Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage

L’objectif global de cette méthode est de permettre la réalisation d’expériences de sauvetage par épuisement dans des conditions qui préservent l’intégrité cellulaire et l’homéostasie des protéines. Pour l’analyse fonctionnelle des processus biologiques au niveau de la cellule unique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les fonctions des protéines et les exigences de structure dans la dynamique cellulaire telles que la mitose et la différenciation cellulaire.

Le principal avantage de cette technique est d’appauvrir une protéine d’intérêt et de réintroduire en même temps une variante de cette protéine au niveau néo physiologique dans une mesure d’une population cellulaire. Commencez par enduire les plats à fond de verre de fribronectine. Pour ce faire, diluez un milligramme par millilitre de firbronectine stock un à 100 avec du PBS stérile.

Ajoutez un millilitre dans chaque plat de 35 millilitres pour couvrir toute la surface. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Au cours de l’incubation, le préchauffage de l’alpha MEM a été complété par 10 % de FBS et une aliquote de 0,05 % de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius.

Après 45 minutes d’incubation, commencez à préparer la solution cellulaire. Aspirez le fluide à partir d’une plaque de 10 centimètres de cellules HeLa RFP H2B. Et rincez doucement deux fois avec 1,5 millilitres de 0,05 % de trypsine EDTA.

Laissez 0,5 millilitre de trypsine EDTA sur la plaque après la dernière aspiration. Et incubez les cellules pendant deux à trois minutes à 37 degrés Celsius. Et 5 % de dioxyde de carbone.

Tapotez doucement la plaque. Et observez la couche cellulaire au microscope pour vérifier que toutes les cellules ont été détachées. Ajoutez ensuite 10 millilitres de fluide et pipetez doucement plusieurs fois pour séparer les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Comptez un échantillon de 10 microlitres de suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, aspirez la solution de fibronectine des plats à fond de verre. Ne laissez pas la fibronectine sécher avant le placage cellulaire.

Préparez une solution de suspension cellulaire pour plaquer 1,5 fois dix à la cinquième cellules par boîte de 35 millimètres dans deux millilitres de milieu. Plaque : une plaque de 35 millimètres en plus du nombre de conditions afin de compter le nombre de cellules avant la transduction du virus. Incuber pendant 30 à 45 minutes.

Une fois le temps d’incubation écoulé, vérifiez les cellules au microscope pour vous assurer qu’elles sont bien séparées. Comme on le voit ici. Remettez les plaques dans l’incubateur et faites pousser les cellules jusqu’au lendemain.

Le lendemain de l’ensemencement, assurez-vous que les cellules ont atteint la densité d’au moins 50 %Une densité cellulaire inférieure à 50 % entraîne une diminution de l’efficacité de la transduction du virus. Augmentation de la variation de l’expression des protéines par cellule et augmentation de la toxicité cellulaire. Récoltez ensuite les cellules du plat supplémentaire comme précédemment.

Et comptez le nombre de cellules. Calculez le volume de virus nécessaire à une transduction efficace des cellules. Étiquetez un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour chaque condition.

Et ajoutez 400 microlitres d’alpha MEM chaud moins. Après avoir décongelé lentement les aliquotes des virus sur de la glace, ajoutez le volume requis de chaque virus dans les tubes et mélangez doucement par pipetage. Ensuite, après avoir aspiré le milieu des cellules, ajoutez doucement le mélange de virus goutte à goutte.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Toutes les 15 minutes pendant une période d’une heure, agitez soigneusement les plaques sous le capot stérile pour couvrir les cellules avec le virus. L’utilisation d’une petite quantité de milieu facilite le contact du virus avec les cellules.

Après l’incubation, pipetez doucement 1,6 millilitres d’alpha MEM moins à chaque plaque pour obtenir un volume total de deux millilitres. Ensuite, commencez la synchronisation cellulaire en ajoutant deux millimolaires de thymidine avant d’incuber les cellules pendant deux heures supplémentaires. Pendant ce temps, préparez le mélange de transfection de siRNA en ajoutant dans un microtube 139 microlitres d’eau stérile, 50 microlitres de chlorure de calcium molaire et 11 microlitres de 20 micromolaires de siRNA.

Si aucun ARNi n’est nécessaire, remplacez la quantité d’ARNi par de l’eau stérile pour effectuer une transfection à vide. Ajouter la solution HBSS2X goutte à goutte lentement sur le mélange de chlorure de calcium siRNA. Mélanger délicatement deux fois par injection d’air à l’aide d’une pipette de 200 microlitres.

