Name: Manipulation génétique de lagent pathogène des plantes Ustilago maydis Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Découvrez une stratégie de remplacement génique pour manipuler génétiquement le champignon pathogène Ustilago maydis. Cette méthode permet de générer des mutants de délétion et d'étudier les phénotypes d'infection chez les plantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Remerciements particuliers à Dr. Benedikt Steuten pour la lecture critique du manuscrit. Le travail original sur les chitinases a été réalisée par le Dr Thorsten Langner. Le laboratoire du VG est pris en charge par le Pôle d&#39;excellence en sciences végétales (CEPLAS, DFG EXC 1028) et ICSOB, le laboratoire de KS est soutenu par ICSOB. KB est soutenu par ICSOB. Les activités scientifiques du Centre des sciences de la bioéconomie (ICSOB) ont été soutenus financièrement par le Ministère de l&#39;innovation, des sciences et de la recherche dans le cadre de la NRW Strategieprojekt ICSOB (n ° 313 / 323-400-00213). LF est soutenu par une bourse de doctorat du DFG Groupe international de formation de recherche 1525 iGRADplant.

<ol><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).</li>
<li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+development+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Fems+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis.</a> Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).</li>
<li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ustilago+maydis%2C+the+delightful+blight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ustilago maydis, the delightful blight.</a> Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).</li>
<li>Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homologous+recombination+system+of+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The homologous recombination system of Ustilago maydis.</a> Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).</li>
<li>Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mating+and+pathogenic+development+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis.</a> Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).</li>
<li>Ökmen, B., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+plant%3A+Biotrophic+strategies+to+modulate+host+immunity+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).</li>
<li>Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+approach+for+generating+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).</li>
<li>Kämper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+system+for+highly+efficient+generation+of+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).</li>
<li>Terfrüchte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+versatile+Golden+Gate+cloning+system+for+genetic+engineering+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi.</a> Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).</li>
<li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+Method+for+Assessing+Pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+Maize+and+Teosinte+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50712(2014).</li>
<li>Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FLP-mediated+recombination+for+the+functional+analysis+of+an+effector+gene+family+in+the+biotrophic+smut+fungus+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis.</a> New Phytologist. 187, 957-968 (2010).</li>
<li>van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phleomycin+Increases+Transformation+Efficiency+and+Promotes+Single+Integrations+in+Schizophyllum+commune%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune.</a> Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).</li>
<li>Sarkari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+expression+of+single-chain+antibodies+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).</li>
<li>Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+loci+of+Sporisorium+reilianum%3A+Novel+pattern+with+three+a+and+multiple+b+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities.</a> Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).</li>
<li>Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+Environmental+Stresses%2C+Cell-wall+Integrity%2C+and+Virulence+Are+Orchestrated+Through+the+Calcineurin+Pathway+in+Ustilago+hordei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei.</a> Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).</li>
<li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genetic+manipulation+protocol+for+Ustilago+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta.</a> FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).</li>
<li>Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+replacements+in+Neurospora+strains+deficient+for+nonhomologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining.</a> P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).</li>
<li>Colot, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+knockout+procedure+for+Neurospora+reveals+functions+for+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).</li>
<li>Langner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases+Are+Essential+for+Cell+Separation+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis.</a> Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).</li>
<li>Langner, T., Göhre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+chitinases%3A+function%2C+regulation%2C+and+potential+roles+in+plant%2Fpathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions.</a> Current Genetics. , (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloining%3A+a+laboratry+manual%22">Molecular Cloining: a laboratry manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+in+the+bW%2FbE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).</li>
<li>Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+RNA-binding+proteins+implicated+in+pathogenic+development+of+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis.</a> Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).</li>
<li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+KH+domains+of+Khd4+recognize+AUACCC+and+are+essential+for+regulation+of+morphology+as+well+as+pathogenicity+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis.</a> RNA. 15, 2206-2218 (2009).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+and+dynein+mediate+microtubule-dependent+co-transport+of+mRNPs+and+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes.</a> Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).</li>
<li>Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FYVE+zinc+finger+domain+protein+specifically+links+mRNA+transport+to+endosome+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Kronstad, J. W., Leong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+two+Alleles+of+the+b-Locus+of+Ustilago%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago.</a> P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).</li>
<li>Koepke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+Rrm4+is+essential+for+efficient+secretion+of+endochitinase+Cts1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1.</a> Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Schuler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hxt1%2C+a+monosaccharide+transporter+and+sensor+required+for+virulence+of+the+maize+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist+206%22%5BJournal%5D)">Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis.</a> New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).</li>
<li>Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+Ustilago+maydis+using+the+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system.</a> Fungal Genetics and Biology. , (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit comment générer des mutants de délétion pour les études de génétique inverse en U. maydis. Le point de départ est une construction de deletion qui contient des séquences flanquantes du gène d&#39;intérêt contenant des séquences d&#39;environ 1 kb en amont du début et en aval du codon d&#39; arrêt ainsi que d&#39; une cassette de résistance approprié , car il a déjà été optimisé 7,9 . Les constructions doivent être générées individuellement pour chaque gène et soigneusement vérifié...

