Name: In Vivo Transfert de gènes à des cellules de Schwann dans le nerf sciatique Rongeur par électroporation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Découvrez le transfert de gènes in vivo vers les cellules de Schwann du nerf sciatique chez le rongeur par électroporation. Cette méthode simple permet d'étudier les mécanismes moléculaires de la myélinisation et de la démyélinisation.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie à M.I. (21229004 et 25221304).

L&#39;utilisation de rats pour la recherche était conforme aux lignes directrices établies par le Comité de protection des animaux de l&#39;Université de Tokyo. 1. Préparation de l&#39;ADN plasmidique <ol><li> Générer des plasmides d&#39; ADN pour l&#39; électroporation in vivo par sous - clonage de l&#39;ADNc ou la séquence shRNA dans un plasmide d&#39;expression pour des cellules de mammifère 12. Utilisez un cytomegalovirus précoce immédiat amplificatrices et poulet β-actine promoteur fusion (CAG) promoteur induite par le plasmide 13 car il permet une expression forte et stable. Pour l&#39; expression de shRNA sous le contrôle d&#39;un promoteur CAG, utiliser un système de cassette shRNA base mir30-pour sous - cloner le shRNA 14. </li><li> On purifie l&#39; ADN de plasmide avec un kit Maxi-prep selon les instructions du fabricant, et remettre en suspension l&#39;ADN avec une solution saline tamponnée par HEPES (140 mM de NaCl, 0,75 mM de Na 2 HPO 4, HEPES 25 mM, pH 7,40). Ajuster la concentration de l&#39;ADN pour ≥ 4 pg / pl. </li><li&gt; Préparer la solution d&#39;ADN plasmidique à une concentration de 4 pg / pl, et ajouter une quantité minimale de colorant vert rapide (concentration finale de 0,01%) pour marquer le site d&#39;injection. Lors de l&#39;électroporation simultanée de plusieurs plasmides est nécessaire, ajuster la concentration totale de la solution d&#39;ADN plasmidique à 4 pg / pl. Remarque: La composition optimale de l&#39;ADN de plasmide doit être déterminée en fonction de l&#39;efficacité de transfection de chaque plasmide. </li></ol> 2. Stérilisation des instruments chirurgicaux et Saline <ol><li> des instruments chirurgicaux autoclave et la solution de NaCl à 0,9%. </li></ol> 3. Préparation du verre Micropipette <ol><li> Tirez pipettes de verre en utilisant un extracteur de pipette. Coupez la pointe de la pipette à un diamètre de 30-50 pm. Utilisez les paramètres suivants: Chaleur, 600; Velocity, 50; Temps, 75. </li></ol> 4. Chirurgie animale, injection d&#39;ADN et électroporation Note: Une plusFace à cette étape est décrite dans la figure 1. Bien que la procédure pour les bébés rats sont décrits ici, le procédé est également applicable à des animaux plus âgés qui utilisent la même procédure. <ol><li> Anesthésier le rat avec de l&#39;isoflurane dans la zone d&#39;induction jusqu&#39;à ce que l&#39;animal devient immobile en ajustant le débit d&#39;oxygène à 0,4 L / min et la concentration d&#39;isoflurane à 4% (vol / vol). Effectuer orteil pincement pour confirmer anesthetization bon. </li><li> Placez le rat sur le plus chaud préchauffé sous un microscope binoculaire, et maintenir une anesthésie en administrant en continu isoflurane à travers le masque. Ajuster le débit d&#39;oxygène à 0,2 L / min et la concentration d&#39;isoflurane à 2% (vol / vol). Utilisez des gouttes oculaires pour prévenir la sécheresse des yeux si les yeux de l&#39;animal sont ouverts. </li><li> Fixer les jambes avec du ruban adhésif chirurgical. </li><li> Nettoyer la peau sur la cuisse postérieure avec povidone-iode, et faire une incision avec un scalpel. Note: Rasez les zones chirurgicales si les zones chirurgicales sont recouvertes de hair. </li><li> Exposer le nerf sciatique en créant une ouverture entre les quadriceps femoris et muscle biceps fémoral avec des