Comme les précipités plus petits, ils améliorent l’efficacité de la transfection. Ensuite, incubez le mélange pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, ajoutez lentement 200 microlitres goutte à goutte dans chaque assiette et agitez pour mélanger.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 16 heures. Le lendemain, retirez les plats de l’incubateur et transportez-les dans une hotte de culture de tissus. Après avoir rincé les cellules deux fois avec deux millilitres de hipis chauds, ajoutez deux millilitres d’alpha MEM moins avant de retourner dans l’incubateur.

Sept heures plus tard, ajoutez deux millimolaires de thymidine dans les assiettes avant de les remettre dans l’incubateur. Travaillez avec un maximum de quatre plaques cellulaires à la fois, car les variations de température affectent la durée du cycle cellulaire. Le lendemain, 48 heures après la transfection de siRNA et l’infection virale, rincez deux fois les cellules avec deux millilitres de PBS chaud, puis ajoutez deux millilitres d’alpha MEM sans rouge de phénol pour l’imagerie de cellules vivantes.

Incuber pendant sept heures. Réaliser des expériences d’imagerie de cellules vivantes à court terme sur des cellules mitotiques à l’aide d’un microscope inversé équipé d’une chambre thermorégulée humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone. Avant l’acquisition, vérifiez que la chambre a atteint la température appropriée de 37 degrés Celsius.

Placez les boîtes de culture dans la chambre du microscope une heure avant l’acquisition pour permettre un bon équilibre du milieu et éviter la dérive de la mise au point due aux changements de température. Examinez l’état mitotique des cellules. À ce stade.

10 à 15 % des cellules doivent être aux premiers stades de la mitose. Pendant le temps d’équilibrage, réglez les paramètres d’acquisition tels que déterminés dans les expériences précédentes. Il est important d’obtenir une résolution appropriée sans blanchiment photo.

Comme cela provoque des dommages cellulaires et perturbe la progression mitotique. Choisissez plusieurs champs contenant des cellules qui sont à l’entrée mitotique par condition pour obtenir un nombre significatif de cellules à analyser sans dépasser l’intervalle d’acquisition. Une fois que tous les champs ont été choisis, réinitialisez le focus et commencez l’acquisition le plus rapidement possible.

L’utilisation d’un disque rotatif peut faire la mise au point du système. Une configuration typique comprendrait quatre conditions différentes. Sept champs par plaque.

Et deux canaux couleur avec un intervalle de 1,5 à deux minutes sur une période de 75 minutes. Déterminer des critères bien définis pour analyser les phénotypes mitotiques dans les cellules, qui dépendront des marqueurs fluorescents utilisés. Contrairement à la transfection de BAG3 GFP, l’ADN plasmique, comme on le voit à gauche, l’adénoflexion avec des adénovirus recompétents montrés ici à droite permet une expression plus homogène et plus efficace de BAG3 GFP.

Dans la majorité de la population cellulaire à une faible multiplicité d’infection. Ce western blot représentatif montre que l’adénoflexion avec des siARN spécifiques de BAG3 et l’adénovirus BAG3 GFP recompotent permet une déplétion efficace de BAG3 endogène et la réintroduction de la protéine GFP BAG3 à des niveaux proches de l’endogène. Comme le montre ici, l’adénoflexion peut préserver l’homéostasie des protéines car il n’y a pas d’augmentation détectable des niveaux de protéines de choc thermique induites par le stress dans les cellules HeLa qui ont été adénocuecées.

Contrairement aux cellules HeLa traitées avec l’inducteur de stress protéotoxique, MG132. Ici, nous voyons que la progression des cellules à travers la mitose n’est pas significativement perturbée par l’adénoflexion comme le montrent ces images confocales en accéléré de cellules HeLa adénopectées avec un siRNA témoin et BacMam GFP alpha Tubuline. et BacMam FRP Actin.

Le graphique indique la proportion de cellules présentant une mitose anormale. Les cellules adénopectées avec des siRNA spécifiques de BAG3 seuls présentaient une augmentation d’environ deux fois du niveau de défauts mitotiques. Comme le montre la barre rouge.

Qui a été restauré près du niveau de la cellule de contrôle par la réintroduction de BAG3 GFP indiqué par la barre noire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de sauvetage par épuisement à l’aide de l’adénoflexion. Cette méthode fournit un système simple et rapide pour créer des knock downs hypomorphes pour l’analyse de la fonction de la structure dans plusieurs arrière-plans cellulaires.

En suivant cette méthode, les exigences structurelles clés sur la protéine d’intérêt pour une fonction donnée peuvent être identifiées. D’autres approches d’édition du génome peuvent ensuite être utilisées pour approfondir les mécanismes impliqués.