Name: Lutilisation de la Induced somatique analyse sectorielle (AISS) pour létude des gènes et de promoteurs impliqués dans la formation du bois et le développement de souches secondaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Découvrez l'analyse sectorique somatique induite pour caractériser les gènes et promoteurs impliqués dans la formation du bois chez les arbres. Cette méthode efficace et rapide s'applique à diverses espèces ligneuses.

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Les auteurs tiennent à souligner le soutien financier pour certains aspects du travail par le biais des subventions de liaison LP0776563 (GB, AS) et LP0211919 (GB) et des partenaires industriels Sappi et Mondi, ainsi que de l’Australian Postgraduate Award (EM) de l’Australian Research Council et du Young Innovators and Scientist Award du ministère australien de l’Agriculture (LT). Nous tenons également à remercier Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan et Simon Southerton pour les nombreuses discussions et idées qu’ils ont mises de l’avant lors de l’élaboration de ce protocole, ainsi que Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel et Noémie Defaix pour leur aide dans les travaux de laboratoire.

<ol><li>Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+plant+and+plant+part+transgenic+approaches+in+the+study+of+wood+formation+-+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22TPJ%22%5BJournal%5D)">Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations.</a> TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).</li>
<li>Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+formation+in+forest+trees%3A+from+Arabidopsis+to+Zinnia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia.</a> Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).</li>
<li>Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation%2C+secondary+cell-wall+formation+and+transformation+of+callus+tissue+of+Pinus+radiata+D.+Don%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don.</a> Planta. 217 (5), 736-747 (2003).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+in+vitro+transformation+of+wood-producing+stem+segments+in+eucalypts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts.</a> Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech+J%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotech J. , (2015).</li>
<li>Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+cambial+tissue+in+vivo+provides+efficient+means+for+Induced+Somatic+Sector+Analysis+%28ISSA%29+and+gene+testing+in+stems+of+woody+plants+species%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species.</a> Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+dormant+lateral+buds+in+poplar+trees+reveals+developmental+patterns+in+secondary+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues.</a> Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+affects+cellulose+microfibril+orientation+in+plant+secondary+fiber+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls.</a> Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).</li>
<li>MacMillan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fasciclin-like+arabinogalactan+protein+family+of+Eucalyptus+grandis+contains+members+that+impact+wood+biology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics.</a> New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).</li>
<li>Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+somatic+sector+analysis+of+cellulose+synthase+%28CesA%29+promoter+regions+in+woody+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues.</a> Planta. 237 (3), 799-812 (2013).</li>
<li>Hussey, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SND2%2C+a+NAC+transcription+factor+gene%2C+regulates+genes+involved+in+secondary+cell+wall+development+in+Arabidopsis+fibers+and+increases+fiber+cell+area+in+Eucalyptus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus.</a> BMC Plant Biology. 11, (2011).</li>
<li>Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ARBORKNOX1+delays+the+differentiation+of+induced+somatic+sector+analysis+%28ISSA%29+derived+xylem+fiber+cells+in+poplar+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Genet.+Genomes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems.</a> Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).</li>
<li>Baldacci-Cresp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PtaRHE1%2C+a+Populus+tremula+x+Populus+alba+RING-H2+protein+of+the+ATL+family%2C+has+a+regulatory+role+in+secondary+phloem+fiber+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development.</a> Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio-assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+S+%22Wood+formation+in+trees%3A+Cell+and+Molecular+Biology+Techniques%22">Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques</a>. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).</li>
<li>Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+expression+and+specific+elimination+of+endogenous+beta-glucuronidase+activity+in+transgenic+and+nontransgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants.</a> Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).</li>
<li>Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+eliminating+endogenous+beta-glucuronidase+background+in+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley.</a> Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole de l&#39;AISS est une méthode relativement simple et efficace pour la création de tissus souches transgéniques dans les espèces d&#39;arbres en l&#39;espace de quelques mois pour l&#39;analyse des gènes et des promoteurs d&#39;intérêt impliqués dans le bois et la tige formation. Peu d&#39; efforts, au - delà de plantes garder en vie, est nécessaire pour cultiver des tissus souches transgéniques après l&#39; inoculation , qui contraste avec les méthodes in vitro , où une vaste culture est nécessaire...

