Name: Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Découvrez la dilution acoustique automatisée de peptides pour minimiser l'adsorption plastique et améliorer la détermination de la puissance en découverte de médicaments. Cette méthode élimine la contamination croisée et augmente la reproductibilité des données.

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1. Peptide Dilution série <ol><li> Préparer un tampon de dosage: Hanks, une solution saline tamponnée (HBSS) complétée avec HEPES 25 mM, 0,1% de BSA et mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine 0,5 (IBMX), pH 7,4. </li><li> Utiliser un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter systématiquement 5 pi de tampon de dosage à chaque puits de cinq plaques de 384 puits à faible dosage de volume. <ol><li> Utilisez un logiciel interne pour créer un programme de distribution pour plus de volume de 5 pi à chaque puits d&#39;une plaque à 384 puits selon les instructions du fabricant. </li><li> Immerger distribuer un tube de la cassette dans le tampon d&#39;essai et de liquide principal. </li><li> Placer 384 puits faible volume plaque d&#39;essai sur le support de plaque. </li><li> Appuyez sur Start. </li></ol></li><li> Diluer tous les échantillons de peptides, indépendamment du véhicule de stockage, dans un tampon d&#39;essai pour produire un peptide bouillon 100x. NOTE: Peptides exigeant le dépistage peuvent être fournis dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) comme cela est jugé approprié (par exemple, le DMSO wmalades ont un effet délétère sur des peptides avec des modifications secondaires telles que la PEGylation). </li><li> Distribuer 25 ul stocks de peptides 100x en colonnes 1-5 d&#39;un 384 puits microplaques en polypropylène acoustiquement qualifié. Cette plaque est désignée «source plaque A &#39;. Veiller à ce que les plaques de source, mais pas les plaques de destination, sont à fond plat et sont conformes aux tolérances acoustiques spécifiques telles que définies par le fabricant d&#39;instruments acoustiques. </li><li> Distribuer 25 ul de contrôle de référence 100x dans les puits A23 et A24 de la plaque source A. </li><li> Distribuer 10 pi de tampon de dosage dans les colonnes 11-15 et du tampon d&#39;essai de 30 ul dans les colonnes 21-22 de plaque source A. </li><li> Distribuer 10 pi de tampon de dosage dans les colonnes 6-10 et 16-20 colonnes d&#39;un second de 384 puits en polypropylène microplaque acoustiquement qualifié. Cette plaque est désignée «plaque source B &#39;. </li><li> Centrifugeuse plaques de source A et B à 300 xg pendant 1 min. Inclure une plaque d&#39;équilibre. </li><li> Utilisez flui acoustiqued distributeurs intégrés dans un système robotique automatisé pour préparer trois séquentiels de 1: 100 des dilutions intermédiaires (dans un tampon de dosage) des stocks de peptides 100x de la colonne 1 dans la source A. NOTE: La programmation nécessite le reformatage de la plaque et le logiciel de dose - réponse (telle que fournie par le fabricant du distributeur de fluide acoustique) pour permettre trois transferts acoustiques entre la source A et la source B (voir la figure 1 pour des plans de plaque). Etape 1.9 détails spécifiquement l&#39;utilisation de distributeurs de fluide utilisés dans ce laboratoire sous contrôle robotique automatisé (voir tableau Matériaux): <ol><li> Charger des plaques de source et des plaques d&#39;essai dans la section de l&#39;hôtel de la plaque de la robotique. </li><li> Ouvrez le logiciel robotique automatisé et la charge reformatage de la plaque et les protocoles d&#39;expansion du programme de réponse à la dose. Cliquez sur &quot;Exécuter&quot;. REMARQUE: Automatisation indique un distributeur de fluide acoustique pour transférer 250 nl de colonnes 1-5 de la plaque source A dans les colonnes 6-10 de la plaque source B, et un second acoustic distributeur de fluide capable de traiter des volumes de fluide plus importants pour remblayer avec 15 ul du tampon d&#39;essai pour mélanger. Automatisation transfère ensuite la plaque source B à la centrifugeuse et des centrifugeuses à 300 g pendant 1 min intégré (une plaque d&#39;équilibre est compris pour toutes les étapes de centrifugation). plaque de Source B est retourné au distributeur de fluide acoustique pour le transfert de 250 nl de colonnes 6-10 de la source plaque B dans les colonnes 11-15 de la plaque source A et remblayer avec du tampon d&#39;essai de 15 pi pour mélanger. Automatisation des transferts source de plaque A à la centrifugeuse et des centrifugeuses à 300 g pendant 1 min intégré. plaque