Name: Phagosome Migration et Velocity Mesurée en direct primaire des macrophages humains infectés par le VIH-1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Découvrez comment mesurer la vélocité des phagosomes dans des macrophages humains infectés par le VIH-1 en utilisant la microscopie confocale à disque tournant. Cette méthode permet de suivre le mouvement des phagosomes vers le centre cellulaire en temps réel.

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Nous remercions le Dr Jamil Jubrail d’avoir lu le manuscrit. Ces travaux ont été soutenus par des bourses du CNRS, de l’Inserm, de l’Université Paris Descartes, de l’Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), de la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 dont une bourse doctorale pour GLB) et de l’Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, dont une bourse post-doctorale pour la MC) à la FN. A. Dumas a été soutenu par des bourses doctorales de l’Université Paris Descartes et de Sidaction.

Le protocole doit être effectué en stricte conformité avec les législations nationales et internationales et les réglementations locales. Le sang provenant de donneurs sains qui ont donné leur consentement au don de sang à des fins de recherche a été obtenu à partir de transfusion sanguine centres avec lesquels les institutions ont signé un accord. protections spéciales doivent être prises lors de l&#39;utilisation du sang humain. Les expériences avec le VIH-1 doivent être réalisés dans un niveau de biosécurité 3 ou 2 (BSL-3 ou 2) Laboratoire conformément à la législation locale. 1. Préparation de macrophages humains dérivés des monocytes (hMDMs) par gradient de densité Centrifugation et sélection par Adhesion <ol><li> Commencez avec du sang frais provenant de donneurs sains (9 ml). Diluer tout le volume de sang frais avec 1x stérile tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2 + et Mg2 + afin d&#39; obtenir un volume final de 70 ml et ajouter doucement le sang dilué dans 50 ml de deux tubes coniques (35 ml par tube) , au-dessus de 15 ml d&#39;uneeutral, très ramifié, de masse élevée, polysaccharide hydrophile en solution déjà dans chaque tube. </li><li> Centrifuger les deux tubes de sang à 537 xg pendant 20 min à 20 ° C sans frein. Ramassez ensuite les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) contenus dans l&#39;anneau cellulaire trouble à l&#39;interface et de les transférer dans un nouveau tube de 50 ml contenant 15 ml de PBS 1x sans Ca 2+ et Mg 2+. </li><li> Centrifuger les cellules à 218 xg pendant 5 min à 20 ° C et à remettre en suspension le culot dans 45 ml de PBS 1x sans Ca 2+ et Mg 2+. </li><li> Centrifuger les cellules à 218 xg pendant 5 min à 20 ° C, de remettre en suspension le culot dans 10 ml de PBS 1x sans Ca 2+ et Mg 2+, et compter les cellules par dilution à une dilution finale de 1/200 dans le bleu Trypan. </li><li> Centrifuger les cellules à 218 xg pendant 5 min à 20 ° C et remettre en suspension le culot dans RPMI (Roswell Park Institute Memorial) 1640 complété avec 2 mM de L-glutamine et 100 pg / ml penicIllin-streptomycine avoir 7 x 10 6 PBMC par puits dans 2 ml de milieu dans chaque puits d&#39;une plaque 6. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 2 heures. Après 2 heures les monocytes auront adhéré à la matière plastique. </li><li> Pour permettre monocytes fraîchement isolés à se différencier en hMDMs, aspirer le moyen et le remplacer par un milieu de 2 ml (RPMI 1640, 10% décomplémenté sérum foetal de veau (FCS), 2 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine) additionné de colonie recombinante humaine du facteur de stimulation des macrophages (rhM-CSF) à une concentration finale de 10 ng / ml. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 11 jours (figure 1). </li><li> Au jour 11 éliminer le milieu et laver 2 fois avec 2 ml de milieu de hMDM froid par puits. Laver ensuite chaque puits 2 fois avec 1 ml de froid 1x PBS. </li><li> Pour détacher hMDMs complètement différenciées, lavez chaque puits 1 fois avec 1 ml de froid 1x PBS avec de l&#39;acide ethylenediaminetetraacetatic 2 mM (EDTA) et incuber les cellules dans 2 ml de PBS froid 1x avec 2 mM d&#39;EDTA par puits pendant 15 à 60 min à 4 ° C. NOTE: Les méthodes alternatives pour détacher les cellules existent (par exemple, la trypsine ou les activités de trypsine) qui pourraient donner de bons résultats 11. </li><li> Après le détachement (complété par pipetage doucement monter et descendre dans le puits), recueillir les cellules et les mettre dans un tube de 50 ml sur de la glace contenant 10 ml de milieu de hMDM froid. </li><li> Centrifuger les cellules à 218 xg pendant 5 min à 20 ° C, de remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu de hMDM froid, et compter les cellules par dilution au 1/20 dans du bleu Trypan. </li><li> Ensemencer les cellules à 1 x 10 6 hMDMs par 35 mm de verre de qualité en microscopie plat fond et incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO 2 pour 1 jour. </li></ol> 2. Production et Quantification du VIH-1 Stocks virales NOTE: NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP (Green Fluorescent Protein) portant une enveloppe R5-tropique, don de M. Schindler 10 est utilisé pour infecter les macrophages et de voir les cellules infectées en temps réel. <ol><li> Produire des stocks viraux par transfection de cellules embryonnaires humaines de rein 293T (2 x 10 6 à 100 mm plat) avec 6 pg de l&#39;ADN proviral correspondant en utilisant un réactif de transfection du commerce. </li><li> Quantifier l&#39;infectivité des stocks de virus en utilisant des cellules indicatrices HeLa TZM-BL (portant le gène de la ß-galactosidase sous le contrôle du VIH-1 LTR) en utilisant des dilutions en série des souches virales, suivie d&#39;une coloration de ß-galactosidase des cellules et le comptage des cellules bleues 12. </li></ol> 3. L&#39;infection de hMDMs avec le VIH-1 <ol><li> Ajouter le virus à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 0,02 à 0,03 dans 1 ml de milieu hMDM à hMDMs (cellules étalées à 1,13). Ajouter aux puits témoins seulement 1 ml de milieu hMDM et incuber les boîtes à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 2 jours (figure 1). </li><li> Au jour 2 se laver les cellules avec hMDM medium 3 fois et ajouter 1 ml de milieu de hMDM frais par plat. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 6 jours (figure 1). </li></ol> 4. Opsonisation de mouton Red Blood Cells <ol><li> Pour la préparation de 7 x 10 6 globules rouges par boîte, laver les globules rouges à deux reprises dans 100 pl de solution contenant 0,1% de sérum - albumine bovine (BSA) dans du PBS 1X avec une centrifugation à 600 x g pendant 4 minutes. </li><li> Remettre en suspension les globules rouges lavées dans 500 ul de 1 x PBS / BSA 0,1%, avec une IgG de lapin anti-globules rouges à une concentration sous-agglutinante pour 5 pi de globules rouges et on incube avec une rotation à température ambiante pendant 30 min. REMARQUE: Pour déterminer la concentration de sous-agglutination d&#39;anti-GRM IgG, préparer des dilutions en série d&#39;IgG (concentration des stocks à 13,1 mg / ml) de 1/50 à 1 / 25.600 dans 20 pl dans une plaque de 96 puits. Ajouter 2 x 10 6 GRM dans 20 pl dans chaque puits et mettre la plaque dans une pièce sombre pendant plusieurs heures. La concentration de sous-agglutinant est lala dilution du puits juste avant le puits avec agglutination (IgG + GRM formation d&#39;un réseau). </li><li> Après rotation, centrifuger les-GRM IgG-opsonisées à 600 xg pendant 4 min et laver avec 100 pi de PBS 1x / BSA 0,1% avec centrifugation à 600 g pendant 4 min. </li><li> Remettre en suspension les globules rouges-IgG opsonisées dans un milieu préchauffé Phénol anérythre RPMI supplémenté avec 2 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine (1 ml / boîte). </li></ol> 5. Live Cell Video Microscopy phagocytose Assay <ol><li> Utiliser un système d&#39;imagerie confocale tel qu&#39;un système à disque tournant muni d&#39;une chambre de chauffage à 37 ° C avec du CO 2 en passant par une bouteille d&#39;eau pour l&#39; humidification. </li><li> Allumer la chambre de chauffage avant l&#39;expérience pour avoir la platine du microscope à 37 ° C avant le début de l&#39;essai de phagocytose. Allumez le microscope et l&#39;ordinateur, et charger le logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Optimiser les paramètres d&#39;imagerie telles que la vitesse de balayage, magnification, résolution, etc. pour avoir au moins une cellule par champ et à l&#39; image d&#39; une