Ustilago maydis est un champignon modèle phytopathogènes qui a été largement étudié depuis des décennies 1,2. Il existe en deux morphologies, une étape non pathogène type levure et une filamenteux, forme infectieuse 3. Découvertes révolutionnaires universelles telles que les mécanismes de recombinaison et de réparation de l&#39; ADN homologues ont été faites à l&#39;étape de ce champignon 4 croissance type levure. En outre, le commutateur morphologique des facteurs de filaments et de virulence infectieuses importantes pour l&#39; infection sont bien caractérisés 5,6. La connaissance moléculaire de plus en plus sur la biologie et de la virulence de ce champignon du charbon repose sur une stratégie de remplacement de gène simple 7-9 soutenu par une excellente annotation du génome 10 et la facilité de génétique inverse en utilisant, par exemple, la collecte de plasmide bien organisé dans notre institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Normalisés, tests d&#39;infection rapide dans le maïs seedlings permettent des études détaillées de pathogénicité facteurs 11. Le génome de U. maydis contient environ 6.900 gènes 10. Pour étudier leur fonction, ils peuvent être supprimés individuellement ou en combinaison grâce à un système de recombinaison homologue efficace. Régions flanquantes d&#39;environ 1 kb contenant des extrémités parfaitement homologues sont idéales pour les taux de recombinaison homologue supérieure à 50%, mais déjà 250 pb avec des extrémités non homologues permettent un certain degré d&#39;intégration correcte de la construction 9. À l&#39; heure actuelle, cinq cassettes de résistance différentes, Hygr, CBXR, NATR, G418R, et la médiation de la résistance contre phleoR hygromycine, la carboxine, la nourséothricine, G418 et phléomycine, sont utilisés pour sélectionner les transformants 7,9. En outre, la résistance à l&#39;hygromycine a été développé dans une cassette recyclable (TRAF-Hygr) qui peut être éliminé par l&#39;expression transitoire d&#39;une recombinase FLP hétérologue 12. Ceci permet le retrait de la cassette de résistance et donc en théorie illimité des modifications génétiques. Phléomycine est mutagène 13, de sorte que les nouvelles cassettes, en particulier , la cassette Hygr recyclable, l&#39;utilisation de phleoR diminue. Mutants quadruples peuvent ainsi être générés en utilisant les quatre autres cassettes, mais pour les mutants quintuples, le système FRT-Hygr est recommandé 14. Cette stratégie générale de délétion du gène a été transféré avec succès à d&#39; autres champignons du charbon tels que Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, ou U. esculenta 17 et donc offre la possibilité de nouvelles applications dans les organismes génétiquement encore intraitables avec un système de recombinaison homologue efficace. En outre, les organismes dépourvus de recombinaison homologue peuvent être modifiées pour améliorer le génie génétique comme en témoigne la suppression de gènes impliqués dans la non-homologue-end-assemblage dans Neurospora crassa 18,19. Nous décrivons ici la stratégie de délétion du gène publié pour U. maydis 7,9 en détail expérimental avec un accent sur la vérification rapide et précise des candidats. A titre d&#39;exemple, nous utilisons les chitinases fongiques et représentent la génération de mutants simples, ainsi que la suppression de multiples souches 20,21. Chitinases sont des exemples intéressants, car ils agissent sur chitine dans la paroi cellulaire rigide. le remodelage de la paroi cellulaire est nécessaire pour les changements morphologiques au cours de la division cellulaire, le commutateur de croissance filamenteuse et la formation de spores. Par conséquent, dans les mutants de deletion phénotypes au long du cycle peuvent être attendus.