tiges Arbre comprennent une quantité importante de la biomasse et les planètes sont d&#39;une immense importance biologique, culturelle et commerciale. tiges secondaires créent un habitat en fournissant des ressources et un abri pour de nombreuses autres formes de vie. Ils offrent de nombreux services pour les écosystèmes où ils vivent et agissent comme une ressource renouvelable pour la production de bois, de pâte et de papier et d&#39;autres produits ligneux et non ligneux. développement de la tige secondaire, et plus particulièrement la formation du bois est régie par un système complexe moléculaire qui régulent le développement des types de cellules spécifiques, la composition biochimique de leurs parois cellulaires et la façon dont ils sont agencés pour former des tissus et des organes. Disséquer la base moléculaire du développement de la tige secondaire et la formation du bois est confondu par de nombreux facteurs, y compris la variabilité des propriétés du bois et de souches à l&#39;intérieur et entre les tiges, les longs délais de production, hors passage des systèmes d&#39;accouplement, haute hétérozygotie, charge génétique élevée, dormance saisonnière, longue maturepériodes d&#39;établissement trait et la taille physique pure d&#39;arbres matures. En conséquence, la compréhension du développement de la tige secondaire par rapport à la connaissance détaillée de la plupart des autres aspects du contrôle moléculaire du développement des plantes, est encore à ses balbutiements. Un certain nombre de techniques in vitro ont été utilisées pour étudier et comprendre le développement de la tige secondaire, notamment le bois et la formation secondaire de la paroi cellulaire. Ces protocoles impliquent l&#39;utilisation de la plante entière ou systèmes partiels de plantes, où soit les plantes transgéniques sont créés ou des cellules ou des tissus secondaires spécifiques sont transformés pour l&#39;étude des aspects spécifiques du bois et / ou le développement de tige secondaire 1. Les plantes transgéniques peuvent être récupérés transformation post génétique à partir d&#39;une grande variété de tissus végétaux et types de cellules, cependant, les progrès sont lents, en particulier lors de l&#39;analyse des traits de fibre de bois en raison de la longue régénération et endiguer les temps de maturation (dans l&#39;ordre des années), haute technique et deman du travailds, faible débit de gènes candidats, ainsi que des difficultés à propager certaines espèces de plantes ligneuses. Des techniques similaires ont été développés dans le système de modèle non ligneuses telles que Arabidopsis qui surmontent avec succès certaines de ces limitations, mais tous les types de cellules souches non secondaire présent dans ces tiges et traits liés à la saisonnalité ou la longévité ne peuvent pas être étudiés dans ces espèces 2. Alternativement, les systèmes de partie de plantes, telles que radiata cals les cultures Pinu 3 réduisent les délais associés. Ces méthodes sont toutefois limitées à l&#39;étude d&#39;un type de cellule individuelle et souffrent des contraintes similaires comme indiqué pour les expériences in vitro. De même, les cultures de souches apicale 4 impliquant explants souches entières se sont révélés prometteurs , mais encore ont pas été appliquées pour l&#39;étude des gènes ou promoteurs d&#39;intérêt spécifiques. Plus récemment, un protocole alternatif impliquant des cultures de racines velues a été développé pour les eucalyptus et a été avec succèsappliquée 5, cependant, cette méthode nécessite encore la culture in vitro, implique des racines secondaires plutôt que des tiges et à ce jour , il est limité à une seule espèce d&#39;arbres. Induite analyse sectorielle somatique (AISS), comme décrit ici, a été développé pour surmonter certains de ces problèmes pour fournir un support à haut débit outil de criblage fonctionnel pour des gènes et des promoteurs avec des rôles présumés dans la formation du bois et le développement secondaire de tissu de la tige. AISS est une transformation in vivo et le dépistage du système qui a été développé pour réduire le temps nécessaire pour produire des cellules transgéniques et des tissus dans une tige secondaire intacte tout en surmontant la main - d&#39;œuvre, les limitations techniques et de débit de couramment utilisés dans les méthodes in vitro. Les protocoles décrits ici permettent la création simultanée de centaines de secteurs et les cellules des tissus transformés de façon indépendante dans les tiges secondaires dans un court laps de temps, dans les espèces d&#39;arbres et de tissus d&#39;intérêt sans gvariation Enetic et / ou environnemental dans des délais relativement courts temps et le coût du travail faible. AISS techniques in vivo ont d&#39; abord été décrit pour la tige secondaire 6 et le bourgeon 7 tissus et ont depuis été affiné dans le tissu de tige secondaire grâce à des études de gènes et / ou des promoteurs impliqués dans la différenciation cambium et comprennent: la tubuline (TUB) 8, fascicline comme arabinogalactane ( FLA) 9, la cellulose synthase (CESA) 10, domaine nac mur associé secondaire cellule (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 et vraiment protéine intéressante nouveau gène (RING) H2 13. Ces études ont été menées dans le secondaire tiges des plantes de peupliers et d&#39;eucalyptus et fourni un aperçu de la morphologie cellulaire, la chimie de la paroi cellulaire et l&#39;expression des gènes. Les protocoles décrits ici sont destinés à réunir l&#39;expérience d&#39;unnd connaissances acquises à travers le développement et l&#39;application de l&#39;AISS à partir d&#39;une série d&#39;études publiées et non publiées au cours de la dernière décennie. Ils se concentrent sur la transformation in vivo des tissus souches secondaires 6 et se concentrent sur des études portant sur le clone &#39;pyramidal de Populus alba, Eucalyptus globulus, ainsi que 11 Eucalyptus globulus x clones camaldulensis. Ce document prend les chercheurs à travers le protocole de la culture des plantes et des bactéries, la transformation des tissus de la tige, la croissance et la récolte des tissus, l&#39;identification des cellules et des tissus transgéniques, la préparation des évaluations phénotypiques et méthodes pour la collecte et l&#39;analyse des données. Bien que les techniques ont été appliquées avec succès pour mesurer la composition de monosaccharide de la paroi cellulaire aussi 9,11, en raison du manque d&#39;espace, ce document se concentre sur les techniques utilisées pour la cellule de mesure et la morphologie des tissus et la compréhension des profils d&#39;expression des gènes dans st secondaireems seulement. En conséquence, le protocole tel que décrit est adapté à ceux qui cherchent à acquérir de nouvelles informations sur le rôle et / ou l&#39;expression de gènes liés à l&#39;utilisation secondaire des tiges un faible coût, techniquement facile, et moyen à la méthode à haut débit.

