Une méthode non-invasive et technique non-intensif pour Induction et phénotypage of Experimental pneumonie bactérienne chez les souris

L’objectif global de ce protocole expérimental est de fournir une procédure non invasive et techniquement non intensive pour induire une pneumonie bactérienne chez la souris et la quantification ultérieure de la réponse de défense de l’hôte in vivo dans les poumons. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des maladies infectieuses et de l’immunologie, sur les gènes et les voies moléculaires qui contrôlent la réponse de l’hôte à l’infection. Le principal avantage de cette méthode d’infection pulmonaire est sa simplicité technique.

Ce qui permet même aux laboratoires ayant peu d’expertise dans les procédures pulmonaires d’étudier la réponse immunitaire innée pulmonaire. Dans une installation de niveau de biosécurité deux, décongelez un stock de glycérol de K. pneumoniae et transférez un millilitre de bactéries dans un flacon de culture de 500 millilitres contenant 50 millilitres de bouillon de soja tryptique. Incuber la culture en suspension pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 200 à 225 tr/min.

Le lendemain matin, diluez un à cinq millilitres de la culture bactérienne dans un nouveau flacon contenant 50 millilitres de bouillon de soja tryptique, et incubez la culture, dans l’agitateur, à 37 degrés Celsius pendant 2,5 heures supplémentaires pour obtenir la phase logarithmique. À la fin de la deuxième incubation, transférez un millilitre de bactéries de la deuxième culture dans un tube de 1,5 millilitre pour la centrifugation. Retirez le surnageant sans perturber la palette et remettez doucement les bactéries en suspension dans un millilitre de solution saline stérile pour trois lavages séparés.

Après le troisième lavage, remettez les bactéries en suspension dans un autre millilitre de solution saline stérile et mettez en place des dilutions en série logarithmiques de l’inoculum. Mesurer un millilitre de dilutions de un à 10 et de un à 100 dans des cuvettes jetables, en double, pour déterminer la DO 600 du K.pneumoniae lavé. Une OD600 de 1,0 équivaut à peu près à quatre à sept fois 10 à la huitième UFC par millilitre.

Après avoir calculé la concentration des bactéries dans chaque dilution, remettre en suspension la dose souhaitée d’UFC d’inoculum dans 50 à 60 microlitres de solution saline stérile par animal receveur âgé de huit à 12 semaines. Pour livrer la bactérie aux animaux, prélevez l’inoculum de dosage dans une pointe de pipette P200 et placez la souris anesthésiée en position couchée semi-allongée, suspendue par les incisives maxillaires, à un élastique tendu entre les chevilles d’une planche de plexiglas inclinée. À l’aide d’une paire de pinces émoussées et non striées, tirez doucement la langue sur le côté et déposez la dose dans la cavité buccale de l’animal en prenant soin d’éviter d’induire un traumatisme à la langue ou au pharynx buccal.

En gardant la langue rétractée, occlusez doucement le nez avec un doigt ganté, jusqu’à ce que la maison inspire deux à trois fois. Lorsqu’aucun liquide n’est visible dans la cavité buccale, transférez la souris de la planche d’inoculation à sa cage, en position couchée, pour éviter le blocage des narines pendant que la souris se rétablit. Faites une coupe longitudinale juste en dessous du sternum.

Ensuite, en soulevant le sternum avec une pince, entaillez le diaphragme, permettant au poumon de retomber dans la cavité thoracique. Continuez l’incision à travers la cavité thoracique de chaque côté du système vasculaire et vers le haut à travers le cou. Lorsque la trachée est visible, coupez soigneusement le milieu du cou et poussez le tissu sur les côtés pour éviter d’endommager la vascularisation environnante.

Maintenant, entaillez la trachée à environ un quart de la tête et insérez caudalement une canule attachée à une seringue d’un millilitre préchargée d’un millilitre de PBS dans la trachée. Poussez le volume dans les poumons, lentement, en laissant tous les lobes se gonfler. Ensuite, retirez le volume à l’aide de la seringue et regroupez les lavages collectés dans un tube de 15 millilitres, sur de la glace.

Au point final expérimental approprié, prélevez le sang du ventricule gauche et transférez-le dans un tube hépariné pour éviter la coagulation. Ensuite, récoltez tous les lobes pulmonaires dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de PBS, et la rate dans un tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de PBS. Ensuite, utilisez des homogénéisateurs individuels et jetables par échantillon, pour faire macérer les tissus sur de la glace, puis diluez en série les boues de tissus.

Plaquez les dilutions, en deux fois, sur des côtés séparés d’une seule plaque TSA, et laissez les échantillons sécher, brièvement. Ensuite, inversez les plaques et cultivez les échantillons dans un incubateur statique à 37 degrés Celsius pendant la nuit, en faisant la moyenne des colonies bactériennes des deux côtés de la plaque et de chaque dilution le lendemain matin. À 2000 UFC de K. pneumoniae, les souris commencent généralement à présenter des symptômes cliniques 12 à 24 heures après l’infection.

Dans les 48 à 72 heures, de nombreux animaux présentent des symptômes de maladie et de morbidité qui sont généralement précédés d’une perte de poids moyenne de 20 %. Une dose DL50, cependant, permet de détecter à la fois une survie relativement accrue et une survie diminuée au sein du groupe expérimental, et peut être préférée pour des études à plus long terme. L’infection des voies respiratoires inférieures par K. pneumoniae se caractérise par un afflux robuste de leucocytes dans les voies respiratoires dans les six heures suivant l’infection, qui culmine à 24 heures et est principalement représenté par des neutrophiles.

Les cytokines sont détectables dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire 24 et 48 heures après l’infection par K. pneumoniae, et donnent un aperçu du microenvironnement pulmonaire et de son auto-recrutement immunitaire en réponse à l’invasion bactérienne. La charge bactérienne dans les poumons, le sang et la rate augmente également considérablement entre 24 et 48 heures après l’infection. Une fois maîtrisée, la méthode d’aspiration oropharyngée de l’infection pulmonaire peut être effectuée en seulement une à deux minutes par souris si elle est effectuée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas utiliser un volume d’aspiration excessif. Un volume de 50 à 60 microlitres fonctionne généralement bien pour une souris de huit à 12 semaines. À la suite de cette procédure, diverses méthodes peuvent être appliquées sur les poumons et les tissus périphériques pour permettre la quantification de la réponse immunitaire dans l’élimination des agents pathogènes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire une pneumonie bactérienne expérimentale via l’administration d’agents pathogènes oropharyngés et de déterminer la charge pathogène chez la souris. N’oubliez pas que travailler avec des microbes peut être dangereux et que les précautions et pratiques de base BSL-2 doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.