Name: Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Découvrez l'adénofection pour réaliser des expériences d'épuisement-sauvetage préservant l'intégrité cellulaire et l'homéostasie protéique. Cette méthode permet d'analyser les fonctions protéiques au niveau unicellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé du Canada (subvention n° 7077), ainsi que par la Fondation Bellini et la Fondation Roby.

<ol><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+IL-8+expression+following+adenovirus+infection+is+mediated+by+c-Src+activation+in+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts.</a> J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).</li>
<li>Yousuf, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+associated+adenovirus+entry+into+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells.</a> PLoS One. 8 (10), e77462(2013).</li>
<li>Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+regulates+epithelial+cell+junction+stability+through+control+of+E-cadherin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking.</a> Sci Rep. 3, 2889(2013).</li>
<li>Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+chaperone+activity+toward+poly%28Q%29-containing+proteins+depends+on+its+association+with+Bag3%2C+a+stimulator+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy.</a> J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+key+structural+motifs+involved+in+HspB8%2FHspB6-Bag3+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction.</a> Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).</li>
<li>Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAG3%3A+a+multifaceted+protein+that+regulates+major+cell+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways.</a> Cell Death Dis. 2, e141(2011).</li>
<li>Guilbert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuilbert%2C+SM+%22The+Big+Book+of+Small+Heat+Shock+Proteins%22">The Big Book of Small Heat Shock Proteins</a>. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexes+of+adenovirus+with+polycationic+polymers+and+cationic+lipids+increase+the+efficiency+of+gene+transfer+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).</li>
<li>Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+polymer+and+lipids+enhance+adenovirus-mediated+gene+transfer+to+rabbit+carotid+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery.</a> Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+adenovirus+in+calcium+phosphate+precipitates+enhances+gene+transfer+to+airway+epithelia+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo.</a> J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+the+Chaperone+Complex+BAG3-HSPB8+in+Actin+Dynamics%2C+Spindle+Orientation+and+Proper+Chromosome+Segregation+during+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005582(2015).</li>
<li>Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenovirus+type+2+early+region+4+ORF4+cytoplasmic+death+function+by+direct+binding+to+Src+kinase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain.</a> J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Takahashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Akt+signaling+regulates+blood+vessel+recruitment+during+myofiber+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth.</a> Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).</li>
<li>Murray, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-apoptotic+role+for+caspase-9+in+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).</li>
<li>Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Wnt+Signaling+with+BMP%2FSmad+Signaling+during+the+Transition+from+Cell+Proliferation+to+Myogenic+Differentiation+in+Mouse+Myoblast-Derived+Cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells).</a> Int J Cell Biol. 2013, 616294(2013).</li>
<li>Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+in+mammalian+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion.</a> Sci Signal. 6 (272), re2(2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous avons décrit un procédé permettant des expériences d&#39;appauvrissement de sauvetage à effectuer, qui est applicable à l&#39;analyse fonctionnelle des processus biologiques cellulaires qui sont particulièrement sensibles à la surexpression de protéines qui affectent la stoechiométrie et la dynamique des complexes protéiques et des structures macromoléculaires. la division cellulaire mitotique est un exemple extrême de morphodynamique cellulaires finement réglé qui implique les changements les plus spectaculai...