image chaque minute entre 60 à 120 min. NOTE: Ici, l&#39;échantillon est imagée d&#39;une image toutes les minutes pendant 60 min avec 63X lentille. </li><li> Placer le plat d&#39;imagerie sur la platine du microscope. Réglez la mise au point et l&#39;emplacement pour trouver un seul ensemble de VIH-1 macrophage infecté dans le domaine. Utiliser les paramètres d&#39;excitation / d&#39;émission appropriés basés sur le système d&#39;imagerie utilisé et de la sonde. Inclure un canal lumineux champ (BF) pour observer phagosomes (Figure 1ii). Optimiser l&#39;apparence des différentes images de canal en ajustant le pourcentage de lumière transmise et le temps d&#39;exposition. NOTE: Ici, NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP était excité à l&#39; aide d&#39; un laser 491 nm avec 50 msec de temps d&#39; exposition avec 20% de laser (Figure 1i). </li><li> Retirer le plat d&#39;imagerie et ajouter 1 ml de suspension de SRBC à 7 x 10 6 GRM / ml à plat (figure 1). </li><li> Centrifuger à 500 xg pour2 min à température ambiante pour synchroniser la phagocytose, enregistrer le temps à la fin de cette centrifugation et retourner le plat de la scène. </li><li> Optimiser la mise au point et la capture GFP et images BF dans Z-piles (toute l&#39;épaisseur de la cellule avec une étape-distance de 0,3 um - habituellement 20 avions) chaque minute pendant au moins 1 h. Enregistrez la vidéo time-lapse dans le format de fichier natif du système d&#39;imagerie utilisé. NOTE: Ici, les films en accéléré ont été enregistrés dans le format natif, les fichiers * .stk. </li></ol> 6. Analyse des time-lapse Films <ol><li> Pour le montage vidéo, cliquez sur le menu déroulant &quot;Apps&quot; et dans l&#39;onglet «Revue multi dimensionnelle de données&quot; dans le logiciel de montage vidéo. <ol><li> Pour ouvrir le fichier, cliquez sur &quot;Fichier de base Sélectionnez&quot; puis sur &quot;Sélectionner le répertoire&quot;. Dans le «ensembles de données», sélectionnez l&#39;acquisition à analyser (en format .ND) et cliquez sur &quot;View&quot;. Les données sont représentées sous forme de tableau dans le temps en une colonne ded Z-plan de la ligne. </li><li> Pour représenter l&#39;infection dans un Z-projection (Figure 2, panneaux de gauche), sélectionnez 491 nm de longueur d&#39; onde dans la zone &quot;Longueurs d&#39; onde&quot; et cliquez sur l&#39;onglet &quot;Z de projection&quot; avec &quot;tous les plans&quot;. </li><li> Pour analyser une séquence de temps, sélectionnez BF longueur d&#39; onde dans la zone &quot;Longueurs d&#39; onde&quot; et choisissez le plan optimal sur l&#39;axe Z pour distinguer GRM externes (figure 2, flèche rouge), GRM internes (figure 2, cercle rouge) et le noyau ( Figure 2, cercle bleu). </li><li> Pour enregistrer les montages vidéo, cliquez sur l&#39;onglet &quot;Sélection de [X]&quot; puis sur &quot;Image (s) de charge&quot;. Enfin, enregistrez les images chargées en format .tif et les ouvrir à côté sur le logiciel ImageJ. </li></ol></li><li> Utilisez le plug - in &quot;Tracking Manuel&quot; sur le logiciel ImageJ pour mesurer la position du noyau et les différentes phagosomes observées dans le canal BF (figure 3). <ol><li> Download le &quot;suivi manuel&quot; plug-in sur le site ImageJ. Sur ImageJ, ouvrez le plugin et la séquence d&#39;images à analyser (figure 3, étape 1 et 2). </li><li> Entrez les paramètres tels que &quot;Intervalle de temps&quot; qui représente quantité de temps entre les images adjacentes, et le &quot;x / y calibration&quot; qui représente la distance par pixel (Figure 3, étape 3). NOTE: Ici, enregistrer la séquence d&#39;images avec un intervalle de temps de 1 min entre chaque trame et x / y calibration de 0,205 pm parce que le zoom 63X et un appareil photo avec une taille de pixel de 6,45 x 6,45 um 2 sont utilisés. </li><li> Pour démarrer le suivi, cliquez sur &quot;Ajouter piste&quot; (figure 3, étape 4) et cliquez sur un centre SRBC à la première fois quand il est internalisé. L&#39;image suivante apparaît automatiquement. </li><li> Continuez à cliquer sur le centre SRBC dans tous les cadres d&#39;avoir des positions différentes pendant le temps (figure 3, étape 6 dans la case rouge). <ol><li> Commencer à suivre le noyau pour avoir sa position dans tous les cadres en cliquant sur