<table><tbody><tr><td>Acide aminobenzoïque (acide libre)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar&nbsp ;</td><td>BD</td><td>214010</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Bacto extrait de levure&nbsp ;</td><td>BD</td><td>212750</td><td>ou utilisez le fournisseur local</td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Gr&uuml ; ssing GmbH</td><td>10234</td><td>ou utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Ca-Pantothenat (sel Hemi-Ca.)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2250</td><td></td></tr><tr><td>Carboxin&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45371</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés&nbsp ;</td><td>BD</td><td>223050</td><td></td></tr><tr><td>Cholinchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-1879</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>ChemSolute</td><td>24,321,000</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>CuSO4*5H2O</td><td>Fluka</td><td>61240</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>D(+)Saccharose&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>ou utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>DNA degr. acide libre&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-3159</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3*6H2O</td><td>Gr&uuml ; ssing GmbH</td><td>10288</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Geneticin (G418) disulfate</td> sel <td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma lysing enzymes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>D(+) Glucose</td><td>Caelo</td><td>2580</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Glycérine&nbsp ;</td><td>Fisher Chemical</td><td>G065015</td><td>également utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td>Substance dangereuse. Veuillez vérifier les consignes de sécurité du fabricant.</td></tr><tr><td>Héparine sodium sel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B-solution</td><td>Roth</td><td>1287.2</td><td>Substance dangereuse.&nbsp ;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>26764298</td><td>également utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Kh2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A3620</td><td>ou utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>MgSO4 sans eau</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td> Le <td>sans eau est essentiel. Vous pouvez également utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>MnCl2*4H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2087</td><td>ou utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA*2H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td> ou <td>utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Na2MoO4*2H2O</td><td>Roth</td><td>0274.2</td><td>ou utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Gr&uuml ; ssing GmbH</td><td>12174</td><td>ou le fournisseur local</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S316060</td><td>le fournisseur local</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ChemSolute</td><td>13 751 000</td><td>le fournisseur local</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Roth</td><td>K299.1</td><td>ou le fournisseur local</td></tr><tr><td>Acide nicotinique (acide libre)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricin dihydrogen sulfate&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Werner BioAgents</td><td>5,001,000</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon nutritif&nbsp ;</td><td>Fournisseurs locaux</td> <td>Difco</td><td></td></tr><tr><td>Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1) pH 6.7</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803</td><td>Substance dangereuse. Veuillez vérifier les consignes de sécurité du fabricant.</td></tr><tr><td>polyéthylène glycol (PEG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>AppliChem</td><td>121479</td><td>également utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Pyridoxine (monochlorure)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-9755</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavine&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R5503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>Cn30.3</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>petite seringue</td><td>BD</td><td>300300</td><td>alternativement utiliser</td></tr><tr><td>le fournisseur local filtre stérile, 22 &micro ; m</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de thiamine</td><td>Serva</td><td>36020.02</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>tri-Na-Citrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S332060</td><td>alternativement utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Tris- (hydroxyméthyl) aminométhane</td><td>VWR</td><td>103156X</td><td>ou utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Tris chlorhydrate</td><td>Roth</td><td>9090.4</td><td>ou utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Triton X-100.