<table><tbody><tr><td>Plantes</td><td>NA</td><td>NA Veuillez</td><td>consulter les fournisseurs de pépinières locaux pour les plantes au besoin</td></tr><tr><td>Souche Agrobacterium</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Il existe de nombreuses façons d’obtenir des souches Agrobactrium. Nous vous suggérons de faire un suivi au sein de votre communauté de recherche locale, car il peut y avoir des restrictions dans l’obtention de la bactérie dans votre pays et votre région.</td></tr><tr><td>Vecteur binaire (gène et promoteur)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Nous avons développé une gamme de vecteurs pour s’adapter au protocole ISSA en utilisant un système de recombinase de passerelle. Cela inclut la surexpression, les knock-outs d’ARNi et les vecteurs de fusion de promoteurs basés sur des vecteurs pCAMBIA modifiés et heureux de fournir si nécessaire. De plus, il existe de nombreux vecteurs disponibles pour la communauté des chercheurs.</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>LB media avec gélose</td><td>Sigma</td><td>L2897</td><td>Un produit similaire peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td>Sigma</td><td>NA</td><td>Le numéro de catalogue dépendra de l’antibiotique dont vous avez besoin, car une gamme d’antibiotiques est utilisée pour la sélection bactérienne dans les vecteurs binaires. Ce produit pourrait provenir d’a&nbsp ; gamme de sociétés</td></tr><tr><td>50 ml Tubes à vis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>2 ml Microtube</td><td>Watson Bio Lab</td><td>132-620C</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>MS Media</td><td>Sigma</td><td>M9274</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Lame de scalpel n° 11</td><td>Sigma</td><td>S2771</td><td>Le même produit pourrait provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Parafilm « M"</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>C’est le meilleur produit à utiliser pour lier la création de poteaux de fenêtre cambiale&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes à fond rond de 14 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>150268</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>X-Gluc</td><td>X-GLUC direct</td><td></td><td>Vous devrez vous rendre sur le site Web pour commander - http://www.x-gluc.com/index.html</td></tr><tr><td>Ferricyanure de potassium (III)</td> <td>Sigma</td><td>244023</td><td>Le même produit pourrait provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Ferrocyanure de potassium (II)</td> <td>Sigma</td><td>P9387</td><td>Le même produit pourrait provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Papier</td><td>Tournesol Sigma</td><td>WHA10360300</td><td>Le même produit pourrait provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Lame de rasoir à simple tranchant</td><td>ProSciTech</td><td>L055</td><td>Le même produit pourrait provenir d’une autre entreprise</td></tr><tr><td>Lame de rasoir à double tranchant</td><td>ProSciTech</td><td>L056</td><td>Le même produit pourrait provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>SEM Pin Stub</td><td>ProSciTech</td><td>GTP16111</td><td>Le même produit pourrait provenir d’une autre entreprise</td></tr><tr><td>Flacon d’échantillon avec bouchon à vis</td><td>ProSciTech</td><td>L6204</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>sigma</td><td>E7023</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>LR white</td><td>ProSciTech</td><td>C025</td><td>Le même produit peut provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Moule d’encastrement</td><td>ProSciTech</td><td>RL090</td><td>Nous recommandons cette variété, mais il existe de nombreuses options disponibles Supports de</td></tr><tr><td>montage Water Soulable</td><td>ProSciTech</td><td>IA019</td><td>Un exemple de support de montage qui pourrait être utilisé, mais d’autres options existent et pourraient être explorées.</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>Un produit similaire pourrait provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td>Un produit similaire pourrait provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>ProSciTech</td><td>C138</td><td>Un produit similaire pourrait provenir d’une autre société</td></tr><tr><td>Quanta Environmental Scanning Electron Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td>Il s’agit de l’instrument utilisé dans le cadre de cette étude, mais tout autre MEB doté d’un mode de vide faible peut être utilisé.</td></tr> Le <tr><td>logiciel</td><td></td><td></td><td>d’imagerie ImageJ peut provenir de l’URL suivante http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de la induced somatique analyse sectorielle (aiss) pour l&#39;étude des gènes et de promoteurs impliqués dans la formation du bois et le développement de souches secondaire