son centre. suivre ensuite les phagosomes (en cliquant sur son centre), un par un à l&#39;époque (cadre) de leur intériorisation, différente en fonction GRM. Pour plus de commodité pour voir SRBC sur le canal BF, utilisez la fenêtre &quot;Luminosité et contraste&quot; pendant le suivi (figure 3, étape 5). </li></ol></li><li> Entre chaque suivi SRBC, cliquez sur &quot;Ajouter piste&quot; (figure 3, étape 4) d&#39;avoir une nouvelle piste. Le numéro du suivi sera changé dans la deuxième colonne, &quot;Track n °&quot; de la table des résultats (figure 3, étape 6). </li><li> Sauvegardez les données dans un tableur pour passer à l&#39;étape suivante de l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Utilisez un logiciel de feuille de calcul pour calculer la distance parcourue de phagosomes contenant GRM vers le noyau et la vitesse des phagosomes pendant les 5 premières minutes après intériorisation de GRM (Figurer 4). <ol><li> Ouvrez la table de feuille de calcul et un nouveau fichier de feuille de calcul. Transfert dans ce nouveau fichier les paramètres suivants seulement, le temps, la x- et y- coordonnées du noyau et tous les GRM (figure 4A). </li><li> Pour calculer la distance entre GRM et le noyau avec seulement leurs coordonnées, considérons le noyau et un SRBC dans un plan XY de coordonnées (figure 4B). REMARQUE: La distance entre deux points est la longueur du chemin qui les relie. Dans le plan, la distance entre le noyau et GRM est donnée par le théorème de Pythagore. <ol><li> Si c (la distance entre le noyau et le SRBC) désigne la longueur de l&#39;hypoténuse et a et b désignent les longueurs des deux autres côtés, d&#39; exprimer le théorème de Pythagore que l&#39;équation de Pythagore: <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" /> REMARQUE: Dans le même temps, au repère orthonormé, la distance horizontalea est (x -x noyau SRBC) et la distance b est verticale (y -y noyau SRBC). </li><li> Ainsi, calculer la distance entre le noyau et le GRM (figure 4A, boîte violette) par: <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" /> NOTE: Multiplier la valeur de distance obtenue (en pixels) par étalonnage x / y pour avoir la distance en um. Ici, le calibrage x / y est de 0,205 um. </li><li> À chaque fois, on soustrait la distance entre le noyau et le SRBC à la distance initiale (figure 4C). </li><li> Tracer la mesure contre le temps pour les 5 premières minutes. Appliquer une ligne de tendance linéaire (Figure 5A) à la parcelle et de déterminer la pente de la ligne de tendance linéaire qui représente la vitesse de phagosome vers le noyau pendant les 5 premières minutes après intériorisation SRBC. </li><li> Regroupez les données pour calculer l&#39;erreur moyenne et statistique desles valeurs de vitesse et de tracer les sous une forme appropriée à l&#39; aide du logiciel approprié (figure 5B). </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette technique présente plusieurs étapes critiques. Tout d&#39;abord, la préparation d&#39;hMDMs et leur infection par le VIH-1 est critique parce que le pourcentage d&#39;infection est dépendante donneur. Il convient de noter, nous avons décidé d&#39;utiliser les macrophages qui ne sont pas polarisées in vitro avant l&#39;infection, car le statut des macrophages potentiellement rencontrés par le virus in vivo n&#39;a pas été bien caractérisé jusqu&#39;à présent. Nous avons vérifié l&#39;expression de...

Les macrophages jouent un rôle majeur dans le système immunitaire inné et dans l’homéostasie. Ce sont des phagocytes professionnels qui internalisent et éliminent les agents pathogènes et les débris par un processus appelé phagocytose 1,2. Le phagosome, le compartiment fermé qui se forme après l’engloutissement de matières particulaires, subit une série d’événements de fusion et de fission avec les compartiments endocytaires, conduisant à un compartiment de dégradation appelé phagolysosome. Ce compartiment a un pH acide, dû à l’acquisition de v-ATPases pompant des protons, contient des enzymes hydrolytiques et est enrichi en protéines membranaires associées lysosomales (LAMP). La maturation des phagosomes s’accompagne de leur migration sur les microtubules 3,4 vers le centre cellulaire pour atteindre une position périnucléaire où les lysosomes s’accumulent.