de source A est ensuite retourné au distributeur de fluide acoustique pour le transfert de 250 nl de colonnes 11-15 de la plaque source A dans les colonnes 16-20 de la source plaque B et remblayer avec du tampon d&#39;essai de 15 pi pour mélanger. Automatisation transfère ensuite la plaque source B pour centrifugeuse et centrifugeuses intégrée à 300 xg pendant 1 min. REMARQUE: Enfin, le protocole de réponse à la dose réalise une distribution acoustique pour transférerle volume requis de chacun des 4 dilués en série des puits de plaque de source (à la fois dans la plaque de la source A et la plaque de la source B) pour construire une courbe en 11 points complète en double exemplaire dans des plaques d&#39;essai (pré-rempli avec le tampon de dosage 5 ul à l&#39;étape 1.2 ci-dessus ). transferts d&#39;automatisation de la plaque d&#39;essai à la centrifugeuse intégrée et centrifugeuses à 300 g pendant 1 min. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des cellules <ol><li> des cellules cryoconservées décongélation ovaire de hamster chinois (CHO) exprimant le récepteur de souris rapidement cible de GLP-1 dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau et remise en suspension dans 20 ml de tampon d&#39;essai. </li><li> centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g à température ambiante (TA). Inclure un équilibre approprié. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 ml de tampon d&#39;essai. </li><li> Diluer cellulaire stock 1: 1 en bleu Trypan et déterminer la densité de cellules viables en utilisant un compteur de cellules automatisé. Resuspendre les cellules dans un tampon d&#39;essai à 1,6 x 10 6 cellules par ml (équivalent à 8000 cellules par well de plaques d&#39;essai). </li><li> Utiliser un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter 5 pl de suspension cellulaire dans chaque puits des plaques d&#39;essai (contenant les peptides dilués en série dans du tampon de dosage 5 pi) et on incube à température ambiante pendant 30 min. </li></ol> Essai 3. HTRF AMPc Détection <ol><li> AMPc HTRF apporter kit d&#39;essai à la température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. </li><li> Préparer chaque réactif HTRF (cryptate et d2) séparément à la dilution 1:20 dans du tampon de lyse (formulation exclusive, fournie par le fabricant du test de détection de l&#39;AMPc). NB: ATTENTION: Le tampon de lyse contient du fluorure de potassium (KF) qui est toxique et tératogène 13. Pour l&#39;élimination, des plaques d&#39;essai contenant KF doivent être scellés et incinérés, les déchets liquides doivent être dilués à &lt;1 mmol / L avec de l&#39;eau avant d&#39;être éliminés dans l&#39;évier. </li><li> Utiliser un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter 5 ul de réactif de cryptate à tous les puits des plaques de dosage. </li><li> Utilisez un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter 5 ul réactif d2 à columns 22/01 des plaques d&#39;essai. </li><li> Immédiatement la pipette manuelle du tampon de lyse 5 ul dans les puits A23-D24 des plaques d&#39;essai pour obtenir la liaison non spécifique (NSB) des puits témoins, et 5 ul de réactif dans les puits D2 E23-P24. </li><li> Centrifuger les plaques de dosage pendant 1 min à 200 x g à température ambiante pour mélanger les puits. </li><li> Couvrir les plaques d&#39;essai afin de minimiser l&#39;évaporation et la photo-blanchiment et incubation à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Mesurer la fluorescence de transfert d&#39;énergie par résonance signal (FRET) en utilisant une excitation à 320 nm et émission à 620 nm et 665 nm en utilisant un lecteur de plaque. </li></ol> Analyse 4. Données <ol><li> Utilisez signifie NSB pour soustraire de fond de tous les puits. </li><li> Calculer% Delta F de la 665 nm / 620 nm rapport comme suit: Ratio = (A 665 nm / A 620nm) x 10 4 Delta F = ((Rapport de l&#39; échantillon - Ratio NSB) / Ratio NSB)) x 100 où NSB = Ratio puits sans réactif d2. </li><li> Calculer% de activéions entre les cellules et les cellules non stimulées stimulées avec du GLP-1 au maximum de ligand comme suit: % = Activation (% Delta fLa -% cellules DeltaFunstimulated) / (cellules DeltaFGLP-1 stimulée% -% des cellules non stimulées deltaF) x 100 </li><li> Analyser les courbes concentration-réponse via l&#39; analyse logistique à 4 paramètres, et le graphique en% activation telle que définie par le contrôle de référence 1. </li></ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
<li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917(2008).</li>
