Création et la Transplantation d’une feuille adipeux dérivées de cellules souches (ASC) dans un modèle de cicatrisation diabétique

L’objectif global de cette procédure est de vérifier l’effet de feuilles de cellules souches dérivées du tissu adipeux combinées à de la peau artificielle sur la cicatrisation des plaies pour un défaut cutané de grande épaisseur chez le rat diabétique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la cicatrisation des plaies chroniques, telles que les grandes plaies diabétiques avec os exposé. Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont transplantées dans la plaie en feuilles solides à l’aide de la technologie des feuilles cellulaires, et le résultat est une greffe viable et stable.

Pour un donneur de coussinets adipeux, prévoyez d’utiliser des rats Lewis âgés de huit à 33 semaines. Sur le site chirurgical, préparez plusieurs applicateurs stériles à bout de coton, des gazes, un scalpel, un porte-aiguille, des ciseaux opératoires, une paire de pinces et une suture en nylon 5-0. Pour la mise en place temporaire de tissus, chargez une boîte de Pétri de 100 millilitres avec 10 millilitres de PBS.

Pesez la boîte chargée de PBS pour trouver plus tard la masse du tissu prélevé. Après avoir anesthésié le rat, placez-le en décubitus dorsal sur un champ stérile. Ensuite, rasez la zone opératoire et frottez la peau exposée à l’aide de plusieurs gommages alternés à 70 % d’éthanol.

Maintenant, faites une incision cutanée de trois centimètres dans le bas-ventre latéral. Ensuite, exposez et disséquez le muscle oblique externe. Ensuite, exposez le tissu adipeux épididymaire entourant l’épididyme.

Ensuite, excisez soigneusement le tissu adipeux épididymaire. Évitez d’endommager l’épididyme, les testicules et les vaisseaux sanguins de l’épididyme. Transférez le tissu dans la boîte de PBS.

Ensuite, fermez le rat donneur et suivez les pratiques standard de soins postopératoires. Isolez les ASC à partir de deux à trois grammes de tissu adipeux récolté. Digérer le tissu pendant une heure dans 0,1 % de collagénase de type A pour obtenir la fraction vasculaire stromale, ou SVF.

Après avoir purifié le SVF, suspendez le SVF dans 20 millilitres de support. Divisez la suspension en deux boîtes de culture de 60 centimètres carrés et cultivez-les pendant 24 heures dans des conditions standard. Le lendemain, lavez les plaques avec du PBS trois fois pour enlever les cellules détachées et les débris.

Après le lavage final, rajoutez du milieu complet frais. Ensuite, continuez à faire passer les cellules jusqu’à ce qu’elles soient presque sub confluentes le troisième jour de culture. Ensuite, en utilisant un millilitre de 0,25 % de trypsine EDTA dans une brève incubation.

Retirez les cellules de la plaque. Ne laissez pas les cellules être exposées à la trypsine active plus de 10 minutes. Après avoir observé et compté les cellules, sous-cultivez-les à une densité de 1 700 par centimètre carré.

Ensuite, passez les cellules tous les trois jours et effectuez trois passages avant de continuer. Après avoir passé les ASC de rat sous-cultivé pour la troisième fois, placez 150 000 cellules dans une boîte de culture sensible à la température de 35 millimètres de diamètre et deux millilitres de milieu de culture. Cultivez la boîte pendant trois jours dans un incubateur pour obtenir une feuille de cellule uniforme.

Trois jours plus tard, changez de milieu et ajoutez 16,4 microgrammes par millilitre d’AA. Ensuite, cultivez les cellules en changeant le milieu AA tous les deux jours. Après quatre ou cinq jours sur le milieu contenant des AA, vérifiez la prolifération des ASC. Recherchez les espaces entre les cellules et la feuille de cellules contiguës.

Une fois qu’une feuille de cellules contiguës est établie, les cellules peuvent être utilisées pour le modèle. Au besoin, prélevez la feuille de cellules en la plaçant à température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Parce que la plaque est sensible à la température, les cellules se détachent spontanément en une feuille contiguë, et la feuille peut être retirée avec une pince.

Pour le modèle de cicatrisation des plaies de l’obésité, utilisez des rats ZDF mâles adultes, âgés de 16 à 18 semaines, pesant entre 500 et 600 grammes. Positionnez et anesthésiez le rat sur le champ opératoire, et avant de raser la tête, nettoyez-le avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, rasez la zone opératoire et nettoyez la peau exposée avec des gommages alternés à 70 % d’éthanol.

À ce moment-là, transférez la plaque sensible à la température des cellules souches adipeuses sur le banc. Avant que la feuille de cellule ne se détache de la plaque, retirez le milieu et lavez la feuille de cellule avec du PBS trois fois. Après avoir collecté la feuille de cellule, trempez-la dans du PBS jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Une fois que les cellules sont prêtes, faites un défaut de peau de 15 x 10 millimètres sur toute l’épaisseur de la tête du rat. Tout d’abord, retirez le tissu cutané jusqu’au périoste. Ensuite, excise la peau et le tissu cutané à l’aide d’un scalpel et d’une paire de ciseaux chirurgicaux.

Pour compléter le défaut, retirez le périoste à l’aide de la râpe périostée. Placez ensuite la feuille de cellule sur le défaut. La feuille de cellules souches est douce et flexible.

Utilisez une pince pour l’étendre à chaque coin du défaut. Maintenant, couvrez la feuille cellulaire et le défaut avec un patch de 10 x 15 millimètres de peau artificielle imbibée de solution saline juste avant l’utilisation, et fermez la plaie avec environ 10 points de suture à l’aide d’une suture en nylon 5-0. Pour protéger la plaie, utilisez une suture en nylon 5-0 pour fixer un patch de 15 x 20 millimètres de pansement non adhésif sur la peau artificielle.

Prévoyez d’observer le pansement tous les deux jours, car le rat l’enlèvera invariablement et, au besoin, remplacera le pansement rapidement. Dans deux groupes de six rats gras diabétiques Zucker, le protocole décrit a été utilisé pour créer une anomalie du crâne. Les rats expérimentaux ont été traités avec une feuille de cellules souches adipeuses de rat, mais pas les témoins.

Après 14 jours, les plaies du groupe de traitement étaient significativement plus petites que celles des témoins. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire une grande plaie avec de l’os exposé chez les rats, puis de traiter cette plaie avec des cellules souches dérivées de l’adipeux. Lorsque vous essayez cette procédure, assurez-vous d’utiliser une gestion stricte de la température tout au long du processus d’utilisation de boîtes de culture sensibles à la température.

Sinon, les cellules pourraient se détacher spontanément des plats, retardant ainsi vos expériences.