</td><td>Serva&nbsp ;</td><td>37240</td><td>ou utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Fluka</td><td>96470</td> ou <td>utiliser le fournisseur local</td></tr><tr><td>Composition des solutions/préparation du matériau</td><td></td><td></td><td>Composition des solutions</td></tr><tr><td>Carboxin</td><td></td><td></td><td>Stock : 5 mg/ml dans du méthanol, concentration finale : 2 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>de plaques</td><td></td><td></td> CM <td>0,25 % (p/v) d’acides casaminés, 0,1 % (p/v) d’extrait de levure, 1,0 % (v/v) de solution vitaminique de vacances, 6,25 % (v/v) ; Solution de sel de Holliday, 0,05 % (p/v) de dégr. d’ADN. acide libre, 0,15 % (p/v) NH4NO3, 2,0 % (p/v) de gélose Bacto ; ajuster à pH 7,0 en utilisant 5 M de NaOH ; Après l’autoclavage, ajouter 1 % de glucose&nbsp ;</td></tr><tr><td>Génétique (G418)</td><td></td><td></td><td>Stock : 50 mg/ml en H2O, concentration finale : 500 &micro ; g/ml</td></tr><tr><td>de billes de verre lavées au HCl (0,35-0,45 mm)</td><td></td><td></td><td>Couvrir les billes de verre avec du HCl concentré (25 %, 7,8 M) et incuber pendant 60 min. Balancer plusieurs fois. Décanter le HCl (conserver le liquide décanté) et laver les billes de verre avec 3 M HCl (conserver le liquide décanté). Laver plusieurs fois les billes de verre avec du H2O double distillé jusqu’à ce que le pH soit de 7 (le liquide ne doit plus être jaune-vert). Aliquote les perles de verre et séchez-les à 180 °C. Le HCl décanté doit être neutralisé avant d’être éliminé.</td></tr><tr>Stock <td>d’héparine</td><td></td><td></td><td>: 15 mg/ml</td></tr><tr><td>solution</td><td></td><td></td> de sel de Holliday <td>16.0 & permil ; (p/v) KH2PO4, 4.0 &permil ; (p/v) Na2SO4, 8.0 &permil ; (p/v) KCl, 1,32 &permil ; (p/v) CaCl2*2H2O, 8.0 et permil ; (v/v) oligo-éléments, 2.0 &permil ; (p/v) MgSO4 ; filtrat stérile</td></tr><tr><td>Holliday solution vitaminée&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>0.1&permil ; (p/v) Thiamine, 0,05&permil ; (p/v) riboflavine, 0,05&permil ; (p/v) Pyridoxine, 0,2&permil ; (p/v) Ca-Pantothenat, (0,05&permil ; (p/v) Acide aminobenzoïque, 0,2&permil ; (p/v) Acide nicotinique, 0,2&permil ; (p/v) Cholinchloride, 1,0&permil ; (w/v) myo-Inositol ; peut être stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hygromycine</td><td></td><td></td><td>Stock : 50 mg/ml dans PBS, concentration finale : 200 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>Nourseothricine</td><td></td><td></td><td>Stock : 200 mg/ml dans H2O, concentration finale : 150 &micro ; g/ml</td></tr><tr><td>NSY-glycérol-moyen</td><td></td><td></td><td>0,8 % (p/v) de bouillon nutritif, 0,1 % (p/v) d’extrait de levure, 0,5 % (p/v) de saccharose,&nbsp ; 80,0 % (v/v) 87 % de glycérine (f.c. 69,6 %)&nbsp ;</td></tr><tr><td>RegLight</td><td></td><td></td><td>1,0 % (p/v) d’extrait de levure 0,4 % (p/v) de Bacto Peptone, 0,4 % (p/v) de saccharose, 18,22 % (p/v) de sorbitol, 1,5 % (p/v) Agar</td></tr><tr><td>SCS, pH 5,8</td><td></td><td></td><td>Solution 1 : 20 mM de tri-Na-citrate, 1 M de sorbitol ; colution 2 : 20 mM d’acide citrique, 1 M de sorbitol, ajouter la solution 2 dans la solution 1 jusqu’à ce que le pH 5,8 soit atteint ; autoclave</td></tr><tr><td>STC, pH 8</td><td></td><td></td><td>1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM CaCl2 ; filtre</td></tr><tr><td>stérile STC/PEG</td><td></td><td></td><td>40 % (v/v) PEG dans un tampon STC&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tampon TE, pH 8</td><td></td><td></td><td>1,31 mM Tris-Base, 8,69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O</td></tr><tr><td>TE/RNase</td><td></td><td></td><td>10 &micro ; g/ml RNaseA dans le tampon TE</td></tr><tr><td>Oligo-éléments</td><td></td><td></td><td>0,06&permil ; (p/v) H3BO3, 0,14&permil ; (p/v) MnCl*4H2O, 0,4 &permil ; (p/v) ZnCl2, 0,4 &permil ; (p/v) Na2MoO4*H2O :2, 0.1 &permil ; (p/v) FeCl3*6H2O, 0,04&permil ; (p/v) CuSO4*5H2O</td></tr><tr><td>Trichoderma lysing enzymes solution</td><td></td><td></td><td>12,5 mg/ml SCS ; filtre stérile ; préparer peu de temps avant utilisation</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7,5</td><td></td><td></td><td>806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base ; vérifier le pH et si nécessaire ajuster avec HCl ; autoclave</td></tr><tr><td>Usti-lyse tampon 1, pH 8</td><td></td><td></td><td>10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM de NaCl, 1 % (p/v) SDS, 2 % (v/v) de TritonX-100, 1 mM d’EDTA. Ne mesurez pas le pH à l’aide d’un pH-mètre.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Usti-lysis buffer 2</td><td></td><td></td><td>mix Usti lysis buffer 1 avec 1x TE dans un rapport de 1:1</td></tr><tr><td>YEPS-Light medium</td><td></td><td></td><td>1,0 % (p/v) d’extrait de levure, 0,4 % (p/v) de Bacto Peptone, 0,4 % (p/v) de saccharose, pour plaques : 1,5 % (p/v) de Bacto Agar</td></tr></tbody></table>

