L'utilisation de la Induced somatique analyse sectorielle (AISS) pour l'étude des gènes et de promoteurs impliqués dans la formation du bois et le développement de souches secondaire

L'objectif général de l'analyse des secteurs somatiques induits est de fournir une technique à débit moyen ou élevé pour la caractérisation fonctionnelle de gènes et de constructions promoteurs dans les tissus secondaires du tronc des arbres, et ce dans des délais relativement courts. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant l'expression spatiale et temporelle des gènes de défense, ainsi que leur rôle dans des processus biologiques importants tels que la formation du bois et le développement secondaire du tronc. Le principal avantage de cette technique réside dans son efficacité, sa simplicité et sa rapidité relative, ainsi que dans son applicabilité à un large éventail d'espèces d'arbres.

Pour commencer, préparez un tube propre de 50 millilitres à bouchon vissé contenant 19 millilitres de milieu LB frais, à 28 degrés Celsius, additionné des antibiotiques appropriés pour la sélection bactérienne. Ajoutez un millilitre de culture d’A.tumefaciens et mesurez la densité optique, ou DO, à 600 nanomètres. Si la DO est supérieure à 0,1, effectuez une dilution supplémentaire avec du milieu LB tiède. Incubez la culture d’A.tumefaciens dans un incubateur agité jusqu’à ce que la DO à 600 soit comprise entre 0,4 et 0,6.

Une fois cette étape terminée, centrifuger les cellules pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et à 1 000 x g. Verser délicatement le liquide du tube et resuspendre immédiatement le culot cellulaire avec un millilitre de milieu MS refroidi. Transférer la suspension dans un microtube propre de deux millilitres et conserver sur glace jusqu'à utilisation.

Commencez l'expérience au printemps ou en début d'été et sélectionnez des plantes dont le cambium est actif et en croissance rapide. Cela est confirmé si le phloème peut être facilement détaché du xylème. Identifiez une section droite de la tige près de la base de la plante et retirez toutes les feuilles ou branches.

À l’aide d’un scalpel bien aiguisé, découpez une fenêtre cambiale d’un centimètre carré en pratiquant deux incisions parallèles de 20 millimètres à travers le phloème, espacées de cinq millimètres, puis un seul trait horizontal qui coupe les deux incisions verticales à leur extrémité basale. Relevez la bande de phloème vers le haut afin d’exposer le tissu xylématique en formation. Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez un milieu d’inoculation suffisant pour humidifier complètement la surface du xylème exposé.

Immédiatement, réinsérez la bande de phloème dans la tige et fixez-la fermement avec du parafilm. Répétez ces étapes d'inoculation pour tous les gènes ou promoteurs d'intérêt en créant de nouvelles fenêtres cambiales situées au moins à un centimètre au-dessus ou au-dessous des fenêtres existantes et décalées de 90 degrés. En outre, inoculez des fenêtres avec les vecteurs de contrôle positif et négatif sur la même tige ou sur des tiges identiques à celles utilisées pour les inoculations expérimentales.

Surveillez périodiquement la croissance de la tige et, une fois qu'une croissance radiale d'au moins cinq millimètres a été observée, récoltez le tissu pour un dosage de bêta-glucuronidase, ou test GUS. Pour récolter l'échantillon, commencez par exciser la fenêtre cambiale de la tige en éliminant tout tissu qui ne fait pas partie de la nouvelle croissance. Pour les études portant sur la morphologie des cellules ou des tissus du xylème et du phloème matures, séparez le phloème du xylème.

Alternativement, pour les études nécessitant que la zone cambiale reste intacte ou que les profils d'expression des promoteurs soient évalués, sectionner transversalement la fenêtre cambiale à l’aide d’un rasoir afin d’obtenir des disques d’une épaisseur comprise entre 0,5 et un millimètre. Placer les tissus de la fenêtre cambiale récoltés dans des tubes individuels de fond rond de 14 millilitres et rincer deux fois dans un tampon phosphate 0,1 molaire à pH 7 pendant cinq minutes à chaque fois, en veillant à ce que le tissu soit complètement immergé. À la fin du deuxième rinçage, veiller à éliminer tout excès de solution.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de réactif GUS dans chaque tube. Si cela ne recouvre pas complètement l'échantillon de tissu, ajoutez du réactif supplémentaire. Incubez les tubes pendant dix minutes à 55 degrés Celsius à l'abri de la lumière.