l&#39;inactivation fonctionnelle de l&#39;expression génique dans des cellules de mammifères est l&#39;étalon-or pour disséquer les fonctions des protéines. Nouvellement développé des technologies de l&#39; édition du génome basé sur l&#39;utilisation des nucléases spécifiques au site tels que des nucléases à doigt de zinc et en grappes régulièrement espacées répétitions palindromiques courtes (CRISPR) / cas9 permettent maintenant la génération de lignées cellulaires avec délétion du gène ciblé et la mutation 1,2. Ces nouvelles approches devraient révolutionner la façon dont nous sommes en train d&#39;étudier la fonction des protéines et notre compréhension de la génétique des maladies humaines. Dans certains cas, cependant, à long terme ou knockout gène complet ne sont pas souhaitables et peuvent provoquer des mécanismes de compensation des cellules secondaires. La génération de lignées cellulaires génétiquement modifiées peuvent aussi être limitatifs en traitant des cultures de cellules primaires avec une capacité de prolifération limitée, ou lors de la projection d&#39;un grand nombre de mutations dans divers types cellulaires est recherchée. Ceci est souvent nécessaire pour déterminer la dépendance d&#39;une cellule bprocessus iologiques sur les exigences structurelles d&#39;une protéine. À cette fin, knockdown réversible par interférence ARN qui permet transitoires expériences déplétion sauvetage dans divers milieux cellulaires reste encore une approche simple et puissant pour effectuer des analyses structure-fonction d&#39;une protéine d&#39;intérêt 3. Cependant, un inconvénient majeur de cette approche est la difficulté à atteindre le silençage efficace et de réintroduire la protéine d&#39;intérêt ou de ses variantes à des niveaux proches physiologiques dans une majorité de la population de cellules. Ceci est crucial pour permettre des études approfondies qui tentent d&#39;établir une corrélation entre les effets fonctionnels observés au niveau des cellules individuelles (phénotype hypomorphic) avec ceux observés dans les essais basés sur la population de cellules, par exemple sur les interactions protéine-protéine. En utilisant des méthodes de transfection classiques, on peut difficilement obtenir une expression homogène et faible de protéines exogènes dans une grande population de cellules. Transduction des cellules avec des virus recombinantscomme adenovirus permet souvent une expression plus normalisée de protéines exogènes. Or, l&#39;absorption d&#39;adénovirus est limitée par le récepteur CAR, qui est absente dans les cellules non humaines ou seulement faiblement exprimé dans certains types de cellules humaines. En outre, l&#39;entrée cellulaire des adénovirus active des voies qui régulent la forme des cellules et l&#39; adhérence 4-6 signalisation. Ceci est évidemment pas souhaitable lors de l&#39;étude des mécanismes de régulation de la morphodynamique cellulaires. Nous avons été confrontés à cette problématique lorsque nous avons entrepris des analyses fonctionnelles d&#39;un complexe de chaperon, BAG3-HSPB8, dans la division cellulaire et de la dynamique de l&#39;actine. Un travail de pionnier a décrit un rôle pour ce complexe chaperon en protéines contrôle de la qualité et de l&#39; autophagie au cours du stress 7,8. La plupart de ces études, cependant, appuyé sur surexpression de la protéine, en supposant que les chaperons sont normalement régulés à la hausse au cours du stress. Cela a laissé ouverte la question de savoir si BAG3, dans un complexe avec HSPB8, peut contribuer à l&#39;exploitation normale des cellules en division exprimant echaperons ese comme de nombreux types de cellules cancéreuses 9. En particulier, si le complexe chaperon contribue au remodelage des structures à base de l&#39; actine qui contrôlent la progression mitotique était d&#39; un grand intérêt, étant donné les liens émergents entre chaperons hspB et la dynamique du cytosquelette 10. Pour résoudre ce problème, nous cherchions à développer une méthode efficace pour les expériences déplétion de sauvetage qui ne serait pas interférer avec la progression mitotique ou la morphologie cellulaire, et qui préserverait la protéine homéostasie pour éviter une perturbation secondaire de la dynamique des complexes macromoléculaires de régulation des changements de cellules forme . Ainsi, idéalement, l&#39;épuisement-add-back du gène d&#39;intérêt doit être réalisée simultanément. L&#39;utilisation de complexes d&#39;adénovirus avec un polymère cationique ou de lipides a été décrite pour favoriser le transfert de gènes in vitro et in vivo 11,12. Par exemple, le phosphate de calcium (ICPA) semble former un précipité avecadénovirus qui améliorent la liaison du virus d&#39;entrée par l&#39; intermédiaire d&#39; une voie de CAR-indépendante 13. En effet, nous avons constaté que la combinaison de transduction et de transfection cellulaire à base d&#39;adénovirus avec des composés cationiques, pourrait améliorer l&#39;efficacité des expériences d&#39;appauvrissement de sauvetage. Cela nous a permis d&#39;abaisser les quantités de virus par 3 à 20 fois, en fonction de la lignée cellulaire et le gène d&#39;intérêt, et de bénéficier d&#39;une fenêtre plus large afin d&#39;ajuster l&#39;expression de protéines exogènes à des niveaux proches endogènes dans la majorité d&#39;une population de cellules d&#39;intérêt avec un impact minimal sur la morphologie cellulaire. Dans ces conditions, on pourrait aussi obtenir une grande knockdown de l&#39;efficacité de l&#39;expression de protéine endogène (&gt; 75%). Nous décrivons par la présente l&#39;étape de procédé par étape et fournir la preuve que la protéine homéostasie est pas significativement perturbée évaluée par les niveaux inchangés de chaperons induites par le stress de la famille des protéines de choc thermique, ce qui rend la méthode appropriée pour les analyses fonctionnelles de la ro physiologiquele des chaperons moléculaires par time-lapse vidéo microscopie. Le protocole se prête à une procédure de synchronisation de cellule et à l&#39;utilisation de baculovirus disponibles dans le commerce pour la co-expression de faibles taux de marqueurs fluorescents, avec un minimum d&#39;interférence avec la dynamique à base d&#39;actine et de la broche normale lors de la progression mitotique. Nous montrons en outre la versatilité de la méthode, qui est applicable à «difficile à transduction&quot; cellules C2C12 de souris, sans impact significatif sur la différenciation des myoblastes en myotubes in vitro.

