Name: Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans Drosophila larves (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Découvrez les techniques de dissection de la glande lymphoïde et d'immunohistochimie chez Drosophila pour étudier l'hématopoïèse. Ces méthodes permettent d'analyser les effets des altérations génétiques et environnementales sur la différenciation cellulaire.

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Nous remercions Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi et Andreas Jenny pour leur aide. Nous remercions István Andó pour les anticorps spécifiques des plasmocytes, Utpal Banerjee pour les mouches dôme-méso-EBFP2, Julian Martinez-Agosto pour les mouches antp>GFP et Michael O’Connor pour les mouches ptth et ptth>grim. Ces méthodes ont été développées avec le soutien de la Fondation Kimmel, de la Leukemia & Lymphoma Society, du NIH/NCI R01CA140451, de la NSF 1257939, du DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 et du NIH/NCI T32CA078207.

<ol><li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thicker+than+blood%3A+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).</li>
<li>Crozatier, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila haematopoiesis.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%3A+a+model+for+studying+genetic+and+molecular+aspects+of+haematopoiesis+and+associated+leukaemias%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias.</a> Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).</li>
<li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li>
<li>Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+hematopoietic+hubs+in+Drosophila+adults+generate+hemocytes+and+contribute+to+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response.</a> Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li>
<li>Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+response+to+parasitization+in+Drosophila+requires+the+EBF+orthologue+collier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier.</a> PLoS Biol. 2 (8), 196(2004).</li>
<li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li>
<li>Minakhina, S., Steward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanotic+mutants+in+Drosophila%3A+pathways+and+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes.</a> Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).</li>
<li>Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+targets+of+Drosophila+JAK%2FSTAT+pathway+signalling+as+effectors+of+haematopoietic+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation.</a> EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).</li>
<li>Avet-Rochex, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+RNA+interference+screen+identifies+gene+networks+controlling+Drosophila+melanogaster+blood+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis.</a> BMC Dev Biol. 10, 65(2010).</li>
<li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+immune+system+and+response+genes%2C+and+novel+mutations+causing+melanotic+tumor+formation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).</li>
<li>Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+fruit+fly+hemangioblast+and+similarities+between+lymph-gland+hematopoiesis+in+fruit+fly+and+mammal+aorta-gonadal-mesonephros+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm.</a> Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).</li>
<li>Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+convergence+of+Notch+and+MAPK+signaling+specifies+the+blood+progenitor+fate+in+the+Drosophila+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm.</a> Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).</li>
<li>Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Serrate-expressing+signaling+center+controls+Drosophila+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis.</a> Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).</li>
<li>Krzemien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+blood+cell+homeostasis+in+Drosophila+larvae+by+the+posterior+signalling+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre.</a> Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).</li>
<li>Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hedgehog-+and+Antennapedia-dependent+niche+maintains+Drosophila+haematopoietic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors.</a> Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).</li>
<li>Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EBF+transcription+factor+Collier+directly+promotes+Drosophila+blood+cell+progenitor+maintenance+independently+of+the+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).</li>
<li>Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+wingless+signaling+in+stem-like+hematopoietic+precursor+maintenance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).</li>
<li>Pennetier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+of+the+Drosophila+hematopoietic+niche+by+bone+morphogenetic+protein+signaling+reveals+parallels+with+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).</li>
<li>Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-modulated+Heartless+signaling+in+Drosophila+blood+progenitors+regulates+their+differentiation+via+a+Ras%2FETS%2FFOG+pathway+and+target+of+rapamycin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function.</a> Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).</li>
<li>Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yorkie+and+Scalloped+signaling+regulates+Notch-dependent+lineage+specification+during+Drosophila+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis.</a> Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).</li>
<li>Milton, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+regulates+hematopoiesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster.</a> Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).</li>
<li>Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+hematopoiesis%3A+Markers+and+methods+for+molecular+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis.</a> Methods. 68 (1), 242-251 (2014).</li>
<li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+Drosophila+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li>
<li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J Vis Exp. (63), e3347(2012).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li>
<li>Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+crystal+cells+in+the+larva+of+Drosophila+mekmogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster.</a> Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Drosophila+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biol+Hung%22%5BJournal%5D)">Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).</li>
<li>Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+lymph+gland+as+a+developmental+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis.</a> Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).</li>
<li>Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+Drosophila+larval+hematopoietic+organ%2C+hemocyte+homeostasis+and+the+dedicated+cellular+immune+response+to+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism.</a> Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).</li>
<li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Larval+Hemocytes+of+Drosophila-Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster.</a> Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).</li>
<li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).</li>
<li>McBrayer, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prothoracicotropic+hormone+regulates+developmental+timing+and+body+size+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila.</a> Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).</li>
<li>Reimels, T. A., Pfleger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rabex-5+restricts+Notch+activity+in+hematopoietic+cells+and+maintains+hematopoietic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis.</a> J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun conflit d&#39;intérêts ou financiers.