aiguilles à coudre. </li><li> Mouiller le nerf avec une solution de NaCl à 0,9%. Absorber l&#39;excès d&#39;eau avec du papier non pelucheux. </li><li> Insérez la base d&#39;une micropipette de verre sur un tube flexible, et remplir la quantité adéquate de solution d&#39;ADN (au moins un microlitre) dans la micropipette en aspirant doucement. </li><li> Soulevez le nerf exposé en tirant doucement sur le côté distal du nerf à l&#39;aide d&#39;une aiguille. Note: Ne pas appliquer une tension sur le nerf pour minimiser le stress mécanique. </li><li> Insérer la micropipette de verre dans le site distal du nerf, et injecter la solution d&#39;ADN par application d&#39;une pression (par exemple par soufflage dans l&#39;extrémité ouverte du tube flexible). Injecter la solution d&#39;ADN jusqu&#39;à ce que le nerf apparaît en vert (1 pi maximum). Parce que l&#39;insertion fréquente de la micropipette peut endommager le nerf, ne pas insérer la micropipette plus de deux fois. </li><li> Placer un tweezer type d&#39;électrode de platine d&#39;environ 1-2 mm en dehors du nerf. Remplir l&#39;espace entre l&#39;électrode et le culot avec une solution de NaCl à 0,9%. Remarque: Ne tenez pas le nerf avec l&#39;électrode pour éviter toute contrainte mécanique sur le nerf. </li><li> Appliquer des impulsions électriques sur le site d&#39;injection en utilisant une électroporation avec l&#39;électrode. Après la première série d&#39;impulsions, inverser l&#39;électrode et appliquer une autre série d&#39;impulsions. Utilisez les paramètres suivants: tension, 50 V; durée d&#39;impulsion, 5 ms; intervalle d&#39;impulsion, 100 msec; nombre d&#39;impulsions, 4 fois. </li><li> Nettoyez le site d&#39;électroporation avec une solution de NaCl à 0,9%. </li><li> Répétez les étapes 04.04 au 04.11 sur le nerf sciatique controlatéral. </li></ol> 5. Post-électroporation <ol><li> Fermer les incisions avec la colle cyanoacrylate. </li><li> Après séchage de la colle, nettoyer la plaie avec de la povidone-iode. </li><li> Relâchez le chiot à partir du masque. Chauffer le chiot sur un plus chaud au moins pendant une heure, afin de lui permettre de se rétablir complètement de l&#39;anesthésie. réo ne pas laisser le chiot sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait repris connaissance suffisante. </li><li> Après récupération de l&#39;anesthésie, retourner le chiot chez le rat mère. Ne pas retourner le chiot jusqu&#39;à guérison complète. </li></ol> 6. Post-chirurgie <ol><li> Maison des chiots de rat dans la cage jusqu&#39;à ce que la conduite des expériences 11 (voir les exemples dans la figure 3). Administrer carprofène (5 mg / kg; ip), un médicament non-stéroïdiens anti-inflammatoires, ou de la buprénorphine (0,1 mg / kg, sc), un analgésique opioïde, si nécessaire. Remarque: Si le chiot de rat ne pousse pas bien ou l&#39;inflammation est observée autour du site de la chirurgie, exclure l&#39;animal à partir des expériences. </li></ol>

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<li>Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat Commun. 2, 543(2011).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans cet article, nous décrivons une méthode simple et efficace qui permet le transfert de gènes in vivo vers des CS myélinisants dans le nerf sciatique du rat en utilisant l’électroporation. Cette méthode permet une expression génique hautement sélective dans les SC myélinisantes en appliquant simplement des impulsions électriques au nerf sciatique injecté dans l’ADN plasmidique. Parce que les mécanismes moléculaires de la myélinisation et de la démyélinisation dans le système nerveux périphérique restent incertains, la méthode actuelle d’électroporation in vivo sera un outil puissant pour clarifier les rôles de plusieurs gènes d’intérêt chez les animaux vivants.
