Méthodes pour l'isolement, la culture et la caractérisation fonctionnelle des sinoatrial Node myocytes de souris adultes

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des myocytes de ganglions sino-auriculaires spontanément actifs de souris pour des expériences électrophysiologiques ou d’imagerie à court ou moyen terme. Les myocytes isolés du ganglion sino-auriculaire sont importants pour l’étude des mécanismes de stimulation cardiaque, en particulier l’étude des courants ioniques spécifiques ou du moment de la libération intracellulaire de calcium. Mais relativement peu de laboratoires utilisent des myocytes sino-auriculaires isolés de souris, en partie parce qu’il est très difficile d’apprendre la procédure à partir de méthodes écrites seules.

Après avoir préparé toutes les solutions requises pour l’isolement, retirez la fourrure de la poitrine de l’animal avec des ciseaux. Ensuite, transectez la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique à l’aide d’une pince à tissu externe et de ciseaux de dissection. Rincez la cavité thoracique avec deux millilitres de Tyrode complet réchauffé avec de l’héparine.

Sous un microscope à dissection, retirez soigneusement les poumons et le thymus à l’aide de ciseaux internes et d’une pince à dissection. Tout en tenant doucement l’apex du cœur, coupez soigneusement la veine cave inférieure et l’aorte pour retirer le cœur de la cavité thoracique. Transférez ensuite le cœur dans l’une des boîtes de dissection en silicone, puis rincez-le avec deux à quatre millilitres de Tyrode complet hépariné réchauffé.

Orientez le cœur de manière à ce que les vaisseaux postérieurs soient visibles et tournés vers le haut. Ensuite, immobilisez le cœur en le coinçant à travers l’apex dans le plat de dissection en silicone. Ensuite, localisez le sillon entre les ventricules et les oreillettes.

À l’aide des ciseaux de dissection interne, faites une incision au niveau de la rainure tout en la maintenant près des ventricules. Rincez la rainure et l’incision avec des Tyrode complets héparinés réchauffés supplémentaires au besoin pour permettre une vue claire des oreillettes et des valves. Continuez ensuite à couper le long du sillon pour séparer les oreillettes des ventricules.

Par la suite, transférez le tissu auriculaire dans la deuxième boîte de dissection en silicone et rincez-le avec trois millilitres de Tyrode complet hépariné réchauffé. Ensuite, tout en étirant doucement la préparation, épinglez le tissu à travers la veine cave inférieure. Ensuite, retournez le tissu de sorte que l’oreillette droite de l’animal soit maintenant du côté gauche de l’expérimentateur et que l’oreillette gauche soit du côté droit de l’expérimentateur.

Il est très important d’obtenir et de reconnaître l’orientation afin d’isoler le bon tissu. Procédez à l’épinglage du tissu à travers la veine cave supérieure, puis les appendices auriculaires droit et gauche. Retirez tout reste de graisse ou d’autre tissu pour permettre une vue claire de la préparation.

Par la suite, ouvrez la paroi antérieure des oreillettes en coupant à travers les veines caves. Tournez le plat si nécessaire pour disséquer à la fois les veines caves supérieures et inférieures. Repositionnez les broches si nécessaire pour visualiser le septum interauriculaire.

Coupez ensuite le long du septum interauriculaire pour retirer l’oreillette gauche. Épinglez à nouveau la préparation, étirez-la doucement et retirez la graisse de derrière le nœud sino-auriculaire. Après cela, retirez l’appendice auriculaire droit, puis libérez le nœud sino-auriculaire en coupant le long de la crête terminale qui apparaît comme une traînée orange foncé bordant l’appendice auriculaire.

Épinglez ou détachez le tissu ganglionnaire et coupez-le latéralement pour produire trois bandes de taille égale. Dans cette procédure, à l’aide de la pipette étroite polie au feu, transférez trois bandes de tissu de ganglion sinuso-auriculaire dans le premier des trois petits tubes à fond rond contenant 2,5 millilitres de Tyrode à faible teneur en calcium et en magnésium et incubez pendant cinq minutes. Après cinq minutes, transférez les bandelettes de tissu dans le deuxième petit tube à fond rond contenant 2,5 millilitres de Tyrode à faible teneur en calcium et en magnésium.