<table><tbody><tr><td>C2C12 Myoblastes de souris</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Adénovirus conception personnalisée</td><td>Welgen</td><td>Conception</td><td></td>personnalisée</tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg ; Actin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg ; Tubulin-RFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM), High Glucose</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Plats à fond en verre, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Cas</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Aimable don du Dr Sabine Elowe, Qu&eacute ; bec, Canada</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum pour cheval, Nouvelle-Zélande</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg ; Réactif de transfection RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Milieu essentiel minimal (MEM) Alpha</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Milieu essentiel minimal (MEM) Alpha sans désoxyribonuleosides/ribonucléosides</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Milieu essentiel minimal (MEM) Alpha sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA duplex</td><td>Dharmacon</td><td>Custom design</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 2,5 %</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection: une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans cellular morphodynamique par experiments depletion-sauvetage

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

processus cellulaires tels que la mitose et la différenciation des cellules sont régis par des changements dans la forme des cellules qui reposent en grande partie sur une bonne remodelage des structures du cytosquelette cellulaire. Ceci implique l&#39;assemblage de démontage des structures macromoléculaires d&#39;ordre supérieur à une heure et l&#39;endroit donné, un processus qui est particulièrement sensible aux perturbations causées par la surexpression de protéines. Les méthodes qui peuvent préserver la protéine homéostasie et de maintenir la morphologie proche de la normale cellulaire sont hautement souhaitables pour déterminer la contribution fonctionnelle d&#39;une protéine d&#39;intérêt dans un large éventail de processus cellulaires. Transitoires expériences déplétion de sauvetage basés sur l&#39;interférence ARN sont des approches puissantes pour analyser les fonctions des protéines et des exigences structurelles. Cependant, la réintroduction de la protéine cible avec un écart minimum à son niveau physiologique est un véritable défi. Nous décrivons ici une méthode appelée adenofection qui a été développé pour étudier le rôle des chaperons moléculaires d&#39;unpartenaires d dans le fonctionnement normal des cellules en division et la relation avec l&#39;actine remodelage. Les cellules HeLa ont été épuisées de BAG3 avec duplex siRNA ciblant la région 3&#39;UTR. BAG3 protéines GFP étiqueté ont été réintroduites simultanément dans&gt; 75% des cellules en utilisant des adénovirus recombinants couplés à des réactifs de transfection. Adenofection a permis d&#39;exprimer des protéines BAG3-GFP aux niveaux physiologiques proches dans les cellules HeLa appauvries de BAG3, en l&#39;absence d&#39;une réponse de stress. Aucun effet n&#39;a été observé sur les niveaux de endogènes chaperons de protéines de choc thermique, les principaux régulateurs inductibles par le stress de la protéine homéostasie. En outre, en ajoutant de baculovirus qui contrôlent l&#39;expression des marqueurs fluorescents, au moment de la transfection cellulaire de transduction, on peut disséquer la dynamique des cellules en mitose par microscopie time-lapse analyse avec une perturbation minimale de la progression mitotique normale. Adenofection est également applicable à des cellules difficiles à infecter la souris, et adaptés aux analyses fonctionnelles des myoblastes différentiation en myotubes. Ainsi adenofection fournit un procédé polyvalent pour effectuer des analyses structure-fonction de protéines impliquées dans les processus biologiques sensibles qui reposent sur la dynamique du cytosquelette d&#39;ordre supérieur.