Une exigence essentielle de cette méthode est de réduire au minimum les dommages au nerf pendant la chirurgie. Si des lésions chirurgicales provoquent une inflammation excessive, le nerf sciatique peut dégénérer. Pour éviter cela, il faut effectuer la chirurgie avec une extrême prudence, afin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins autour du nerf. Le stress mécanique sur le nerf pendant la chirurgie peut également être une cause de lésions nerveuses. Pour minimiser les contraintes mécaniques, le soulèvement du nerf exposé doit être effectué aussi doucement que possible, et l’électrode de type pince à épiler doit être placée près du nerf sans contact. De plus, des impulsions électriques trop fortes peuvent provoquer des mouvements indésirables de la jambe, ce qui entraîne un stress mécanique ou peuvent brûler le nerf. Si des dommages importants sont observés dans les nerfs, nous recommandons de réduire l’intensité des impulsions électriques ou de placer l’électrode plus loin du nerf.
Dans notre protocole actuel, des plasmides pilotés par des promoteurs CAG ont été utilisés comme vecteurs d’expression. Les plasmides pilotés par les promoteurs CAG permettent des niveaux élevés d’expression génique dans les SC myélinisants in vivo. Nous avons également essayé un promoteur CMV, un autre promoteur universel largement utilisé pour l’expression des gènes des mammifères, mais l’expression du produit génique était très faible. Ceci est cohérent avec les résultats précédents, dans lesquels la transfection médiée par électroporation a été effectuée dans le cerveau embryonnaire20. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser des plasmides pilotés par des promoteurs CAG pour la méthode d’électroporation in vivo .
Parce que la signalisation axonale est un facteur clé dans la myélinisation/démyélinisation21, la modification des gènes dans les neurones est également importante. Cependant, la livraison de transgènes à l’aide de notre méthode d’électroporation in vivo est limitée aux SC. Il a été rapporté que l’administration de gènes dans les axones du nerf sciatique peut être réalisée lorsque l’électroporation in vivo est appliquée aux neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) chez le rat adulte22. Cela suggère que l’administration d’ADN plasmidique au corps cellulaire est probablement essentielle pour la transfection in vivo des axones périphériques. Ainsi, pour examiner l’implication des molécules axonales dans la myélinisation/démyélinisation, les chercheurs devraient utiliser des méthodes génétiques spécifiques aux neurones telles que des animaux génétiquement modifiés, des vecteurs viraux spécifiques aux neurones ou l’électroporation in vivo aux neurones DRG.
Par rapport aux méthodes actuelles, telles que la génération de lignées animales génétiquement modifiées23 et l’administration de transgènes par des vecteurs viraux4 à 6, la modification génique des CS par électroporation in vivo est plus simple. Cette méthode ne nécessite que quelques jours pour la construction de l’ADN plasmidique et un jour pour la chirurgie d’électroporation. La construction de l’ADN plasmidique ne nécessite pas de salle de risque biologique qui est généralement essentielle pour la manipulation des vecteurs viraux. De plus, l’un des avantages de la méthode d’électroporation est la capacité d’expression simultanée de plusieurs produits géniques à l’aide d’un protocole simple. Notre nouvelle technique sera utile pour analyser l’interaction d’une variété de molécules de signalisation impliquées dans la myélinisation et la démyélinisation. En particulier, en permettant la cotransfection d’un certain nombre de sondes fluorescentes intracellulaires différentes, notre méthode devrait être un outil puissant pour étudier la dynamique de signalisation intracellulaire dans les SC à l’aide d’expériences d’imagerie en direct.