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

croissance de la tige secondaire dans les arbres et la formation du bois associé sont importantes à la fois du point de vue biologique et commercial. Cependant, on sait relativement peu sur le contrôle moléculaire qui régit leur développement. Cela est dû en partie à l&#39;intégrité physique, les ressources et les limites de temps souvent associée à l&#39;étude des processus de croissance secondaires. Un certain nombre de techniques in vitro ont été utilisées impliquant soit une partie de plante ou d&#39;un système de la plante entière dans les deux espèces ligneuses et de plantes non ligneuses. Cependant, des questions sur leur applicabilité pour l&#39;étude des processus de croissance de la tige secondaire, la récalcitrante de certaines espèces et l&#39;intensité du travail sont souvent prohibitifs pour les moyennes et les applications à haut débit. Aussi, quand on regarde le développement de souches et de bois formation secondaire, les traits spécifiques visés par l&#39;enquête pourraient ne devenir mesurable fin du cycle de vie d&#39;un arbre après plusieurs années de croissance. Pour relever ces défis de remplacement in vivo protocoles ont été développés, nommé Induced analyse sectorielle somatique, ce qui implique la création de secteurs de tissus somatiques transgéniques directement dans la tige secondaire de la plante. L&#39;objectif de ce protocole est de fournir un moyen efficace, facile et relativement rapide pour créer un tissu végétal secondaire transgénique pour le gène et la caractérisation fonctionnelle du promoteur qui peut être utilisé dans une gamme d&#39;espèces d&#39;arbres. Les résultats présentés ici montrent que les secteurs de souches secondaires transgéniques peuvent être créés dans tous les tissus vivants et les types de cellules dans les tiges secondaires d&#39;une variété d&#39;espèces d&#39;arbres et que les traits morphologiques de bois ainsi que les modes d&#39;expression de promoteur dans le secondaire tiges peut être facilement évaluée en facilitant moyenne à élevée la caractérisation fonctionnelle de débit.

En utilisant ce protocole tous les types de cellules souches et de tissus vivants secondaires se sont avérés être sensibles à A. tumefaciens et les transformations ont été définies dans les types de secteur en fonction du type de cellule initialement transformée et ce modèle de croissance du développement ultérieur. Types sectoriels comprennent périderme, phloème, cambium, parenchyme plaie et tylose (figure 1b, 1c, 1d) et peuven...