La transfection de l&#39; ADN du plasmide GFP en utilisant BAG3-lipides cationiques a été associée à une expression hétérogène dans des cellules HeLa, des cellules présentant des niveaux à peine détectables de la protéine et d&#39; autres portant des niveaux de BAG3 très élevées (figure 2A). Dans ces cellules, la perte de protéine homéostasie a été mis en évidence par l&#39; accumulation de GFP-BAG3 en agrégats périnucléaires (figure 2A, flèches). En rev...

Nous décrivons une méthode pour les expériences de déplétion-sauvetage qui préserve l’intégrité cellulaire et l’homéostasie des protéines. L’adénoflexion permet des analyses fonctionnelles de protéines dans des processus biologiques qui reposent sur une dynamique basée sur l’actine finement ajustée, telle que la division cellulaire mitotique et la myogenèse, au niveau de la cellule unique.

Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

L'objectif général de cette méthode est de permettre la réalisation d'expériences de sauvetage par épuisement dans des conditions qui préservent l'intégrité cellulaire et l'homéostasie des protéines, afin d'effectuer des analyses fonctionnelles de processus biologiques au niveau de la cellule unique.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les fonctions des protéines et les exigences structurales dans la dynamique cellulaire, comme la mitose et la différenciation cellulaire. Le principal avantage de cette technique est d'épuiser une protéine d'intérêt tout en réintroduisant simultanément une variante de cette protéine à un niveau proche du niveau physiologique dans la majorité d'une population cellulaire.Commencez par recouvrir des boîtes à fond en verre avec de la fibronectine. Pour ce faire, diluez un stock de fibronectine à un milligramme par millilitre au 1/100 avec du PBS stérile.Ajouter un millilitre dans chaque boîte de 35 millilitres pour recouvrir toute la surface. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pendant l'incubation, préchauffer l'alpha MEM complété avec 10 % de FBS et un aliquot de 0,05 % de trypsine

adenofection-method-for-studying-role-molecular-chaperones-cellular

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans ce protocole, une méthode pour mesurer le repliement des protéines intracellulaires, après choc thermique est décrite. Cette méthode peut être utilisée pour étudier foldases comme chaperons moléculaires et leurs co-facteurs ou des composés capables d'influencer leur activité. Firefly activité luciférase est utilisée en tant que reporter pour mesurer l'activité de repliement chaperon.

Assay Repliement intracellulaire

Source : Dahl, J. et al. Détection de l’activité dépendante du pH d’Escherichia coli Chaperone HdeB In vitro et In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre un test basé sur un spectrophotomètre à fluorescence pour évaluer l’activité des chaperones sur une protéine substrat soumise à un stress acide et thermique. Il décrit les étapes pour surveiller le déploiement et l’agrégation du substrat par diffusion de la lumière, en comparant les conditions avec et sans le chaperon.

Évaluation de l’activité des chaperones bactériennes via le dépliement thermique d’une protéine modèle

Cet article décrit l'utilisation d'une protéine de fusion GFP-luciférase Firefly pour...