Lors de la modification génétique ou environnementale, les quatre méthodes décrites ici peuvent être utilisés individuellement ou conjointement pour analyser les processus distincts au cours de l&#39; hématopoïèse tels que la signalisation, la survie, la prolifération et la différenciation Drosophila hématopoïèse est un processus dynamique. le nombre d&#39;hémocytes par animal et augmente 35 l&#39;expression de la structure et le gène de la glande lymphatique change 32 pendant le développe...

Les mécanismes complexes qui régissent les facteurs de transcription et les voies de signalisation qui coordonnent le développement du système hématopoïétique et un dysfonctionnement dans les maladies hématologiques restent mal compris. Ces facteurs de transcription et les voies de signalisation, ainsi que leur régulation, sont hautement conservées entre la drosophile et l&#39; hématopoïèse mammifère 1-5. Ainsi , le système hématopoïétique Drosophila représente un excellent modèle génétique pour définir les mécanismes moléculaires contrôlant l&#39; hématopoïèse et maladies hématologiques sous - jacentes. Semblable à des mammifères, Drosophila générer des cellules sanguines, appelées hémocytes, dans spatialement et temporellement des phases distinctes de l&#39; hématopoïèse. Traditionnellement, on pensait hématopoïèse chez la drosophile se limiter aux phases dans le mésoderme embryonnaire et dans les ganglions lymphatiques des larves. Des études récentes montrent que l&#39;hématopoïèse se produit également dans des larves sessiles clustres et dans l&#39;abdomen adulte 8/6. Toutes les phases hématopoïétiques produisent deux types d&#39;hémocytes matures: plasmatocytes et les cellules de cristal. Plasmatocytes sont des cellules de type macrophage impliqués dans la phagocytose, l&#39;immunité innée et la guérison des plaies. les cellules à cristaux contiennent des pro-phénoloxydases nécessaires à la mélanisation, une réaction utilisé dans les réponses immunitaires d&#39;insectes et la cicatrisation des plaies. Hématopoïèse larvaire peut générer un troisième type hémocytaire mature, appelée lamellocyte, en réponse à certains problèmes immunitaires telles que l&#39; infection par le parasite guêpe 9,10. Lamellocytes sont de grandes cellules adhérentes, qui fonctionnent en conjonction avec plasmatocytes et les cellules de cristal, afin d&#39; encapsuler et de neutraliser les oeufs de guêpes définies dans les larves de Drosophila. En l&#39;absence de parasitisme, lamellocytes ne sont pas trouvés dans de type sauvage larves. masses mélaniques ressemblent mélanisées, des œufs de guêpes encapsulées; de nombreuses souches mutantes de Drosophila développent des masses mélaniques en l&#39;absence de parasitisme. La présence de lamellogamétocytes et / ou des masses mélaniques peuvent indiquer des anomalies hématopoiétiques. En effet, le phénotype de masse mélanique a été utilisé pour identifier les gènes et les voies impliquées dans l&#39; hématopoïèse 11-14. Le système hématopoïétique larvaire est le plus largement étudié à ce jour. Il est composé d&#39;hémocytes circulant dans l&#39;hémolymphe, les clusters de hémocytes sessiles modelées sous la cuticule et les hémocytes résidant dans le ganglion lymphatique. Le ganglion lymphatique est une série de lobes bilatéraux attachés au vaisseau dorsal. Chaque lobe primaire du ganglion lymphatique est divisée en trois zones principales. La zone la plus extérieure est connue comme la zone corticale et contient maturation hémocytes. La zone la plus interne est appelée la zone médullaire et comprend des précurseurs d&#39;hémocytes de quiescence. La troisième zone, le centre de signalisation postérieure, est un petit groupe de cellules à la base de la glande lymphatique qui agissent comme une niche de cellules ressemblant à la tige. Les premiers travaux mis en place des fonctions critiques pour Notch 15-18 </sup&gt;, Hedgehog 19,20, JAK-STAT 18 et aptère 21 activité pour réguler le développement des glandes lymphatiques larvaire. Des études plus récentes ont démontré que la BMP 22, FGF-23 Ras et Hippo 24,25 signalisation fonctionnent également dans le ganglion lymphatique des larves. Quatre essais de hématopoiétiques larves présentées ici décrivent 1) à mesurer circulant concentration hémocytes, défini comme le nombre de cellules par unité de volume, 2) l&#39; isolement et la fixation de circulation hémocytes pour l&#39; immunohistochimie, 3) visualisant des cellules à cristaux in vivo et 4) disséquant, la fixation et le montage glandes lymphatiques pour l&#39;immunohistochimie. Ces dosages peuvent être utilisés pour évaluer les lectures hématopoiétiques les fonctions et les règlements des voies de signalisation dans le système hématopoïétique des larves. Bien que ces méthodes ont été utilisées précédemment dans le domaine, la documentation visuelle de ces essais a commencé que récemment 8,26-30. Plusieurs publications citées ici sont l&#39;aideressources ful décrivant des méthodes similaires et les marqueurs hématopoïétiques 26,31-33. En outre, Trol et Viking sont des marqueurs utiles de la membrane glande lymphatique du sous-sol.