Ici, nous présentons un protocole qui facilite la caractérisation fonctionnelle à moyen à haut débit des constructions de gènes et de promoteurs dans le tissu secondaire de la tige de l’arbre dans des délais relativement courts. Il est efficace, facile à utiliser et largement applicable à une gamme d’espèces d’arbres.

L&#39;utilisation de la Induced somatique analyse sectorielle (AISS) pour l&#39;étude des gènes et de promoteurs impliqués dans la formation du bois et le développement de souches secondaire

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

L'objectif général de l'analyse des secteurs somatiques induits est de fournir une technique à débit moyen ou élevé pour la caractérisation fonctionnelle de gènes et de constructions promoteurs dans les tissus secondaires du tronc des arbres, et ce dans des délais relativement courts. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant l'expression spatiale et temporelle des gènes de défense, ainsi que leur rôle dans des processus biologiques importants tels que la formation du bois et le développement secondaire du tronc. Le principal avantage de cette technique réside dans son efficacité, sa simplicité et sa rapidité relative, ainsi que dans son applicabilité à un large éventail d'espèces d'arbres.Pour commencer, préparez un tube propre de 50 millilitres à bouchon vissé contenant 19 millilitres de milieu LB frais, à 28 degrés Celsius, additionné des antibiotiques appropriés pour la sélection bactérienne. Ajoutez un millilitre de culture d’A.tumefaciens et mesurez la densité optique, ou DO, à 600 nanomètres. Si la DO est supérieure à 0,1, effectuez une dilution supplémentaire avec du milieu LB tiède. Incubez la culture d’A.tumefaciens dans un incubateur agité jusqu’à ce que la DO à 600 soit comprise entre 0,4 et 0,6.Une fois cette étape terminée, centrifuger les cellules pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et à 1 000 x g. Verser délicatement le liquide du tube et resuspendre immédiatement le culot cellulaire avec un millilitre de milieu MS refroidi. Transférer la suspension dans un microtube propre de deux millilitres et conserver sur glace jusqu'à utilisation.Commencez l'expérience au printemps ou en début d'été et sélectionnez des plantes dont le cambium est actif et en croissance rapide. Cela est confirmé si le phloème peut être facilement détaché du xylème. Identifiez une section droite de la tige près de la base de la plante et retirez toutes les feuilles ou branches.À l’aide d’un scalpel bien aiguisé, découpez une fenêtre cambiale d’un centimètre carré en pratiquant deux incisions parallèles de 20 millimètres à travers le phloème, espacées de cinq millimètres, puis un seul trait horizontal qui coupe les deux incisions verticales à leur extrémité basale. Relevez la bande de phloème vers le haut afin d’exposer le tissu xylématique en formation. Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez un milieu d’inoculation suffisant pour humidifier complètement la surface du xylème exposé.Immédiatement, réinsérez la bande de phloème dans la tige et fixez-la fermement avec du parafilm. Répétez ces étapes d'inoculation pour tous les gènes ou promoteurs d'intérêt en créant de nouvelles fenêtres cambiales situées au moins à un centimètre au-dessus ou au-dessous des fenêtres existantes et décalées de 90 degrés. En outre, inoculez des fenêtres avec les vecteurs de contrôle positif et négatif sur la même tige ou sur des tiges identiques à celles utilisées pour les inoculations expérimentales.Surveillez périodiquement la croissance de la tige et, une fois qu'une croissance radiale d'au moins cinq millimètres a été observée, récoltez le tissu pour un dosage de bêta-glucuronidase, ou test GUS. Pour récolter l'échantillon, commencez par exciser la fenêtre cambiale de la tige en éliminant tout tissu qui ne fait pas partie de la nouvelle croissance. Pour les études portant sur la morphologie des cellules ou des tissus du xylème et du phloème matures, séparez le phloème du xylème.Alternativement, pour les études nécessitant que la zone cambiale reste intacte ou que les profils d'expression des promoteurs soient évalués, sectionner transversalement la fenêtre cambiale à l’aide d’un rasoir afin d’obtenir des disques d’une épaisseur comprise entre 0,5 et un millimètre. Placer les tissus de la fenêtre cambiale récoltés dans des tubes individuels de fond rond de 14 millilitres et rincer