Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans Drosophila larves

L’objectif global de ces procédures est d’analyser divers composants du système hématopoïétique de la drosophile en mettant l’accent sur la dissection des glandes lymphatiques et le montage pour l’immunohistochimie. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine hématopoïétique de la drosophile. Y compris l’effet de l’altération génétique ou environnementale sur des processus tels que la survie, la prolifération, la différenciation et la signalisation cellulaire des lignées hématopoïétiques.

Le principal avantage de ces techniques est que, lorsqu’elles sont utilisées conjointement, elles peuvent aider à distinguer les effets spécifiques que les altérations ont sur des processus complexes au cours de l’hématopoïèse. Commencez la collecte de l’hémolymphe en ajoutant 10 microlitres de 1x PBS dans un tube de microcentrifugation et en plaçant le tube sur de la glace. Ensuite, placez une goutte de 10 microlitres de 1x PBS sur un tampon de dissection propre.

Sélectionnez une larve individuelle et séchez-la en la plaçant sur une lingette en tissu, puis transférez-la sur la gouttelette PBS sur le tampon de dissection. À l’aide d’une pince, déchirez doucement et retournez la cuticule pour libérer l’hémolymphe, puis jetez la carcasse. Avec la pipette, prélevez l’hémolymphe du tampon de dissection.

Ajoutez l’hémolymphe dans le tube de microcentrifugation PBS glacé et mélangez en pipetant de haut en bas. Chargez 10 microlitres de l’échantillon dans une chambre d’hémocytomètre et prenez une mesure de concentration. Pour effectuer l’immunochimie de l’hémolymphe, placez d’abord cinq microlitres de 1x PBS au centre d’une lamelle ronde de 18 millimètres située dans le puits d’une plaque de 12 puits.

Séchez une larve sur une lingette en tissu, puis placez-la dans le PBS sur la lamelle. À l’aide d’une pince, déchirez doucement et retournez la cuticule, puis jetez la carcasse. Répétez la dissection sur des lamelles séparées avec autant de larves que désiré et laissez les hémocytes adhérer aux lamelles pendant cinq à huit minutes à température ambiante.

Ne pas dépasser un temps de dissection de 30 minutes avant de passer à l’étape de fixation. Fixez les hémocytes en ajoutant cinq microlitres de formaldéhyde à 7,5 % dans les lamelles. Laissez reposer l’assiette pendant 15 minutes à température ambiante.

Lavez les lamelles trois fois avec suffisamment de 1x PBS pour couvrir les lamelles en inclinant la plaque et en aspirant le liquide après chaque lavage. Ajouter 100 microlitres de solution de perméablation dans chaque puits et laisser reposer 20 minutes à température ambiante. Inclinez la plaque et tapotez doucement pour aspirer la solution de perméablisation.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution d’anticorps primaires dans les lamelles, puis laissez les plaques incuber toute la nuit, à l’abri de la lumière si nécessaire à quatre degrés Celsius. Retirez la solution d’anticorps primaire et lavez les lamelles avec du PBS pendant 10 minutes sur un agitateur orbital à basse vitesse. Répétez ce lavage deux fois de plus.

Ajoutez 500 microlitres de solution d’anticorps secondaires dans les puits et incubez pendant au moins deux heures à température ambiante. Retirez la solution d’anticorps secondaire et lavez les lamelles avec du PBS pendant 10 minutes en secouant l’orbite. Répétez cette étape de lavage deux fois de plus.

Pendant les étapes de lavage, nettoyez une lame de microscope en verre avec de l’éthanol à 70 % et une lingette pour mouchoir. Placez cinq microlitres de tampon de montage sur la glissière de verre pour chaque lamelle de recouvrement appariée. Deux lamelles de recouvrement peuvent être placées sur une seule glissière.

Aspirez le PBS du lavage final, puis retirez soigneusement les lamelles des plaques. Placez les lamelles inversées sur le tampon de montage sur une glissière en verre. Pour commencer le curage ganglionnaire, ajoutez un millilitre de 1x PBS à un puits d’une plaque de 24 puits pour chaque cadre expérimental à disséquer.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert jetable, ajoutez une goutte de thé à 0,1 % PBS dans chaque puits. Placez l’assiette à plat sur de la glace. Placez un tampon de dissection propre sur une base de stéréomicroscope éclairée.

À l’aide d’une pipette de transfert jetable, placez une goutte de thé à 0,01 % PBS sur le tampon. Transférez une larve dans la goutte de thé PBS pour la dissection. Tenez les larves à l’aide d’une paire de pinces, côté dorsal vers le haut à environ un quart de la longueur de l’extrémité postérieure.