Lavez les bandelettes de tissu en faisant tourner doucement le tube ou en pipetant doucement avec la pipette étroite. Ne retournez pas le tube. Transférez ensuite les bandes de tissu dans le troisième petit tube à fond rond contenant 2,5 millilitres de Tyrode à faible teneur en calcium et en magnésium et répétez l’étape de lavage.

Ensuite, transférez les bandelettes dans le grand tube à fond rond contenant 2,5 millilitres de Tyrode à faible teneur en calcium et en magnésium avec des enzymes. Mélangez toutes les cinq minutes en remuant doucement le tube. Après la digestion enzymatique, à l’aide d’une pipette étroite polie au feu, transférez délicatement les bandes de tissu dans le premier des trois petits tubes à fond rond contenant une solution de KB modifiée.

Transférez ensuite les bandelettes à travers les deuxième et troisième petits tubes à fond rond pour laver le tissu avant de les transférer dans le grand tube à fond rond qui contient la solution KB. À l’aide de la pipette polie au feu plus grande, dissociez les cellules du grand tube à fond rond par trituration constante, en prenant soin de garder le tube de dissociation immergé dans le bain-marie à 35 degrés Celsius et d’éviter d’introduire des bulles dans la solution. Nous avons constaté qu’une expulsion forcée de la solution à une fréquence d’environ un par seconde ou un Hertz fonctionne le mieux.

Ajoutez maintenant 75 microlitres de solution d’adaptation de chlorure de sodium et de chlorure de calcium aux tissus. Remuez doucement pour les mélanger et incubez pendant cinq minutes. Continuez à ajouter du calcium par paliers comme indiqué dans le protocole écrit.

Après la réadaptation calcique, prélever les myocytes sino-auriculaires en les laissant se stabiliser pendant environ 10 minutes ou par centrifugation à 2 000 fois g pendant trois minutes. Pour les cellules isolées de manière aiguë, retirer délicatement et jeter environ cinq millilitres de surnageant à l’aide d’une pipette de transfert. Ensuite, conservez les cellules à température ambiante jusqu’à huit heures pour des expériences de patch clamp.

Par la suite, des évaluations fonctionnelles des myocytes sino-auriculaires isolés peuvent être effectuées à l’aide d’enregistrements par patch clamp pour les potentiels d’action spontanés et les courants membranaires. Les myocytes sino-auriculaires spontanément actifs peuvent être maintenus en culture jusqu’à six jours. Les cellules cultivées conservent une morphologie globale très similaire à celle des myocytes sinoauriculaires isolés de manière aiguë, sans changement significatif de la longueur moyenne, de la largeur, de la section transversale ou de la capacité membranaire des cellules cultivées par rapport aux cellules isolées de manière aiguë.

Les cellules sont adaptées à une gamme d’études expérimentales telles que les enregistrements de pinces de courant et de tension. À titre d’exemples, on peut citer les potentiels d’action spontanée et le courant amusant. Une fois maîtrisés, le curage ganglionnaire sino-auriculaire, l’isolement et la réintroduction du calcium peuvent être terminés en deux heures environ afin que vous puissiez avoir des cellules prêtes à partir pour vos expériences.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’orientation du tissu est essentielle pour une bonne dissection et que les étapes de dissociation enzymatique et mécanique doivent être optimisées comme indiqué dans le texte. À la suite de cette procédure, les myocytes isolés du ganglion sino-auriculaire peuvent être utilisés pour une variété d’expériences, notamment l’électrophysiologie unicellulaire, l’imagerie calcique et l’immunocytochimie. Les cellules peuvent également être maintenues en culture pour des expériences nécessitant une manipulation génétique ou l’expression de molécules rapporteures.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les myocytes sino-auriculaires des souris adultes. Bonne chance dans vos expériences.