manipulation génétique de l&#39;agent pathogène des plantes<em&gt; ustilago maydis</em&gt; pour étudier la biologie de fungal and plant microbe interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Délétion du gène joue un rôle important dans l&#39;analyse de la fonction génique. L&#39;une des méthodes les plus efficaces pour perturber les gènes de manière ciblée est le remplacement de la totalité du gène avec un marqueur sélectionnable par recombinaison homologue. Au cours de la recombinaison homologue, l&#39;échange d&#39;ADN a lieu entre les séquences avec une grande similitude. Par conséquent, des séquences génomiques linéaires flanquant un gène cible peuvent être utilisés pour diriger spécifiquement un marqueur sélectionnable sur le site d&#39;intégration souhaité. Des extrémités franches de la construction de deletion activent les systèmes de réparation d&#39;ADN de la cellule et ainsi favoriser l&#39;intégration de la construction, soit par l&#39;intermédiaire d&#39;une recombinaison homologue ou non homologue jonction bout. Dans les organismes avec efficacité la recombinaison homologue, le taux de délétion du gène réussi peut atteindre plus de 50%, ce qui cette stratégie, un système de dissociation génétique précieux. Le champignon Ustilago maydis est un modèle micro-organisme eucaryote montrant tel recombinat homologue efficaceion. Sur ses environ 6.900 gènes, beaucoup ont été caractérisé fonctionnellement avec l&#39;aide de mutants de deletion, et répété échec des tentatives de remplacement de gènes points fonction essentielle du gène. Caractérisation ultérieure de la fonction du gène par le marquage avec des marqueurs ou des mutations des domaines prédits fluorescents repose également sur l&#39;échange d&#39;ADN par recombinaison homologue. Ici, nous présentons le U. maydis stratégie de génération de contrainte en détail en utilisant l&#39;exemple le plus simple, la suppression du gène.

