Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs, Ceratitis capitata

L’objectif global de cette procédure est d’administrer des acides nucléiques dans les embryons de Ceratitis Capitata, un important ravageur agricole, afin d’élargir la boîte à outils pour son contrôle. Cette méthode permet de corriger fonctionnellement les gènes d’un organisme immobile, ainsi que de générer des souches transgéniques. Le principal avantage de cette technique est qu’une très faible quantité d’acides nucléiques est injectée pour obtenir les effets souhaités.

Maintenez tous les stades de vie de la colonie de mouches à 25 degrés Celsius avec 65 % d’humidité et une photo-période de 12 heures claire/sombre avec une photophase commençant à 8 h. Insérez une bande d’éponge à travers une petite ouverture dans la base de la cage pour fournir de l’eau aux mouches par capillarité. Vous établissez une cage de six litres, chargez une cage avec entre 1 500 et 2 000 nymphes.

Pour la nourriture, chargez la cage avec environ 45 grammes d’un à 10 mélanges de levure et de sucre. Pour collecter les œufs, placez une assiette remplie d’eau sous la cage. Les femelles déposeront leurs œufs à travers le grillage, qui s’accumuleront ensuite dans l’eau.

Parce que les femelles vierges peuvent pondre des ovules, assurez-vous que les œufs sont tous fécondés en attendant que les mouches aient au moins une semaine, avant de collecter les œufs. Pour recueillir les œufs, filtrez l’eau à l’aide d’une passoire fine. Ensuite, à l’aide d’une pipette pasteure, transférez les œufs dans une boîte en plastique chargée d’environ 0,5 litre de nourriture larvaire standard.

S’il n’y a pas eu assez d’œufs pondus, augmentez la teneur en levure de la nourriture de l’adulte jusqu’à 25 %Placez chaque boîte dans un récipient transparent, contenant une couche de son pour favoriser la nymphose. Couvrez le récipient avec un couvercle en filet pour permettre la circulation de l’air. Après environ 10 jours, vérifiez s’il y a des larves de troisième stade qui ont sauté dans la couche de son pour la nymphose.

Une fois trouvé, préparez-vous à vérifier la présence de pupes les jours suivants. Pour ramasser les nymphes, utilisez une brosse douce pour les balayer du récipient. Au départ, récupérez les pupes dans une petite tasse.

Une fois les collectes terminées, transférez les pupes dans une nouvelle cage pour adultes. Les adultes devraient émerger dans environ 10 jours. Pour la micro-injection, préparez les lames à l’avance.

Fixez une bande de deux centimètres de ruban adhésif double face à une diapositive et marquez les bords avec un marqueur porcelaine pour faire un mur pour une couche d’huile qui maintient les embryons hydratés. Pour recueillir les embryons fraîchement pondus, laissez les jeunes femelles fécondées pondre des ovules pendant 30 minutes sur un nouveau plateau, puis récupérez les embryons. Pour retirer le chorion des embryons, trempez la passoire et les œufs dans une solution commerciale d’eau de Javel à 50 % pendant cinq secondes.

Il est essentiel de ne pas trop blanchir les embryons. Lavez immédiatement les embryons blanchis en trempant soigneusement la passoire dans de l’eau propre et ultra-pure. Faites-le au moins quatre fois.

Ensuite, conservez la passoire dans de l’eau claire ultra-pure et injectez les embryons dans les deux heures. Ensuite, à l’aide d’un pinceau fin, collectez environ 50 embryons et placez-les sur un disque de papier filtre noir imbibé d’eau. À l’aide d’un stéréomicroscope à dissection, placez les embryons sur le ruban adhésif double face d’une lame de microscope préparée.

Orientez tous les embryons dans la même direction. Il est important de manipuler les embryons avec soin, car le fait de percer la membrane de l’embryon avec le pinceau peut causer des dommages qui réduisent la survie de l’embryon. Recouvre maintenant les embryons d’une couche d’huile de chloro-trifloro etholene.