deux fois dans un tampon phosphate 0,1 molaire à pH 7 pendant cinq minutes à chaque fois, en veillant à ce que le tissu soit complètement immergé. À la fin du deuxième rinçage, veiller à éliminer tout excès de solution.Ensuite, ajoutez cinq millilitres de réactif GUS dans chaque tube. Si cela ne recouvre pas complètement l'échantillon de tissu, ajoutez du réactif supplémentaire. Incubez les tubes pendant dix minutes à 55 degrés Celsius à l'abri de la lumière.Après cela, incubez les tubes pendant encore 12 à 16 heures sur un agitateur à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière, en utilisant une agitation douce. Après avoir retiré les tubes de l’incubateur, prélève un sous-ensemble aléatoire des tubes et vérifie le pH du réactif GUS à l’aide du papier tournesol dont la plage de pH est comprise entre zéro et sept. Si l’un d’eux présente un pH inférieur à six, étiquette-les et vérifie le reste des tubes.Étiquetez et excluez tous les tubes dont le pH est inférieur à six. Versez le réactif GUS hors des tubes et remplacez-le par suffisamment d'éthanol à 70 pour cent pour recouvrir le tissu. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.À l’aide d’une paire de forceps propre, retirer tout le tissu de la fenêtre cambiale d’un tube d’échantillon et le placer sur un petit plateau ou une boîte de Pétri pour une visualisation microscopique. Placer l’échantillon sous l’objectif d’un microscope stéréoscopique avec un grossissement compris entre 1X et 4X, puis identifier et comptabiliser le nombre de cellules ou de tissus présentant une coloration bleu vif. Dans les cas où le phloème a été retiré, compter le nombre de secteurs présents dans le tissu cambial observés à la surface du xylème en développement.Pour les échantillons découpés en disques, compter le nombre de secteurs présents dans les différents types cellulaires ou tissulaires. S'assurer d'examiner les deux faces du disque et d'apparier les secteurs traversant deux disques afin d'éviter toute surestimation du nombre. Ne replacer dans le tube contenant de l'éthanol à 70 pour cent que le tissu présentant des secteurs, puis conserver jusqu'à utilisation.Répétez l'analyse pour toutes les fenêtres cambiales supplémentaires récoltées, y compris les témoins positifs et négatifs. Pour faciliter l'identification précise des secteurs lors de leur classification, nous vous conseillons de vous familiariser avec l'anatomie et le développement secondaires de la tige, ainsi qu'avec les réponses de la tige aux blessures. Cette figure montre plusieurs transformations réussies, visibles ici comme des régions de coloration bleue.Un exemple de fenêtre de prélèvement du phloème montre plusieurs secteurs transformés, et des disques récoltis sur deux espèces d'arbres présentent des secteurs de transformation ainsi qu'une croissance radiale ultérieure. On peut également observer la transformation dans divers types de tissus. Ici, des secteurs caulinaire sont visibles dans le périderme, le phloème, le parenchyme de blessure et plusieurs autres régions tissulaires du peuplier blanc.Cette image montre les résultats de l'expression de promoteurs génétiques dans les dérivés cambiaux. Dans cet exemple, on observe la proportion de coloration dans chaque type de tissu lors d'un essai impliquant une série de promoteurs CesA d'Eucalyptus grandis transformés dans des tiges d'hybrides d'eucalyptus. L'expression dans le phloème, ainsi que dans les xylèmes en développement et différenciés, est exprimée en pourcentage.Le nombre moyen d'événements de transformation par centimètre de cambium inoculé peut également être calculé pour chaque promoteur ou gène d'intérêt. Ce tableau présente les données relatives aux secteurs typiques identifiés chez des sujets eucalyptus et peuplier transformés avec un contrôle positif ou un promoteur d'intérêt, analysés à l'aide de la méthode de récolte par disques. Une fois maîtrisée, cette technique peut fournir une méthode rapide, efficace et largement applicable pour analyser la nature complexe de la différenciation cambiale lors de la formation du développement secondaire de la tige.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des plantes et des bactéries, de la transformation, de la culture et de la récolte des tiges, ainsi que de l’identification et de la classification des tissus transgéniques pour l’évaluation phénotypique.

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