<table><tbody><tr><td>Pastilles PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>plat de dissection</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugeuse</td><td>tube Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>tampon de dissection en silicone, fabriqué à partir du kit Sylgard 184</td><td>Krayden (distribué par Fisher)</td><td>NC9644388 (numéro de catalogue Fisher)</td><td>Fabriqué en boîte de Pétri en mélangeant les composants du kit élastomère Sylgard selon les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>stéréomicroscope</td><td>Morrell Instruments (distributeur Nikon)</td><td>mna42000, mma36300</td><td>Modèles Nikon SMZ1000 et SMZ645</td></tr><tr><td>Pince</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72700-DZ</td><td></td></tr><tr><td>p200</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Countess Compteur de cellules automatisé</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage de cellules Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>hémocytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue stain</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>formaldéhyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>sérum bovin albumine</td><td>Rocky Mountain Biologicals</td><td>BSA-BSH-01K</td><td></td></tr><tr><td>sérum de chèvre normal</td><td>Sigma</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>sérum d’âne normal</td><td>Sigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>200 proof éthanol</td><td>VWR</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>N-propyl gallate</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>VWR</td><td>EM-4750</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>verre de protection de microscope, carré de 22 mm</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>verre de protection de microscope, 18 mm circulaire</td><td>Fisher</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>lames de microscope en verre</td><td>Fisher</td><td>22-034-980</td><td></td></tr><tr><td>thermocycleur</td><td>Eppendorf</td><td>E950010037</td><td>Mastercycler EP Gradient S</td></tr><tr><td>tubes PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td><td>Corning</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>pipette de transfert jetable</td><td>Fisher</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Imager.Z1</td></tr></tbody></table>

méthodes pour examiner la lymphe et gland hémocytes dans<em&gt; drosophila</em&gt; larves