La transmission rapide des informations sensorielles et motrices dans le système nerveux périphérique est permise par la gaine de myéline, qui est formée par les cellules de Schwann myélinisantes (SC)1. L’isolation des axones par la gaine de myéline permet la conduction saltatoire, ce qui augmente la vitesse de l’influx nerveux. Dans les troubles dans lesquels le développement ou le maintien de la gaine de myéline est altéré, la vitesse de conduction nerveuse est réduite. Il en résulte une neuropathie impliquant un dysfonctionnement moteur et sensoriel. Bien qu’il existe de nombreuses études sur les mécanismes moléculaires de la myélinisation et de la démyélinisation dans le système nerveux périphérique, le rôle des nombreuses protéines impliquées dans ces processus reste incertain.
Pour étudier les mécanismes moléculaires de la myélinisation/démyélinisation des cellules souches souches in vivo, des approches génétiques ont été utilisées pour modifier l’expression des gènes chez les animaux. Une approche puissante est l’utilisation d’animaux knock-out/knockin ou transgéniques. Cependant, la génération de ces animaux est coûteuse et prend du temps. Pour la manipulation de gènes spécifiques à la SC, le croisement de souches floxées avec des souris Cre ou d’autres méthodes d’expression génique conditionnelle sont nécessaires. Encore une fois, c’est laborieux et chronophage. Ces dernières années, une technologie génétique de pointe, le système CRISPR-Cas9, a rendu la génération de souris génétiquement modifiées beaucoup plus rapide (environ 4 semaines)2,3, mais cette méthode est entravée par des limitations de séquences cibles et souffre d’effets hors cible. En tant que méthode alternative, le transfert de gènes par vecteur viral est une méthode plus rapide et plus facile pour réaliser le transfert de gènes dans des SC in vivo4-6. En effet, la génération de vecteurs viraux est moins coûteuse et prend moins de temps (en quelques semaines), et la manipulation génique des SC peut être réalisée en injectant simplement des vecteurs viraux modifiés, tels que des vecteurs adénoviraux, des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) et des vecteurs lentiviraux, dans le nerf sciatique. Étant donné que ces vecteurs viraux ont des caractéristiques différentes, les utilisateurs doivent choisir celui qui convient le mieux à leur objectif. Les vecteurs adénoviraux infectent les axones et les SC dans les nerfs sciatiques jeunes et matures. En particulier, les vecteurs adénoviraux ont une sensibilité sélective plus élevée pour les CS non myélinisants que pour les CS myélinisants. Les adénovirus peuvent provoquer des réponses immunitaires et, par conséquent, des souches immunodéficientes doivent être utilisées5. Les vecteurs AAV sont actuellement les vecteurs viraux les plus utilisés et permettent un transfert de gènes in vivo avec une toxicité plus faible7. L’AAV peut transduire à la fois les axones et les SC par injection directe dans les fibres nerveuses8,9. Cependant, l’expression des protéines médiée par l’AAV nécessite généralement 3 semaines ou plus pour atteindre les niveaux maximaux7,9. Par conséquent, il est difficile d’analyser la myélinisation, qui progresse activement pendant les deux semaines postnatales. Les vecteurs lentiviraux ont une sensibilité sélective plus élevée pour les CS myélinisants que les CS non myélinisants, et n’ont pas d’effets toxiques sur les nerfs sciatiques. Cependant, les vecteurs lentiviraux n’infectent pas les SC dans les nerfs plus matures5 et ne conviennent donc pas à l’analyse d’événements tels que le processus de démyélinisation.