<li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening%3A+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li>
<li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li>
<li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li>
<li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac.J.Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li>
<li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle%3A+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comput.+Aided+Mol.Des%22%5BJournal%5D)">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit l&#39;application réussie de distribution acoustique automatisé pour diluer en série des échantillons de peptides sur une plage de concentration de 3 x 10 6 nécessitant moins de 1 ul de l&#39; échantillon. Le principal avantage de cette méthode est d&#39;augmenter la qualité des données en minimisant peptide adsorption à plasticware via une exposition réduite des échantillons à des récipients expérimentaux et plasticware (tels que des pointes de pipette) qui sont normalement requises pour ...

GLP-1R est une cible médicamenteuse établie dans le traitement du diabète de type 2 2. L&#39;agoniste de peptide natif pour ce récepteur, le GLP-1, a un in vivo demi-vie de 2 à 3 min 3. La liaison de GLP-1 à ses couplés à la protéine récepteur conduit cible G dans la production en aval de la deuxième cAMP messager par le couplage de la protéine G native à l&#39;activation de l&#39;adénylcyclase. La mesure de l&#39;AMPc accumulé fournit un dosage solide pour contrôler l&#39;activation du récepteur et pour cribler des actifs analogues de GLP-1 ayant des propriétés physico-chimiques préférés. Un tel essai nécessite la dilution en série d&#39;échantillons d&#39;essai pour construire des courbes de concentration-réponse, ce qui est particulièrement compliquée lors de la remise des échantillons peptidiques. Les erreurs potentielles de la préparation de dilution en série à base de pointe ont été décrits précédemment 1,4,5. Peptides adsorberont à plasticware, entraînant des estimations de virilité peu fiables. perte de Peptide peut être minimisé en til inclusion d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans les tampons et l&#39;utilisation de matériel en plastique siliconée, mais la liaison protéique reste imprévisible. En particulier, la variation dans la liaison de GLP-1 à des récipients expérimentaux a été décrit 6. Il y a une autre complication en ce que des agents de stabilisation utilisés dans le laboratoire plasticware peut lixivier à partir des conseils et des plaques de microtitrage dans des tampons d&#39;essai aqueux et interférer avec la fonction de la protéine 7, 8. Par conséquent, des méthodes pour réduire l&#39; exposition à plasticware sont nécessaires pour augmenter la précision des mesures. Distributeurs de liquides acoustiques concentrent un signal acoustique à haute fréquence sur la surface d&#39;un échantillon de fluide, ce qui entraîne l&#39;éjection de gouttelettes d&#39;nanolitre précises dans une plaque d&#39;essai adjacente 9. L&#39;utilisation d&#39;éjection acoustique est la norme dans l&#39;industrie pharmaceutique pour la préparation et le criblage de grandes bibliothèques de composés synthétiques, et la technologie a été bien validé pour les petites molecul10 s. À notre connaissance, nous sommes le premier groupe pour décrire la distribution acoustique pour la préparation de peptides recombinants et synthétiques et nous avons précédemment rapporté la précision améliorée par rapport aux méthodes basées sur la pointe conventionnelles 1. Cet article décrit l&#39;intégration de la préparation des peptides dilutions en série et directes par transfert acoustique sans contact sur une manipulation plaque système robotique entièrement automatisé. Un certain nombre de méthodes englobant transfert acoustique d&#39;échantillons ont été décrits précédemment 11. Nous utilisons un procédé en deux étapes pour préparer des concentrations de stock intermédiaire et de diluer en série analogues peptidiques pour la génération de la pleine courbe dose-réponse. Les peptides ainsi préparés sont mis en incubation avec des cellules exprimant la cible souris GLP-1R, et nous utilisons un dosage disponible dans le commerce par fluorescence à résolution temporelle homogène (HTRF) afin de mesurer l&#39;accumulation d&#39;AMPc à l&#39;intérieur de ces cellules en lecture des peptides agonistes activlité. Le test est robuste et prête à un format de 384 puits à haut débit et systématiquement appliqué à la fois le développement de tests et de dépistage de drogue projets 12.

