Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

L’objectif global de ce protocole de capture d’affinité est d’isoler des complexes protéiques endogènes à partir de cellules de mammifères. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire et moléculaire, telles que les protéines qui se forment ensemble en modules fonctionnels physiquement liés. Le principal avantage de cette technique est que de nombreuses interactions physiques associées à la protéine cible d’intérêt peuvent être observées simultanément.

Cultivez un à huit grammes de cellules comme décrit dans le protocole texte. Versez le milieu de culture dans un grand bécher. Ensuite, placez le plat de culture sur de la glace dans une grande glacière rectangulaire.

Ajoutez 20 millilitres de solution saline glacée tamponnée au phosphate, ou PBS, dans la boîte de culture et libérez les cellules de la boîte à l’aide d’un grattoir à grandes cellules. Transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres pré-refroidi sur de la glace. Ajoutez 10 millilitres supplémentaires de 1x PBS glacé au même plat.

Récupérez les cellules restantes et transférez-les dans le tube de 50 millilitres. Répétez ce processus pour chaque plat. Les suspensions cellulaires de différentes boîtes peuvent être combinées pour réduire le nombre d’échantillons et les déchets plastiques.

Ensuite, centrifugez les échantillons pendant cinq minutes à 1 000 x g à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, videz soigneusement le surnageant. Remettez en suspension chaque granulé dans dix millilitres de 1x PBS glacé.

Consolidez les granulés remis en suspension jusqu’à cinq par tube de 50 millilitres. Lavez les tubes vides avec 10 millilitres de PBS. Ajouter la solution aux échantillons consolidés et centrifuger comme précédemment.

Après avoir retiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 10 millilitres de PBS glacé. Retirez le piston d’une seringue de 20 millilitres et mettez-le de côté. Fermez l’embout de la seringue, placez la seringue dans un tube de 50 millilitres et transférez-y la suspension cellulaire.

Centrifuger pendant cinq minutes à 1000 x g, quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette à pointe fine fixée à un système de piège à vide jusqu’à ce que la couche supérieure des cellules commence à être aspirée. Il en résulte une pastille de cellule humide.

Débouchez la seringue, insérez le piston et versez les cellules directement dans un grand bécher en plastique rempli d’azote liquide maintenu dans un bain d’azote liquide dans une boîte en polystyrène. Plongez de force les cellules restantes de la seringue. Ensuite, versez les cellules congelées dans des tubes de 50 millilitres.

Fermez les tubes sans serrer pour permettre à l’excès d’azote liquide de s’évaporer. Maintenez-les toute la nuit à 80 degrés Celsius. Serrez complètement les bouchons le lendemain.

Les cellules congelées peuvent être stockées de cette manière à 80 degrés Celsius jusqu’à la cryobroyation. Retirez les billes de cellule du congélateur à 80 degrés Celsius et placez-les dans un porte-tube de 50 millilitres dans un bain d’azote liquide. Prérefroidissez un pot de 50 millilitres, deux billes de 20 millimètres et le couvercle du bocal dans un seau à glace rectangulaire propre contenant de l’azote liquide.

De plus, pré-refroidissez un isolant en PTFE. Utilisez soit un ensemble de rondelles, soit un manchon et une rondelle. Réglez le contrepoids approprié sur le moulin.

À l’aide d’une pince, placez les deux billes de broyage pré-refroidies de 20 millimètres et les cellules congelées à l’intérieur du bocal de broyage pré-refroidi. Ajoutez de l’azote liquide dans le bocal jusqu’à ce qu’il soit à moitié plein, placez le couvercle sur le bocal et transférez l’ensemble dans le moulin. Serrez l’ensemble en place et effectuez trois cycles de fraisage, à l’aide d’un programme de 400 tr/min, trois minutes, une rotation inverse toutes les minutes et sans pause d’intervalle.

Il est essentiel d’entendre les billes cliqueter pendant le fraisage, cela indique que les billes entrent en collision et pulvérisent le matériau. Si vous n’entendez pas ce son, cela signifie qu’il n’y a pas de broyage. À la fin des trois cycles de broyage, remettez le bocal à l’azote liquide et laissez-le reposer momentanément pour qu’il refroidisse.

Retirez délicatement le couvercle. Retirez les boules à l’aide d’une pince et transférez la poudre dans un tube de 50 millilitres pré-refroidi à l’aide d’une spatule pré-refroidie. Notez que l’ajout d’azote liquide dans le pot peut aider à déloger la poudre qui est collée sur les boules.

Pour la préparation de l’extrait cellulaire, pesez 100 milligrammes de poudre cellulaire dans un tube microfuge pré-refroidi de 1,5 ou deux millilitres. Tarer une balance analytique avec le tube microfuge vide. Versez la poudre cellulaire dans le tube à l’aide d’une cuillère ou d’une spatule refroidie à l’azote liquide.