Après cela, incubez les tubes pendant encore 12 à 16 heures sur un agitateur à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière, en utilisant une agitation douce. Après avoir retiré les tubes de l’incubateur, prélève un sous-ensemble aléatoire des tubes et vérifie le pH du réactif GUS à l’aide du papier tournesol dont la plage de pH est comprise entre zéro et sept. Si l’un d’eux présente un pH inférieur à six, étiquette-les et vérifie le reste des tubes.

Étiquetez et excluez tous les tubes dont le pH est inférieur à six. Versez le réactif GUS hors des tubes et remplacez-le par suffisamment d'éthanol à 70 pour cent pour recouvrir le tissu. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.

À l’aide d’une paire de forceps propre, retirer tout le tissu de la fenêtre cambiale d’un tube d’échantillon et le placer sur un petit plateau ou une boîte de Pétri pour une visualisation microscopique. Placer l’échantillon sous l’objectif d’un microscope stéréoscopique avec un grossissement compris entre 1X et 4X, puis identifier et comptabiliser le nombre de cellules ou de tissus présentant une coloration bleu vif. Dans les cas où le phloème a été retiré, compter le nombre de secteurs présents dans le tissu cambial observés à la surface du xylème en développement.

Pour les échantillons découpés en disques, compter le nombre de secteurs présents dans les différents types cellulaires ou tissulaires. S'assurer d'examiner les deux faces du disque et d'apparier les secteurs traversant deux disques afin d'éviter toute surestimation du nombre. Ne replacer dans le tube contenant de l'éthanol à 70 pour cent que le tissu présentant des secteurs, puis conserver jusqu'à utilisation.

Répétez l'analyse pour toutes les fenêtres cambiales supplémentaires récoltées, y compris les témoins positifs et négatifs. Pour faciliter l'identification précise des secteurs lors de leur classification, nous vous conseillons de vous familiariser avec l'anatomie et le développement secondaires de la tige, ainsi qu'avec les réponses de la tige aux blessures. Cette figure montre plusieurs transformations réussies, visibles ici comme des régions de coloration bleue.

Un exemple de fenêtre de prélèvement du phloème montre plusieurs secteurs transformés, et des disques récoltis sur deux espèces d'arbres présentent des secteurs de transformation ainsi qu'une croissance radiale ultérieure. On peut également observer la transformation dans divers types de tissus. Ici, des secteurs caulinaire sont visibles dans le périderme, le phloème, le parenchyme de blessure et plusieurs autres régions tissulaires du peuplier blanc.

Cette image montre les résultats de l'expression de promoteurs génétiques dans les dérivés cambiaux. Dans cet exemple, on observe la proportion de coloration dans chaque type de tissu lors d'un essai impliquant une série de promoteurs CesA d'Eucalyptus grandis transformés dans des tiges d'hybrides d'eucalyptus. L'expression dans le phloème, ainsi que dans les xylèmes en développement et différenciés, est exprimée en pourcentage.

Le nombre moyen d'événements de transformation par centimètre de cambium inoculé peut également être calculé pour chaque promoteur ou gène d'intérêt. Ce tableau présente les données relatives aux secteurs typiques identifiés chez des sujets eucalyptus et peuplier transformés avec un contrôle positif ou un promoteur d'intérêt, analysés à l'aide de la méthode de récolte par disques. Une fois maîtrisée, cette technique peut fournir une méthode rapide, efficace et largement applicable pour analyser la nature complexe de la différenciation cambiale lors de la formation du développement secondaire de la tige.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des plantes et des bactéries, de la transformation, de la culture et de la récolte des tiges, ainsi que de l’identification et de la classification des tissus transgéniques pour l’évaluation phénotypique.