<table><tbody><tr><td>Celui de Hanks Solution saline équilibrée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Préparé sous forme de stock de 0,5 M dans du DMSO</td></tr><tr><td>GLP-1 (7-36) amide</td><td>Bachem</td><td>H-6795</td><td>Préparé sous la forme d’une quantité mère de 1 mg/ml dans du PBS, appelé « contrôle de référence 100x »</td></tr><tr><td>Peptides</td><td>d’essai Produit en interne chez MedImmune</td><td></td><td>Fourni à diverses concentrations dans du DMSO ou du PBS selon le cas</td></tr>, stock <tr><td>de peptides 100x</td><td>Produit en interne chez MedImmune</td><td></td><td>Peptide d’essai dilué dans un tampon de dosage jusqu’à la concentration finale requise 100x la concentration finale requise</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan, 0,4 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de cellules Cedex XS</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 plaques de puits, faible volume</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque en polypropylène 384 puits qualifiée pour l’écho</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir qualifié à l’écho</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 Manipulateur de liquides</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Volumes de transfert de gouttelettes par incréments de 2,5 nl</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Volumes de transfert de gouttelettes par incréments de 25 nl</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&nbsp ;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario Lab Automation Logiciel de planification pour la robotique des sciences de la vie</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Distributeur de réactifs</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Appelé « distributeur de réactifs en vrac »</td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Lecteur multi-étiquettes</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automated acoustique de distribution pour la dilution série de peptide agonistes dans potency détermination assays

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Comme pour la découverte de médicaments petite molécule, le criblage pour des agonistes de peptides nécessite une dilution en série de peptides pour produire des courbes de concentration-réponse. Le criblage des peptides donne une couche supplémentaire de complexité des procédés de manipulation des échantillons à base basculantes conventionnelles exposent des peptides à une grande surface de plasticware, offrant une opportunité accrue pour la perte de peptide par adsorption. Prévenir une exposition excessive à plasticware réduit la perte de peptide via l&#39; adhésion aux plastiques et donc minimise les inexactitudes dans la prédiction de la puissance, et nous avons décrit précédemment les avantages de la non-contact acoustique de distribution pour in vitro criblage à haut débit d&#39;agonistes peptidiques 1. Ici, nous discutons une solution d&#39;automatisation totalement intégré sans contact acoustique de préparation des dilutions en série de peptides dans des plaques de microtitrage en utilisant l&#39;exemple de criblage pour des agonistes peptidiques du glucagon-like peptide-1 du récepteur de la souris (GLP-1R). Nos méthodes permettent de haute-throughput cellulaire à base d&#39;essais à l&#39; écran pour les agonistes et sont facilement modulables pour soutenir l&#39; augmentation du débit de l&#39; échantillon, ou pour permettre l&#39; augmentation du nombre de copies de la plaque d&#39;essai (par exemple, pour un panel de plusieurs lignes de cellules cibles).