Electroporation est une autre approche plus rapide et plus facile pour réaliser le transfert de gènes in vivo. Il a été rapporté que la transfection in vivo des SC peut être obtenue lorsque l’électroporation est appliquée sur les nerfs sciatiques de rat transectés10. Cependant, comme cette méthode nécessite une section nerveuse pour l’administration de gènes, l’application est limitée à l’analyse des nerfs endommagés. Ici, nous décrivons une méthode alternative qui permet l’administration de transgènes dans des CS myélinisants dans les nerfs sciatiques intacts du rat en utilisant l’électroporation11. Cette méthode nécessite la construction de plasmides, qui peut généralement être terminée en une semaine. Ensuite, en délivrant simplement des impulsions électriques au site du nerf sciatique où l’ADN plasmidique a été injecté, une transfection hautement sélective des SC myélinisants peut être obtenue chez les animaux néonatals ainsi que chez les animaux plus matures. En électroporant plusieurs plasmides, l’expression simultanée d’une variété de gènes peut être facilement réalisée. La capacité d’exprimer simultanément plusieurs molécules, telles que des protéines de signalisation, des ARN en épingle à cheveux courts (shRNA) et des sondes fonctionnelles, est cruciale pour étudier des processus complexes tels que la myélinisation et la démyélinisation. La nouvelle méthode d’électroporation in vivo décrite dans cet article sera un outil puissant, permettant aux chercheurs d’analyser la fonction d’une multitude de molécules et leurs interactions dans les SC myélinisantes.

<table><tbody><tr><td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td><td>Roche</td><td>03 143 422 001</td><td>Kit de purification d’ADN plasmidique</td></tr><tr><td>Fast Green CFC</td><td>WAKO</td><td>069-00032</td><td>Colorant pour injection d’ADN</td></tr><tr><td>GC 150T-10</td><td>HARVARD APPARATUS</td><td>30-0062</td><td>Capillaire en verre</td></tr><tr><td>Tube d’aspiration</td><td>Drummond</td><td>05-2000-00</td><td>Tube d’aspiration pour micro-injection</td></tr><tr><td>MODÈLE P-97</td><td>INSTRUMENT SUTTER Co.</td><td>Extracteur</td><td></td>de micropipette</tr><tr><td>CUY21 Single Cell</td><td>BEX</td><td>Électroporateur CUY21 Single Cell</td><td>Générateur d’impulsions</td></tr><tr><td>Réchauffeur électrique</td><td>KODEN</td><td>CAH-6A</td><td>Réchauffeur pendant la chirurgie</td></tr><tr><td>Isofluolane</td><td>Mylan</td><td>1119701G1076</td><td>Anesthésique</td></tr></tbody></table>

in vivo transfert de gènes à des cellules de schwann dans le nerf sciatique rongeur par électroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

La formation de la gaine de myéline par les cellules de Schwann (SC) est essentielle pour la conduction rapide de l’influx nerveux le long des axones du système nerveux périphérique. La manipulation génétique sélective par CS chez les animaux vivants est une technique puissante pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la myélinisation et de la démyélinisation par CS in vivo. Bien que les souris knock-out/knockin et transgéniques soient des outils puissants pour étudier la biologie de la SC, ces méthodes sont coûteuses et prennent du temps. L’introduction d’un transgène médié par un vecteur viral dans le nerf sciatique est une méthode plus simple et moins laborieuse. Cependant, les méthodes virales ont des limites, telles que la toxicité, les contraintes de taille des transgènes et l’infectivité limitée à certains stades de développement. Ici, nous décrivons une nouvelle méthode qui permet la transfection sélective des SC myélinisants dans le nerf sciatique du rongeur à l’aide de l’électroporation. En appliquant des impulsions électriques au nerf sciatique au site d’injection de l’ADN plasmidique, les gènes d’intérêt peuvent être facilement réduits au silence ou surexprimés dans les CS chez les animaux néonatals et plus matures. De plus, cette méthode d’électroporation in vivo permet une expression simultanée très efficace de plusieurs transgènes. Notre nouvelle technique devrait permettre aux chercheurs de manipuler efficacement l’expression du gène SC et faciliter les études sur le développement et la fonction des SC.