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Le contrôle de l’expression des protéines est non seulement essentiel à chaque organisme vivant, mais constitue également une stratégie importante pour étudier les fonctions des protéines dans des modèles cellulaires. Le protocole présenté montre l’application de l’interférence des anticorps dans les cellules de mammifères, y compris les neurones primaires de l’hippocampe, et démontre l’utilisation de reconstructions tridimensionnelles dans l’étude de la fonction des protéines.

Etudier la fonction des protéines et le rôle de Altered Expression des protéines par les interférences des anticorps et des reconstructions tridimensionnelles

Cette étude décrit les techniques biophysiques, biochimiques et moléculaires permettant de caractériser l'activité de chaperon d'Escherichia coli HdeB dans des conditions de pH acides. Ces méthodes ont été appliquées avec succès pour d'autres chaperons acide de protection tels que HdeA et peuvent être modifiés pour travailler pour d'autres chaperons et des conditions de stress.

Détection de l&#39;activité dépendant du pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; et<em&gt; In Vivo</em

Les auteurs décrivent comment les techniques micro - et photomanipulation comme FRAP et photoactivation permettent la détermination des paramètres de la motilité et la dynamique spatio-temporelle des protéines au sein de la migration des cellules. Afficheurs expérimentales incluent dynamique subcellulaire et chiffre d’affaires de régulateurs de la motilité ou du cytosquelette d’actine sous-jacent.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Une des conditions de stress plus difficiles que les organismes se rencontrent au cours de leur vie implique l’accumulation d’oxydants. Au cours du stress oxydatif, cellules s’appuient fortement sur chaperons moléculaires. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour enquêter sur l’oxydo-réduction-anti-agrégation activité réglementée, aussi bien quant à surveiller les changements structurels régissant la fonction d’accompagnateur à l’aide de HDX-MS.

Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange

Les protéines cognates du domaine J coopèrent avec le chaperon Hsp70 pour aider à une myriade de processus biologiques allant du pliage des protéines à la dégradation. Ici, nous décrivons un assay in situ de ligature de proximité, qui permet la surveillance de ces machineries de chaperon transitoirement formées dans les cellules bactériennes, de levure et humaines.

Surveillance in Situ des assemblages de chaperon moléculaire s'est formé de façon transitoire dans les bactéries, les levures et les cellules humaines

Pour étudier les interactions chaperon-chaperon et chaperone-substrat, nous effectuons des écrans d’interaction synthétique chez Caenorhabditis elegans en utilisant l’interférence ARN en combinaison avec des mutations légères ou une sur-expression des chaperons et surveillons le dysfonctionnement protéique spécifique des tissus au niveau de l’organisme.

Utilisation de Caenorhabditis elegans pour dépister les interactions tissulaires spécifiques des chaperons

Ce protocole décrit une batterie de méthodes qui comprend la chromatographie analytique taille-exclusion pour étudier l’oligomérisation et la stabilité des histones chaperones, le test pull-down pour démêler les interactions hiperon-histone, l’ASC pour analyser la stœchiométrie des complexes protéiques et le test de chaperonnage des histones pour caractériser fonctionnellement un chaperon histones putatif in vitro.

In vitro Caractérisation des chaperons de histones à l’aide d’essais analytiques, de rabattement et de chaperoning

Le rideau d’ADN, une technique d’imagerie à haut débit d’une seule molécule, fournit une plate-forme pour la visualisation en temps réel de diverses interactions protéine-ADN. Le présent protocole utilise la technique du rideau d’ADN pour étudier le rôle biologique et le mécanisme moléculaire d’Abo1, une ATPase AAA+ contenant du bromodomaine de Schizosaccharomyces pombe .

Déchiffrer le mécanisme moléculaire de l’assemblage des histones par la technique du rideau d’ADN

Découvrez l'adénofection pour réaliser des expériences d'épuisement-sauvetage préservant l'intégrité cellulaire et l'homéostasie protéique. Cette méthode permet d'analyser les fonctions protéiques au niveau unicellulaire.

Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage (Vidéo) | JoVE Journal

Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage

Explorer plus de vidéos