Les constructions de deletion pour les quatre gènes codés dans chitinolytiques U. maydis génome a été généré par clonage Golden Gate utilisation de la cassette Hygr pour la suppression de CTS1, le NATR pour la suppression de CTS2, la cassette d&#39;G418R pour la suppression de CTS3 et CBXR pour la suppression de CTS4 20. Une vue d&#39; ensemble de la stratégie de remplacement de gène est illustrée...

Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d&#39;infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.

Manipulation génétique de l&#39;agent pathogène des plantes<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

L’objectif global de ce protocole est de modifier génétiquement le champignon du charbon, ustilago maydis. Cette méthode de génération de souches permet la caractérisation fonctionnelle des gènes de diverses manières. Par exemple, nous pouvons supprimer les gènes, nous pouvons échanger le promotus ou nous pouvons générer des constructions de fusion.Le principal avantage de cette méthode est que nous pouvons vérifier précisément la modification, de sorte que tout phénotype peut être directement lié au changement du gène d’intérêt. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est essentiel de savoir quand arrêter la réaction de protoplasturation pour une transformation réussie. En préparation, refroidissez deux tubes à fond rond d’un millilitre à moins 20 degrés Celsius.Ensuite, inoculez une préculture de trois millilitres dans YEPS-Light à l’aide d’une plaque fraîche. Incuber pendant 24 heures sur une roue rotative à 28 degrés Celsius. Le lendemain, ajoutez 25 microlitres de préculture à 50 millilitres de YEPS-Light dans une fiole défrichée.Ensuite, faites pousser la culture sur un agitateur orbital jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase exponentielle. Une densité optique de 1,0 correspond à une à deux fois 10 à la septième cellule chez l’ustilago maydis. Vérifiez la densité optique à 600 nanomètres.Une valeur de 0,6 à 1,0 est acceptable. Ensuite, vérifiez que les cellules ne sont pas contaminées sous un grossissement de 40x. Les contaminations bactériennes peuvent être identifiées comme de petites cellules souvent en mouvement.Les contaminations fongiques peuvent être identifiées en fonction de leur forme ou de leur taille. Jetez toujours les cultures contaminées et ne travaillez qu’à partir de cultures propres. Après avoir granulé les cellules pendant cinq minutes à 1 500 g, jetez le surnantantant.Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 25 millilitres de SCS. Répétez la centrifugation. Et pendant ce temps, préparez trois millilitres de solution de protoplastation par pastille de cellule.Passez cette solution à travers un filtre de 22 microns. Jetez maintenant le surnageant et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de solution de protoplastrage. Laissez ensuite reposer les cellules à température ambiante jusqu’à ce que 30 à 40 % d’entre elles soient rondes ou en forme de tête d’épingle.La réaction peut prendre de cinq à 20 minutes. Commencez à l’observer au microscope après cinq minutes. Pour obtenir l’efficacité de transformation maximale, la réaction protoplastique doit être arrêtée au bon moment.Et puis, les protoplastes doivent être manipulés très soigneusement comme s’ils étaient des bulles de savon. Procédez avec le protocole, en gardant toujours les protoplastes sur la glace. L’étape suivante consiste à les laver avec 10 millilitres de SCS froid, puis à les recueillir avec un essorage de cinq minutes à 1 000 G.Répétez cette étape de lavage au total trois fois.Après les lavages, remettez en suspension la pastille dans 10 millilitres de STC froid. Ensuite, recueillez à nouveau les cellules avec une autre rotation de cinq minutes à 1 000 G, puis mettez-les en suspension dans 1 millilitre de STC froid. Faites maintenant des aliquotes de 100 microlitres dans les tubes froids et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.Pour transformer les protoplastes d’Ustilago maydis, préparez deux sélections par transformation. Tout d’abord, faites fondre la gélose RegLight et refroidissez-la à 60 degrés Celsius. Ensuite, à une partie de l’agar-gélose fondue, ajoutez l’antibiotique sélectif au double de la concentration de travail et ajoutez 12 millilitres à chaque assiette pour former la couche inférieure.L’échantillon doit être mélangé soigneusement. Évitez de faire des bulles. Conservez le RegLight restant sans antibiotiques à 60 degrés Celsius.Ensuite, décongelez un tube de protoplastes sur de la glace pour chaque transformation. Une fois décongelé, ajoutez un microlitre de solution d’héparine et un microgramme d’ADN de construction linéarisé. Ensuite, gardez-les sur de la glace pendant 10 minutes.Pendant que vous attendez, étalez 12 millilitres de RegLight sans antibiotiques sur le RegLight avec des antibiotiques. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de STC/PEG dans chaque tube de transformation et mélangez-les soigneusement avec des inversions. Continuez ensuite l’incubation sur glace pendant 15 minutes de plus.Répartissez maintenant chaque réaction de transformation sur deux plaques RegLight sélectives distinctes. Assurez-vous que tout le liquide a pénétré dans les assiettes avant de continuer. Ensuite, incubez les plaques à la verticale à 28 degrés Celsius pendant cinq à sept jours pour obtenir 100 à 200 colonies.Si seulement quelques colonies se développent, les protoplastes peuvent contenir trop de paroi cellulaire, ce qui peut être testé en les transformant avec un plasma de fabrication de cellules ou ils peuvent ne pas être en mesure de se régénérer et cela peut être testé en les plantant sur des plaques sans antibiotiques. Plus tard, sélectionnez 24 transformants pour les tester. Épurez-les à nouveau sur YEPS-Light sélectif pour obtenir des colonies uniques.Sur chaque assiette, striez également une partie de la souche originale pour vous assurer que les antibiotiques sélectionnent contre les non-transformants. Il est essentiel de vérifier les mutations à l’aide d’un processus en trois étapes qui comprend deux PCR et une analyse par transfert de Southern. Ceux-ci sont détaillés dans le protocole texte.Cette section explique comment préparer l’ADN génomique nécessaire à ces analyses. Tout d’abord, inoculez cinq millilitres de YEPS-Light avec le transformant candidat et incubez-le sur une roue rotative pendant 24 heures à 28 degrés Celsius. Le lendemain, déposez deux microlitres de la culture sur une plaque CM.Gardez la culture stérile. Préparez ensuite un tube de deux millilitres avec environ 200 microlitres de billes de verre lavées à l’acide chlorhydrique et deux millilitres de culture de 24 heures. Après avoir fait tourner le tube à 12 000 G pendant cinq minutes, aspirez et jetez le surnageant.Au granulé, qui peut être congelé pour le stockage, ajoutez 500 microlitres de tampon usti-lyse deux. Ensuite, secouez le tube à 1 000 tr/min sur un Vibrax pendant cinq à 15 minutes. Assurez-vous que les cellules sont complètement remises en suspension, puis incubez le tube à 65 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes.Ensuite, placez le tube sur de la glace pendant cinq minutes. Une fois refroidi, ajoutez 100 microlitres d’acétate de potassium à 8 molaires et appliquez un bref vortex, ou dix inversions. Ensuite, faites tourner le tube à 12 000 G pendant 15 minutes à température ambiante.Ensuite, aliquote 500 microlitres du surnageant dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 400 microlitres d’isopropanol à l’aliquote. Après le mélange, faites tourner le tube pendant cinq minutes à 12 000 G.Jetez le surnageant et lavez l’ADN granulé avec 500 microlitres d’éthanol à 70 %. Maintenant, appliquez une rotation de cinq minutes et retirez complètement le surnageant.Après un autre bref essorage, laissez la pastille d’ADN sécher à l’air libre pendant quelques minutes, puis ajoutez 50 microlitres de RNase NTE. Après avoir ajouté la RNase, incubez en secouant, puis utilisez l’ADN pour les analyses. Des mutants simples et doubles des chintinases cts3 delta et des mutants multiples avec jusqu’à trois autres gènes de la chitinase ont été générés séquentiellement avec les mêmes constructions dans deux contextes génétiques différents.Les transformants ont été confirmés par PCR, puis par analyse par transfert de Southern. Pour le gène cts3, le taux de recombinaison homologue était de 70 % dans la souche SG200, ce qui suggère que cts3 a une fonction non essentielle. Certaines mutations entraînent des défauts de croissance évidents.Par exemple, le double mutant cts1/2 présentait un défaut de séparation cellulaire prononcé. La coloration des septa a montré que la cytokinèse serait terminée, mais que les cellules resteraient connectées. Pour tester la contribution des chitinases à la virulence, des tests d’infection des plantules ont été effectués à l’aide des mutants de la souche SG200.Alors que la mutation d’un gène contrôlé, khd4, a réduit la virulence, la délétion de toutes les chitinases n’a pas affecté l’infection des plants de maïs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de modifier génétiquement les champignons du charbon comme l’ustilago maydis. Une fois maîtrisées, les variétés peuvent facilement être générées en quatre semaines environ.Lors de l’utilisation de cette procédure, il est vraiment important de planifier les détails de la vérification de la souche en utilisant de futurs programmes de clonage. Faites-le avant de commencer à travailler avec des cultures fongiques. Avec de légères modifications à cette procédure, d’autres champignons du charbon comme le sporsorium reilianum ou l’ustilago esculenta ou même des champignons filamenteux, comme le piriformospora indica, peuvent être génétiquement modifiés.N’oubliez pas que le travail avec des organismes génétiquement modifiés doit être effectué conformément à la réglementation de votre pays.