Avec la deuxième paire de pinces, saisissez la cuticule immédiatement avant la première paire et tirez doucement la cuticule larvaire vers l’avant jusqu’à ce que les crochets buccaux soient exposés. Relâchez la cuticule et utilisez les deux pinces pour couper les larves en deux. Retirez l’extrémité postérieure de la goutte de thé PBS et jetez-la.

Fixez la cuticule pour plus de stabilité, puis utilisez la deuxième paire de pinces pour saisir les crochets buccaux exposés et retirez-les doucement. Cela séparera la cuticule des structures internes. En gardant les crochets buccaux, vous éliminez soigneusement les structures indésirables telles que les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin.

Ramassez doucement le complexe de tissus disséqués par les crochets buccaux et transférez-le dans le puits de la plaque sur de la glace. Répétez la dissection avec autant de larves que désiré, mais ne dépassez pas un temps de dissection de 30 minutes avant de passer à l’étape de fixation. Transférez la plaque dans le stéréomicroscope et utilisez une micro-pipette pour retirer soigneusement le thé PBS du puits, en laissant les complexes tissulaires derrière.

Ajoutez doucement 200 microlitres de formaldéhyde à 3,7 % sur le côté du puits et faites tourner la plaque pour immerger le tissu. Remettez l’assiette dans la glace et laissez reposer pendant 30 minutes. Transférez ensuite la plaque dans le stéréomicroscope et retirez délicatement le fixateur.

Lavez le mouchoir trois fois en ajoutant 200 microlitres de PBS dans le puits, puis en plaçant la plaque sur un agitateur orbital pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez délicatement le PBS, puis ajoutez 200 microlitres de solution de perméablisation dans le puits. Remettez la plaque sur l’agitateur orbital pendant 45 minutes supplémentaires.

Retirez la solution du tissu et ajoutez 300 microlitres d’anticorps primaires dans le puits, en veillant à ce que les tissus disséqués soient complètement immergés. Incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit, à l’abri de la lumière si nécessaire. Retirez la solution d’anticorps et ajoutez 200 microlitres de 1x PBS dans le puits.

Placez la plaque sur un agitateur orbital pendant 10 minutes. Retirez soigneusement le PBS, puis ajoutez 300 microlitres de solution d’anticorps secondaires en veillant à ce que les tissus disséqués soient complètement immergés. Incuber le tissu sur un agitateur orbital pendant au moins deux heures.

Retirez l’anticorps secondaire et lavez le mouchoir trois fois dans 200 microlitres de 1x PBS avec nutation pendant 10 minutes. Pour commencer le montage des tissus, placez une goutte de tampon de montage sur une lame de verre. À l’aide des crochets buccaux comme poignée, transférez la glande lymphatique dans la gouttelette tampon

Espacez les tissus uniformément en répartissant le tampon de montage dans le processus. Glissez délicatement une pince de la pince sous le vaisseau dorsal, en tirant doucement vers la périphérie du tampon de montage pour extraire et aplatir la glande lymphatique. Avec un mouvement de sciage, coupez le vaisseau dorsal entre la glande lymphatique et le cerveau.

Éloignez le reste des tissus de la glande lymphatique vers le bord le plus externe du tampon. Prenez une lamelle propre et abaissez-la soigneusement sur le tampon de montage. Les lames sont maintenant prêtes pour l’imagerie ou peuvent être stockées à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Ce graphique montre la concentration moyenne d’hémocytes circulants à partir de larves obtenue à l’aide de la méthode décrite. La perte de l’hormone prothoracicotrope PTTH par ablation génétique des neurones producteurs de PTTH produit un retard dans le développement des larves. Les concentrations d’hémocytes ont été comptées pour des groupes de larves de type sauvage ayant subi l’ablation de NPTTH 120 heures après la ponte, puis de nouveau neuf jours après la ponte.

La concentration moyenne d’hémocytes par larve retardée est nettement inférieure à celle du groupe témoin. Ce n’est qu’après neuf jours après le développement que la concentration moyenne d’hémocytes par larve retardée se rapproche de celle des témoins à 120 heures. Les hémocytes circulants exprimant la protéine fluorescente verte sont représentés ici.

Les cellules ont été collectées, fixées et incubées avec le mélange d’anticorps spécifiques des plasmocytes qui permet d’identifier le sous-ensemble spécifique d’hémocytes. Cette figure montre une glande lymphatique disséquée avec succès d’une larve du troisième stade, avec des lobes primaires et secondaires flanquant le vaisseau dorsal. Ici, une larve de glande lymphatique exprime génétiquement la protéine fluorescente bleue améliorée dans la zone médilaire et la GFP dans le centre de signalisation postérieur.

La glande lymphatique a également été immunomarquée avec un anticorps contre le domaine intracellulaire entaillé. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de divers compartiments hématopoïétiques pour l’analyse, tels que les glandes lymphatiques larvaires de l’immunohistochimie et les hémocytes circulants pour les mesures de concentration ou la fixation.