<html> Nous utilisons régulièrement une méthode en deux étapes pour diluer les peptides par transfert acoustique. Pour la première étape, un distributeur acoustique aligné avec l&#39; automatisation est utilisé pour créer quatre actions peptidiques dilutions intermédiaires à travers deux plaques de source (figure 1a, b). Pour la deuxième étape, nous utilisons un distributeur acoustique pour diluer encore disponible dilutions à partir de plaques de source ...

L’adsorption peptidique sur des objets en plastique lors de dilutions en série traditionnelles basées sur des pointes peut avoir un impact significatif sur la détermination de l’activité et confondre la compréhension des relations structure-activité utilisées pour les phases d’identification et d’optimisation des pistes de découverte de médicaments. Ici, des méthodes de dilution en série acoustique automatisée sans contact d’échantillons de peptides sont décrites.

Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

L'objectif général de ce protocole automatisé de dilution sériée d'échantillons de peptides est de minimiser l'absorption des peptides sur les matérielles en plastique, permettant ainsi une détermination précise de la puissance dans le cadre de la découverte de médicaments. Cette méthode peut améliorer la qualité et la reproductibilité des données, et l'élimination du pipettage basé sur des embouts supprime également le transfert croisé d'échantillons, évitant ainsi la propagation d'erreurs tout au long de l'ensemble de la dilution sériée. Le principal avantage de cette technique est qu'elle améliore la qualité des données en réduisant au minimum l'absorption des peptides sur les matérielles en plastique.Cela est particulièrement important pour mener une campagne d'identification de composés actifs ou d'établissement d'une relation structure-activité en découverte de médicaments. Après avoir préparé le tampon de dosage et créé un programme de distribution pour un distributeur en vrac conformément au protocole écrit, immergez les tubulures de la cassette de distribution dans le tampon de dosage et purgez-les avec le liquide. Placez une plaque de dosage à faible volume de 384 puits sur un support de plaque.Ensuite, appuyez sur démarrer. Distribuez 25 microlitres de stocks de peptides 100 fois dans les colonnes une à cinq d'une microplaque acoustiquement qualifiée de 384 puits, à fond plat, en polypropylène, qui sera désignée comme plaque source A. Distribuez 25 microlitres de contrôle de référence 100 fois dans les puits A23 et A24. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de tampon de dosage dans les colonnes 11 à 15 et 30 microlitres de tampon de dosage dans les colonnes 21 à 22.Ensuite, dans les colonnes six à dix et seize à vingt d'une deuxième microplaque acoustiquement qualifiée de 384 puits en polypropylène, désignée plaque source B, distribuez 10 microlitres de tampon de dosage. Centrifugez les plaques sources A et B à 300 × g pendant une minute. Ensuite, chargez les plaques sources et les plaques de dosage dans la section hôtel à plaques du robot.Ensuite, en exécutant le logiciel robotique conformément au protocole écrit, utilisez des distributeurs acoustiques de liquides intégrés au système pour préparer trois dilutions intermédiaires consécutives d’un facteur 100. Commencez par transférer les colonnes une à cinq de la plaque source A vers les colonnes six à dix de la plaque source B. Après avoir préparé la première dilution d’un facteur 100, laissez l’automatisation transférer la plaque source B vers une centrifugeuse intégrée et centrifuger à 300 ×g pendant une minute avant de ramener la plaque au distributeur acoustique de liquides. Ensuite, après avoir transféré la solution de la plaque source B vers la plaque source A pour la deuxième dilution d’un facteur 100, l’automatisation transférera la plaque source A vers la centrifugeuse et effectuera une centrifugation avant de ramener la plaque au distributeur de liquides.Enfin, après que l'automatisation a transféré la solution de la plaque A vers la plaque B pour la troisième dilution au 1/100, la plaque B est à nouveau centrifugée. Ces dilutions de peptides dans la plaque source A et la plaque source B sont ensuite utilisées pour préparer des courbes complètes de réponse en concentration dans le test, comme décrit dans le protocole textuel. Cette étape est cruciale, car une méthodologie comparative basée sur des embouts entraîne une