L’huile doit être contenue par les bordures du marqueur de porcelaine. Ne débordez pas les frontières. À l’aide d’une micropipette, chargez l’aiguille d’injection avec quelques microlitres de solution d’acide nucléique à raison d’un à deux microgrammes par microlitre.

Ensuite, connectez l’aiguille à l’appareil de micro-injection et réglez-la pour fournir une injection d’une demi-seconde à 800 hecto-pascals avec une contre-pression de 150 hecto-pascals. Pour injecter, utilisez une gâchette à pédale et utilisez le micro-manipulateur pour contrôler l’aiguille tout en utilisant les commandes de la scène pour déplacer la glissière. Confirmez que le bolus d’injection est correctement éjecté, puis alignez l’aiguille avec le pôle postérieur du premier embryon de la rangée.

En déplaçant la platine, insérez l’aiguille dans l’embryon et injectez le bolus d’acides nucléiques. Le liquide injecté va induire une augmentation de la pression interne entraînant un léger mouvement de l’embryon. Relâchez la pédale et, immédiatement mais doucement, retirez l’aiguille de l’embryon.

Un peu de cytoplasme fuira au site d’injection. C’est normal. Si les embryons éclatent avec l’injection, laissez les embryons se dessécher pendant quelques minutes avant de les recouvrir d’huile.

Après l’injection, transférez la lame dans une boîte de Pétri. Placez un disque de papier filtre dans le couvercle du plat. Trempez le filtre avec de l’eau et fermez la boîte de Pétri avec un film de paraffine.

Incuber la chambre à 25 degrés Celsius. Deux jours après l’injection, vérifiez les lames plusieurs fois au cours de la journée pour détecter l’éclosion de larves. Recherchez les larves dans l’huile et, à l’aide d’un pinceau fin, transférez-les dans une boîte de Pétri avec de la nourriture pour larves à base de carottes.

Chargez chaque plat avec jusqu’à 200 larves. La larve ne peut pas survivre longtemps dans l’huile, alors cherchez souvent. Incuber les larves avec le couvercle presque fermé, afin qu’il y ait encore un flux d’air vers les larves.

Vérifiez les plats tous les jours et après une semaine, préparez-vous à collecter les larves en plaçant les plats dans un récipient avec du son. Collectez les pupes et attendez-vous à ce qu’elles émergent peu de temps après. Plus tard, anesthésie les adultes éclos à l’aide de dioxyde de carbone et les inspecte pour détecter leur transformation.

Lors du dépistage, cette méthode de mobilisation peut être critique. Les mouches adultes peuvent être anesthésiées à l’aide de glace ou de CO2, mais une exposition prolongée peut réduire la survie des autres. Vérifiez la présence de fluorescence rouge à l’aide d’un filtre large rouge DS.

Ou vérifiez la fluorescence verte à l’aide d’un filtre EYFP. Transférez les individus transformés dans une petite cage avec des adultes de type sauvage du sexe opposé pour établir une souche hétérozygote. Dans une expérience, l’ARN à double contrainte a été utilisé pour réduire au silence l’expression du gène inx5.

La lignée germinale adulte des témoins non injectés semble être normale comme prévu, tandis que les individus traités présentaient des testicules et des ovaires sous-développés. La quantification de l’abondance du transcrit inx5 dans l’abdomen des individus des deux sexes a confirmé l’expression significativement plus faible du gène par rapport aux témoins. Dans une deuxième expérience, deux souches avec des spermatozoïdes marqués ont été générées à l’aide du promoteur de la tubuline bêta-2 pour piloter différents marqueurs fluorescents.

Les mâles transgéniques présentaient un motif de fluorescence distinct dans le corps et dans les testicules. Avec cette vidéo, nous fournissons nos protocoles optimisés pour l’élevage et la micro-injection d’acides nucléiques dans les embryons de mouches. Une fois maîtrisés, jusqu’à 1 000 embryons peuvent être injectés sur une journée de travail de huit heures.

Suite à cette procédure, d’autres métaux tels que thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine peuvent être effectués pour développer une nouvelle génération de souches de mouches médicinales.