Vérifiez la masse de poudre distribuée dans le tube sur la balance analytique avant de remettre le tube dans l’azote liquide. Ouvrez le tube contenant la poudre cellulaire et laissez-le reposer à température ambiante pendant une minute pour relâcher la pression à l’intérieur du tube et empêcher la congélation immédiate du tampon d’extraction lorsqu’il est ajouté à la poudre. Ajoutez 400 microlitres d’extracteur, complété par des inhibiteurs de protéase dans le tube.

Agitez brièvement le tube, puis maintenez-le sur de la glace. Utilisez un ultrasoniseur à micro-pointe pour donner à l’échantillon une brève impulsion de faible énergie et disperser les agrégats. Clarifiez l’extrait par centrifugation.

Enfin, retirez le surnageant et procédez à la capture d’affinité. Pour prélaver le milieu d’affinité, placez les tubes contenant des billes paramagnétiques couplées à des anticorps sur l’aimant. Les billes s’accumuleront sur le côté du tube en quelques secondes, ce qui permettra d’éliminer la solution de stockage.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon d’extraction aux billes. Agiter brièvement à vitesse moyenne pour mélanger. De pluse, faites tourner les tubes dans une mini-centrifugeuse pour recueillir tout le contenu au fond du tube.

Placez ensuite les tubes sur l’aimant et aspirez la solution. Amorcez la capture d’affinité en transférant l’extrait cellulaire clarifié dans les tubes contenant le milieu d’affinité prélavé et le vortex brièvement. Incuber les tubes pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec un mélange doux et continu sur une roue rotative.

Les billes doivent rester en suspension tout au long de l’incubation. Aspirez le surnageant et lavez les billes trois fois avec un millilitre de tampon d’extraction à froid. Pour éluer les protéines, ajoutez un tampon d’échantillon de page SDS sans agent réducteur, afin d’atténuer la libération de chaînes d’anticorps par les billes.

Incuber pendant cinq à dix minutes à température ambiante en agitant. Collectez et conservez le surnageant, puis soumettez les échantillons à la page SDS, suivi d’une coloration des protéines à l’aide de techniques standard. Des bandes protéiques individuelles peuvent être excisées pour l’identification, ou l’échantillon entier peut être caractérisé en une seule analyse en électrophorisant l’échantillon seulement brièvement.

Le matériau comprenant le milieu insoluble utilisé pour la capture d’affinité peut affecter le protéome récupéré. On voit ici des perles magnétiques, de l’agarose imprégnée de fer et de l’agarose traditionnelle. Chaque milieu a été couplé à des anticorps anti-FLAG M2 et utilisé pour capturer la phosphatase alcaline bactérienne marquée FLAG et enrichie en extraits produits à partir de cellules HEK 293 cryobroyées.

Les billes magnétiques à l’échelle du micron ont montré le profil le plus propre, indiquant un niveau relativement faible d’adsorption de protéines non spécifiques. La méthode de lyse cellulaire peut également affecter le protéome récupéré. Ici, un complexe protéique endogène a été soumis à une capture d’affinité à partir d’extraits cellulaires cryobroyés ou soniqués.

Moins de contaminants de masse élevée ont été observés lorsque l’extrait cellulaire a été produit à partir de poudre de cellule cryobroyée. Même si les milieux magnétiques peuvent présenter un bruit de fond plus faible que les autres milieux, l’anticorps lui-même peut faciliter l’adsorption d’une contamination faussement positive, en particulier en l’absence de son antigène cible. Pour déterminer la liaison de fond apportée par le milieu magnétique anti-FLAG lorsque les paratopes d’anticorps sont ou ne sont pas occupés, des expériences de capture d’affinité simulée ont été menées à l’aide d’extraits de cellules HEK 293T en présence ou en l’absence d’un pic de peptide 3x FLAG.

En l’absence de son épitope apparenté, le milieu alpha FLAG capture un niveau détectable de protéines de fond qui peuvent être échappées de manière compétitive avec le peptide 3x FLAG et éludées dans une plus large mesure par le tampon d’échantillon de page SDS. Une espèce contaminante dominante a été observée entre 37 et 50 kilodaltons. En présence d’un épitope concurrent, les élutions basées sur 3x FLAG et SDS sont comparativement exemptes de liaison aux protéines de fond.

Lors de cette procédure, il est important de travailler avec soin, rapidité et précision. Gardez une trace de vos procédures et de toutes les variations observées, afin de savoir quelles étapes sont les plus critiques pour vos résultats. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la spectrométrie de masse, la centrifugation zonale et la microscopie électronique peuvent être effectuées pour analyser la composition du mélange, son niveau d’homogénéité, ainsi que la taille et la forme des complexes macromoléculaires constitutifs.

Après son développement, la capture d’affinité a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour explorer la composition des complexes protéiques physiologiques avec un niveau de détail inégalé, ce qui reste un effort de recherche mondial en cours. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des cellules mammiliennes pour la cryobroyation et de la capture d’affinité d’une protéine d’intérêt.