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

De nombreux parallèles existent entre les systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et, même si la drosophile manque la lignée lymphoïde qui caractérisent l&#39; immunité adaptative des mammifères. Drosophila et hématopoïèse mammifères se produisent dans spatialement et temporellement phases distinctes pour produire plusieurs lignées de cellules sanguines. Les deux systèmes maintiennent des réservoirs de progéniteurs des cellules de sang avec lequel se dilatent ou remplacent les lignées matures. Le système hématopoïétique permet la drosophile et les mammifères à réagir et à s&#39;adapter aux défis immunitaires. Fait important, les régulateurs de la transcription et les voies de signalisation qui contrôlent la production, la maintenance et le fonctionnement du système hématopoïétique sont conservées des mouches à des mammifères. Ces similitudes permettent drosophile à être utilisé pour le développement hématopoïétique génétiquement modèle et la maladie. Ici , nous analyses de détail d&#39;examiner le système hématopoïétique des larves de drosophile. Dansparticulier, nous décrivons des méthodes pour mesurer le nombre de cellules sanguines et de la concentration, de visualiser une lignée mûre spécifique in vivo, et d&#39; effectuer des immunohistochimie sur les cellules sanguines en circulation et dans l&#39;organe hématopoïétique. Ces tests peuvent révéler des changements dans l&#39;expression des gènes et des processus cellulaires, y compris la signalisation, la survie, la prolifération et la différenciation et peuvent être utilisés pour enquêter sur une variété de questions relatives à l&#39;hématopoïèse. Combinée avec les outils génétiques disponibles chez la drosophile, ces essais peuvent être utilisés pour évaluer le système hématopoïétique à des altérations génétiques définies. Bien que non spécifiquement décrite ici, ces tests peuvent également être utilisés pour examiner l&#39;effet des modifications de l&#39;environnement, telles que l&#39;infection ou l&#39;alimentation, sur le système hématopoïétique.

Circulant hémocytaire Concentration Numéros de hémocytaires augmentent tout au long du développement larvaire 35. Pour illustrer cette méthode permet de détecter des différences dans le nombre d&#39;hémocytes et d&#39;une concentration, quelle que soit la cause biologique, on a mesuré les concentrations de hémocytes des larves retardée et non retardée. Perte de l&#39; hormone prothoracicotropique (de PTTH) par ablation...

Systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et partagent de nombreuses caractéristiques communes, ce qui rend la drosophile un modèle génétique attrayant pour étudier l&#39; hématopoïèse. Ici, nous démontrons la dissection et montage du principal organe hématopoïétique larvaire pour l&#39;immunohistochimie. Nous décrivons également des méthodes pour analyser différents compartiments hématopoïétiques larvaires dont hémocytes circulants et des cellules à cristaux sessiles.

Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em&gt; Drosophila</em&gt; larves

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

L'objectif général de ces procédures est d'analyser divers composants du système hématopoïétique de Drosophila, en mettant l'accent sur la dissection et le montage du glande lymphoïde pour l'immunohistochimie. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hématopoïèse de Drosophila, notamment l'effet des modifications génétiques ou environnementales sur des processus tels que la survie, la prolifération, la différenciation et la signalisation cellulaire des lignées hématopoïétiques.Le principal avantage de ces techniques est qu'elles permettent, lorsqu'elles sont utilisées conjointement, de distinguer les effets spécifiques que des modifications ont sur des processus complexes durant l'hématopoïèse. Commencez la collecte de l'hémolymphe en ajoutant 10 microliters de PBS 1x dans un tube microcentrifuge et en plaçant le tube sur de la glace. Ensuite, déposez une goutte de 10 microliters de PBS 1x sur un tapis de dissection propre. Sélectionnez une larve individuelle et séchez-la en la plaçant sur un essuie-tout, puis transférez-la dans la goutte de PBS sur le support de dissection. À l’aide de pinces, déchirez doucement la cuticule et retournez-la po