Un exemple d&#39;un nerf sciatique transfectées avec la protéine fluorescente rouge (RFP) exprimant le plasmide est représenté sur la figure 2A. Les cellules présentant une morphologie bipolaire, une caractéristique de SCs, ont été faiblement transfectées avec DP. Aucune fluorescence de DP a été détectée dans les axones. Nous trouvons généralement ~ 100 SCs transfectées dans chaque nerf. Cette efficacité de transfection semble similaire à l&#39;in vivo SC efficacité de l&#39; infection en utilisant des vecteurs lentiviraux 4. Expériences immunocoloration ont montré que la plupart (~ 96%) , les cellules de la DP-positif à P7 co-marquée pour S100, un marqueur de SC (figure 2B), et 91% des cellules de la DP-positif au P14 co-marquée pour PBM, un marqueur myélinisation SC (figure 2C), ce qui suggère que le transfert de gène par électroporation est hautement sélectif pour myélinisantes SC. L&#39;introduction de plusieurs gènes dans SCs <em&gt; in vivo sera extrêmement utile pour étudier les mécanismes de myélinisation / démyélinisation. Un avantage majeur de la méthode in vivo électroporation décrit ici est la capacité de transférer des gènes multiples avec une procédure simple. La figure 2D montre une image représentative d&#39;un nerf sciatique transfectées avec un mélange de GFP et des plasmides RFP exprimant en utilisant électroporation vivo. Environ 97% des SCs étaient GFP et RFP positive double, ce qui suggère que la livraison très efficace de gènes multiples peut être réalisée par électroporation simplement des mélanges de plusieurs plasmides. Chez les rongeurs, la myélinisation lance autour de la naissance, ce qui augmente de façon spectaculaire au cours des deux premières semaines après la naissance, puis diminue progressivement. Ainsi, en manipulant génétiquement SCs au cours de ces fenêtres de temps de développement, les mécanismes sous-jacents à ces différents stades de myélinisation peuvent être clarifiées. Les vecteurs lentiviraux sont un bon outil pour unenalyzing myélinisation, en particulier car ils ont une toxicité minimale, mais lentivirus seulement infecter néonatale nerfs sciatiques 5,6. A titre de comparaison, le transfert de gène à médiation par électroporation fonctionne bien lorsque la transfection est réalisée sur P3 (Figure 2E, partie supérieure) ou P14 (figure 2E, en bas). Les applications du roman dans la méthode d&#39;électroporation in vivo sont décrits ici. La figure 3A montre des images au microscope optique de GFP exprimant myélinisantes SCs à divers stades de développement (P7, P14, P21 et P31). Par l&#39;analyse au microscope optique, les changements de paramètres morphologiques, tels que la longueur et le diamètre, peuvent être évalués. A noter que ces paramètres ont des valeurs similaires par rapport aux rats intacts les nerfs périphériques 15,16, ce qui indique que les nerfs développent électroporées sans effets néfastes significatifs. La figure 3B montre une image au microscope électronique de LacZ expressing myélinisantes SCs. Dans ce cas, LacZ a été utilisé comme marqueur d&#39;expression. β-galactosidase en utilisant Bluo-gal, un substrat insoluble dans l&#39;éthanol, permet l&#39;analyse de la structure de la myéline SCs transfectées par microscopie électronique à 11,17. Dans ces expériences, le rôle des molécules de signalisation peut être examinée en faisant taire ou d&#39;augmenter leur expression, permettant ainsi à l&#39;analyse de la perte de fonction ou des effets de gain de fonction. En plus de l&#39;analyse des tissus fixés, in vivo , le transfert de gène à médiation par électroporation peut également être appliquée à vivre des expériences d&#39;imagerie. Par exemple, la figure 3C montre une myélinisation SC co-exprimant G-GECO1.1 18, un indicateur vert fluorescent cytosolique Ca 2+, et R-GECO1mt 19, un indicateur rouge fluorescent mitochondrial Ca 2+. En exprimant ces indicateurs, nous avons identifié une voie de signalisation qui contrôle cytosoliques et mitochondriales Ca 2+ concentrations dans myélinisantes SCs<html> . Ainsi, la présente méthode peut être utilisée pour étudier une variété de mécanismes de signalisation, en particulier lorsque des sondes fluorescentes génétiquement codés sont disponibles pour détecter les signaux d&#39;intérêt. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig1.jpg" /> Figure 1:. Schéma de l&#39;i ​​n vivo électroporation Méthode d&#39; abord, le nerf sciatique du rat anesthésié est exposé. En second lieu, l&#39;ADN du plasmide est injecté dans le nerf sciatique. Troisièmement, les impulsions électriques sont délivrées au site d&#39;injection à travers l&#39;électrode en forme de pince. Enfin, la plaie est fermée avec de la colle. Cette procédure peut être répétée sur le nerf controlatéral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig2.jpg" /> Figure 2: Les résultats représentatifs sur nerfs sciatiques transfectées (A) Une image représentative d&#39;un nerf sciatique transfectées.. Le nerf a été transfecté avec le plasmide de DP exprimant à P3, et fixé à P7. (B) Une image représentative d&#39;une cellule DP-transfectées à P7 montrant colocalisation avec S100, un marqueur de SC. (C) Une image représentative d&#39;un nerf sciatique DP-transfectées à P14 montrant colocalisation avec PBM, un marqueur myélinisation SC. (D) Une image représentative d&#39;un nerf sciatique cotransfectées avec la GFP et les plasmides de la DP-exprimant. SCs transfectées exprimés simultanément GFP et RFP. (E) Une image de myélinisation SCs à P31 transfectées à P3, lorsque la myélinisation commence ( en haut), et une image de SCs myélinisantes à P31 transfectées au P14, lorsque la plupart des grandes axones deviennent myélinisées ( en bas), ce qui suggère que transfection de SCs myélinisantes peut être atteint non seulement dans les nerfs néonatals, mais aussi dans les nerfs plus matures. Les barres d&#39;échelle = 200 pm (A); 50 pm (BE). Ce chiffre a été modifié à partir de notre publication précédente 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig3.jpg" /> Figure 3: Application in vivo électroporation (A) Une analyse au microscope optique du développement de la myélinisation SCs.. nerfs sciatiques ont été électroporés avec le plasmide exprimant la GFP à P3, et ont été fixés à différents stades de développement (P7, P14, P21 et P31). Des images représentatives de GFP-positives SCs sont indiqués sur la gauche. La longueur moyenne et le diamètre sont résumés comme moyenne ± SEM (n = 30-47 de 3 nerfs) sur la droite. La longueur et le diamètre de myélinisation augmente SCs que le développement se poursuit. (B) Une image au microscope électronique d&#39;un nerf sciatique transfectée avec un LacZ codant pour le plasmide. Un SC transfectée (astérisque blanc, à gauche) a été marqué avec finement précipités du produit de la réaction β-galactosidase. (C) Une image d&#39;un SC cotransfecté avec G-GECO1.1, un indicateur vert fluorescent cytosolique Ca 2+, et R-GECO1mt, un indicateur rouge fluorescent mitochondrial Ca 2+. Les régions dans les rectangles en pointillés blancs sont représentés élargie dans les panneaux sur la droite. Barres d&#39;échelle = 50 pm (A et C); 1 pm (B). Ce chiffre a été modifié à partir de notre publication précédente 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ici, nous présentons une technique in vivo de transfert de gènes vers les cellules de Schwann (SC) dans le nerf sciatique du rongeur. Cette technique simple est utile pour étudier les mécanismes de signalisation impliqués dans le développement et le maintien des CS myélinisants.