genetic-manipulation-plant-pathogen-ustilago-maydis-to-study-fungal

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Nous rapportons ici une méthode d'utilisation de type I et de type...

Manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; Les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

L’utilisation d’une méthode d’injection d’aiguille pour inoculer le maïs et les plantes de teosinte avec l’agent pathogène biotrophic Ustilago maydis est décrite.  La méthode d’inoculation par injection d’aiguille facilite l’administration contrôlée de l’agent pathogène fongique entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria. Cette méthode est très efficace, permettant des inoculations reproductibles avec U. maydis.

Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité d’Ustilago maydis sur les lignées de maïs et de téosinte

Le système de cocultivation hydroponique décrit supporte des plantes intactes avec des écrans en mèches métalliques et les cocultive avec des bactéries. Les tissus végétaux, les bactéries et les molécules sécrétées peuvent ensuite être récoltées séparément pour des analyses en aval, permettant simultanément d'étudier les réponses moléculaires des hôtes de la plante et des microbes ou microbiomes en interaction.

Un système de co-culture hydroponique pour l&#39;analyse simultanée et systématique des interactions et signalisation moléculaire des plantes / microbes

Champignons du charbon causent de nombreuses maladies agricoles dévastateurs. Ils sont dispersés sous forme de téleutospores dormants qui germent en réponse à des stimuli environnementaux. Nous décrivons deux méthodes pour étudier les changements moléculaires au cours de la germination : augmentation de la respiration pour détecter l’activation métabolique de mesure et l’évaluation changeant des événements moléculaires en isolant les téleutospores aux stades morphologiques distincts.

Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection

Nous présentons ici un protocole pour tester la virulence de la plante avec le phytopathogène Magnaporthe grisea. Ce rapport contribuera au dépistage à grande échelle des pathotypes d’isolats de champignons et servir de point de départ idéal pour la compréhension des mécanismes résistants des plantes au cours de la sélection moléculaire.

Le Test de Infection de plantes : Spray et induite par la plaie de l’Inoculation avec la plante pathogène Magnaporthe Grisea

Cet ouvrage décrit le clonage d’une souche de cheval de Troie Ustilago maydis pour la prestation in situe des protéines sécrétées de maïs en trois différents types de tissus de maïs.

À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ

Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique.  En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

Le système d’édition du génome CRISPR-Cas9 est un éditeur de génome facile à utiliser qui a été utilisé dans les espèces modèles et non modèles. Ici, nous présentons une version à base de protéines de ce système qui a été utilisé pour introduire un codon d’arrêt prématuré dans un gène d’accouplement d’un champignon filamenteux d’ascocète non-modèle.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascoycete Huntiella omanensis

En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.

Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

Nous présentons un protocole simple, efficace et reproductible pour la transformation médiée par Agrobacterium de Phytophthora palmivora, qui est également applicable à P. capsici.

Une méthode simplifiée pour la transformation médiée par l’agrobactérie de Phytophthora palmivora

Découvrez une stratégie de remplacement génique pour manipuler génétiquement le champignon pathogène Ustilago maydis. Cette méthode permet de générer des mutants de délétion et d'étudier les phénotypes d'infection chez les plantes.

Manipulation génétique de lagent pathogène des plantes Ustilago maydis Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions (Vidéo) | JoVE Journal

Manipulation génétique de l'agent pathogène des plantes

Explorer plus de vidéos