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Hémocytes drosophile se dispersent sur ​​l'ensemble de l'embryon en développement. Ce protocole démontre comment monter et à l'image de ces migrations à partir d'embryons avec les hémocytes marqués par fluorescence.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Parasitoïde (parasite) guêpes constituent une classe importante des ennemis naturels des insectes, y compris de...

Une introduction à guêpes parasites<em&gt; Drosophila</em&gt; Et la réponse immunitaire antiparasitaire

Cette vidéo décrit la glande lymphatique de la drosophile, le principal site d’hématopoïèse chez la larve de mouche, et montre un exemple de protocole pour disséquer et monter l’organe à des fins d’immunohistochimie et d’imagerie fluorescente.

Discurage ganglionnaire larvaire : isolement de l’organe producteur d’hémocytes de la drosophile

L’hémolymphe de la drosophile sert à la fois de sang et de liquide interstitiel, circulant dans tout le corps pendant les stades larvaire et adulte. Cette vidéo décrit un protocole de collecte de l’hémolymphe larvaire afin de quantifier les cellules circulantes.

Rupture des cuticules : une méthode pour collecter l’hémolymphe des larves de drosophile

Cette vidéo montre le test de perturbation des hémocytes, évaluant la réadhésion des hémocytes dans les poches hématopoïétiques des larves de drosophile. Les perturbations mécaniques libèrent des hémocytes résidents, ce qui augmente le nombre d’hémocytes circulants. Après la guérison, la réadhésion des hémocytes résidents est confirmée, illustrant la réversibilité.

Un test de perturbation des hémocytes pour évaluer la réadhésion des hémocytes aux poches hématopoïétiques

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Les cellules sanguines de la drosophile, ou hémocytes, circulent entre les sites résidents et la circulation.  Chez la larve, les hémocytes résidents (sessiles) se localisent dans des microenvironnements inductifs, les poches hématopoïétiques, tandis que les hémocytes circulants se déplacent librement dans l’hémolymphe. L’objectif de ce protocole est l’isolement et la quantification standardisés de ces deux populations d’hémocytes, distinctes sur le plan comportemental mais interchangeables.

Dosage des populations de cellules de sang de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larve

Cette méthode montre comment visualiser invasion de pathogènes dans les cellules d’insectes avec des modèles tridimensionnels (3D). Hémocytes de larves de drosophile étaient infectées par des pathogènes virus ou bactériens, ex vivo ou in vivo. Hémocytes infectés ont été ensuite fixe et teintés d’imagerie avec un microscope confocal et la reconstruction cellulaire 3D ultérieure.

Extraction des hémocytes de larves de drosophile d’Infection microbienne et d’analyse

Ce protocole décrit un essai de phagocytose in vivo chez l’adulte Drosophila melanogaster pour quantifier la reconnaissance phagocyte et apurement des infections microbiennes.

Évaluation de la réponse immunitaire cellulaire de la drosophile, Drosophila melanogaster, à l’aide d’un test In Vivo la phagocytose

Ce protocole décrit un test in vivo de phagocytose utilisé pour évaluer et quantifier la capacité des jeunes et âgés Drosophila melanogaster hémocytes aux bactéries phagocytose.

Évaluation de la capacité phagocytique spécifique à l’âge des hémocytes adultes de Drosophila melanogaster à l’aide d’un test de phagocytose in vivo

Découvrez les techniques de dissection de la glande lymphoïde et d'immunohistochimie chez Drosophila pour étudier l'hématopoïèse. Ces méthodes permettent d'analyser les effets des altérations génétiques et environnementales sur la différenciation cellulaire.

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