéines peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'effet d'un médicament ou d'une condition de stress sur les voies de signalisation moléculaire. N'oubliez pas que le travail avec des traceurs radioactifs peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle complets, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Biology

Biologie

L'objectif est de surveiller l'état redox mitochondrial de coeurs isolés dans le contexte de la précharge physiologique et les pressions postcharge. Un modèle de travail biventriculaire coeur de lapin est présenté. Haute résolution spatio-temporelle imagerie par fluorescence de NADH est utilisée pour surveiller l'état mitochondriale redox de tissu épicardique.

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L’étude du métabolisme devient de plus en plus pertinente pour la recherche immunologique. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les splénocytes de souris et les lymphocytes T et B.

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La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique essentielle responsable de la génération d’énergie dans de nombreux types de cellules, y compris les hépatocytes. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer l’oxydation β des acides gras dans des hépatocytes primaires fraîchement isolés en utilisant de l’acide palmitique marqué 14C.

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Décrit ici est un protocole détaillé pour effectuer un test de stress mitochondrial et un test de taux glycolytique dans des échantillons de tissu rétinien ex vivo à l’aide d’un bioanalyseur commercial.

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Découvrez comment mesurer simultanément l'oxydation du glucose et des acides gras dans le cœur isolé de rat de travail. Cette méthode permet d'évaluer la fonction cardiaque et les adaptations métaboliques en temps réel.

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

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