perte importante de la puissance de l'échantillon en raison de l'absorption du peptide sur le matériel en plastique.Décongelez rapidement les cellules CHO cryoconservées exprimant le récepteur GLP1 murin cible dans un bain d'eau à 37 degrés et resuspendez-les dans 20 millilitres de tampon de dosage. Centrifugez la suspension cellulaire à 200 × g et à température ambiante pendant cinq minutes. Éliminez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans 10 millilitres de tampon de dosage.Avec le bleu de Trypan, diluez le stock de cellules au ratio de un à un et utilisez un compteur cellulaire automatisé pour déterminer la densité cellulaire viable. Ensuite, utilisez du tampon de dosage pour resuspendre les cellules à une concentration de 1,6 million de cellules par millilitre. À l’aide d’un distributeur de réactifs multipuits, ajoutez cinq microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de dosage contenant des peptides dilués en série, puis incubez à température ambiante pendant 30 minutes.Pour réaliser le test de détection de l'AMP cyclique, utilisez le tampon de lyse pour préparer des dilutions au 1/20 de chaque réactif de fluorescence résolue dans le temps homogène ou HTRF. Utilisez un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter cinq microlitres de réactif cryptate dans tous les puits des plaques de test. Ajoutez ensuite cinq microlitres de réactif D2 aux colonnes une à vingt-deux de la plaque.Ensuite, ajoutez cinq microlitres du réactif D2 dans les puits E23 à P24. Utilisez immédiatement une pipette manuelle pour ajouter cinq microlitres de tampon de lyse dans les puits A23 à D24, qui serviront de témoins de liaison non spécifique. Faites centrifuger les plaques d'essai à 200 × g et à température ambiante pendant une minute afin de mélanger les contenus des puits.Ensuite, couvrez les plaques et incubez-les pendant une heure. Après l'incubation, utilisez un lecteur de plaques pour mesurer le signal FRET avec une excitation à 320 nanomètres et une émission à 620 et 665 nanomètres. Analysez les données conformément au protocole décrit dans le texte.La première étape du transfert acoustique pour le dosage de détection de l'AMP cyclique consiste à préparer quatre dilutions intermédiaires de peptides de réserve dans deux plaques sources, comme indiqué ici. Pour la deuxième étape, le distributeur acoustique dilue davantage les solutions de réserve provenant des plaques sources A et B afin de créer une gamme de concentration à 11 points pour chaque peptide testé, en double exemplaire, pour 16 peptides différents. Un remplissage complémentaire avec du tampon de dosage est effectué afin d'assurer un volume constant par puits sur l'ensemble de la plaque de dosage.Voici une carte thermique d'une plaque exemple contenant 16 peptides analysés en double dans le dosage d'accumulation de l'AMP cyclique. Les faibles valeurs, en violet, représentent une forte concentration d'AMP cyclique. Ces courbes de concentration-réponse illustrent la reproductibilité des points effectués en double.L'échantillon un représente un témoin positif pour le dosage. Les échantillons deux, trois et quatre étaient inactifs et sont représentés par des lignes plates sur le graphique. Les échantillons cinq à seize représentent des peptides d'essai actifs.La méthode présentée ici permet de générer des courbes complètes de réponse en fonction de la concentration sur une large gamme de puissance. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures, mais cela dépendra du nombre d'échantillons nécessitant une préparation. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que les peptides sont des échantillons biologiques et doivent être manipulés en conséquence.Afin de préserver leur intégrité, il convient d'éviter les cycles répétés de congélation-décongélation. Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments peptidiques et permettra des prévisions précises de la puissance nécessaires pour alimenter les relations structure-activité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre le dosage acoustique automatisé pour la dilution en série de peptides, ce qui minimisera la perte de peptides par absorption et améliorera la précision de vos mesures.N'oubliez pas que manipuler des peptides biologiquement actifs ayant des potences picomolaires peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle doivent toujours être prises.

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