In Vivo Transfert de gènes à des cellules de Schwann dans le nerf sciatique Rongeur par électroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

L'objectif général de ce nouveau protocole expérimental est de réaliser efficacement un transfert génique in vivo vers les cellules de Schwann dans les nerfs sciatiques de rongeurs en utilisant l'électroporation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les mécanismes moléculaires de la myélinisation et de la démyélinisation dans le système nerveux périphérique. Le principal avantage de cette méthode est que les chirurgiens peuvent effectuer une transfection in vivo des cellules de Schwann à l'aide d'une procédure simple.Pour commencer la procédure, stériliser tous les instruments chirurgicaux et la solution de chlorure de sodium à 0,9 % par autoclavage. Ensuite, étirer une pipette en verre à l’aide d’un étireur de pipettes, puis couper l’extrémité de chaque pipette afin d’obtenir un diamètre compris entre 30 et 50 microns. Après avoir anesthésié un raton avec de l’isoflurane dans une chambre d’induction, placer le rat sur un réchauffeur électrique préchauffé sous un microscope binoculaire.Effectuer une pincée du orteil pour confirmer une anesthésie adéquate. Ensuite, appliquer un onguent ophtalmique sur les deux yeux afin d'éviter le dessèchement pendant la chirurgie. Maintenir l'anesthésie en administrant de l'isoflurane en continu par un masque facial.Ensuite, fixez les pattes de l'animal avec du ruban chirurgical et nettoyez la peau de la cuisse postérieure à l’aide de bétadine. Pratiquez une incision avec le scalpel. Exposez le nerf sciatique en créant une ouverture entre le muscle quadriceps fémoral et le muscle biceps fémoral à l’aide de deux aiguilles à coudre.Ensuite, appliquer une solution de chlorure de sodium à 0,9 % sur le nerf et absorber l'excès d'eau avec du papier sans peluches. Après cela, insérer la base d'une micro-pipette en verre dans un tube flexible. Remplir délicatement la micro-pipette avec une quantité adéquate de solution d'ADN par aspiration.Maintenant, tirez délicatement le côté distal du nerf à l’aide d’une aiguille afin de soulever le nerf exposé. Insérez la micropipette en verre au niveau du site distal du nerf et injectez la solution d’ADN en appliquant une légère pression positive jusqu’à ce que le nerf apparaisse vert. Ensuite, placez une électrode en platine de type pince à environ un à deux millimètres du nerf.Remplir l'espace entre l'électrode et le nerf avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %. Appliquer des impulsions électriques au site d'injection à l'aide d'un électroporateur. Après le premier ensemble d'impulsions, inverser l'électrode et appliquer un autre ensemble d'impulsions.Ensuite, nettoyer le site d'électroporation avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 % et répéter la procédure sur le nerf sciatique controlatéral. Après l'électroporation, fermer l'incision avec de la colle de cyanoacrylate. Puis, nettoyer la plaie avec de l'iodure de povidone.Retirez le masque facial de l'animal et laissez-le sur le réchauffeur électrique pendant au moins une heure afin de permettre un réveil complet de l'anesthésie. Ensuite, retournez le petit à la rate mère. Administrez du carprofène, un anti-inflammatoire non stéroïdien, ou de la buprénorphine, un analgésique opioïde, si nécessaire.Voici une image représentative d'un nerf sciatique transfecté. Le nerf a été transfecté avec un plasmide exprimant la RFP au stade P3 et fixé au stade P7. Il s'agit d'une image représentative d'une cellule transfectée par la RFP au stade P7, montrant une colocalisation avec la S100, un marqueur des cellules de Schwann. Et ceci est une image représentative d'un nerf sciatique transfecté par la RFP au stade P14, montrant une colocalisation avec la MBP, un marqueur des cellules de Schwann myélinisantes.Une image représentative d'un nerf sciatique co-transféré avec des plasmides exprimant la GFP et la RFP est présentée ici. La cellule de Schwann transfectée exprimait simultanément la GFP et la RFP. Cette figure montre une image de cellules de Schwann myélinisantes à P31, qui avaient été transfectées à P3, au début de la myélinisation, ainsi qu'une image de cellules de Schwann myélinisantes à P31 qui avaient été transfectées à P14, lorsque la majorité des axones de grande taille deviennent myélinisés.Ces images suggèrent que la transfection des cellules de Schwann myélinisantes peut être réalisée non seulement dans les nerfs néonatals, mais aussi dans des nerfs plus matures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une électroporation sur les nerfs sciatiques.

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