De nombreux agents pathogènes ont été signalés comme détournant la maturation des phagosomes, y compris des bactéries ayant des modes de vie intracellulaires qui modifient l’environnement vacuolaire où elles résident 5. Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1 cible les macrophages en plus des lymphocytes T. Comme les macrophages sont résistants aux effets cytopathiques du virus, contrairement aux lymphocytes T, ils peuvent être considérés comme un réservoir pour le virus. De plus, les macrophages infectés par le VIH-1 présentent des fonctions phagocytaires défectueuses et contribuent à l’émergence de maladies opportunistes. En particulier, la salmonellose non typhoïdique, invasive sévère causée par Salmonella Typhimurium ST313 est répandue depuis trois décennies chez les enfants ou les adultes d’Afrique subsaharienne infectés par le VIH 6. On estime que le risque de développer la tuberculose est plus de 20 fois plus élevé chez les personnes vivant avec le VIH que chez celles qui ne sont pas infectées par le VIH. 
Pour toutes ces raisons, il est important de mieux définir les mécanismes moléculaires sous-jacents aux défauts phagocytaires dans les macrophages infectés par le VIH. Nous avons montré que l’absorption de matières particulaires, de particules opsonisées, de bactéries ou de champignons, était inhibée dans les macrophages infectés par le VIH 7. Étant donné que cette inhibition est partielle, nous avons ensuite entrepris d’analyser le devenir des phagosomes internalisés dans les macrophages humains infectés par le VIH 8. Parce que la maturation des phagosomes est étroitement liée à la migration vers le centre cellulaire et à la fusion avec les lysosomes, un défaut de maturation phagosomale peut être dû à des modifications des modalités de trafic dans la cellule infectée. La méthode décrite ici utilise des globules rouges de mouton opsonisés en IgG (IgG-SRBC) comme modèle pour cibler la phagocytose médiée par les récepteurs et en particulier les récepteurs de la partie Fc des immunoglobulines (FcR). Ces particules sont plus faciles à imager en fond clair (BF) que les billes de latex, car les SRBC extracellulaires et intracellulaires présentent des propriétés de réfraction différentes 9. Pour mesurer la vitesse à laquelle les phagosomes se déplacent vers le noyau dans les macrophages infectés par le VIH, nous avons utilisé un virus fluorescent 10 et mis en place une méthode de suivi manuel simple qui est décrite ici. La méthode ne nécessite pas de programmation avancée et utilise simplement ImageJ. Il se prête aux cellules adhérentes et à tout type de particule ou d’agent pathogène qui peut être visualisé par microscopie à fond clair ou par imagerie fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Falcon 100 mm TC-Treated TC-Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Pour la production virale</td></tr><tr><td>Plats à fond en verre 35 mm non revêtus 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Boîtier</td><td>Pour l’acquisition</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates 6 puits</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>Pour les macrophages dérivés de monocytes humains</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>un polysaccharide hydrophile neutre, très ramifié, de masse élevée, en solution pour la centrifugation par densité</td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquide (High Glucose)</td><td>GIBCO, Sondes moléculaires</td><td>31966-021</td><td>Conservé à 4 &deg ; C ; pour la culture de cellules HEK</td></tr><tr><td>RPMI 1640 moyen GLUTAMAX&nbsp ; Supplément</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td>Conservé à 4 &deg ; C; pour les hMDM culture</td></tr><tr><td>F&oelig ; sérum de veau tal (SCF)&nbsp ;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>conservé à -20 &deg ; C ; </td></tr><tr><td>pénicilline-streptomycine décomplétée (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>Conservation à -20 &deg ; C ; pour hMDMs culture</td></tr><tr><td>RPMI 1640 milieu, sans rouge de phénol (10x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation ; pour le dosage de la phagocytose</td></tr><tr><td>FuGENE6 Réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>conservé à 4 &deg ; C ; pour la production virale</td></tr><tr><td>Globules rouges d’ovins (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conservé dans le tampon Alsever à 4 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Globules rouges anti-ovins IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Conservé à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine fraction de choc thermique, pH 7, &ge ; 98 %&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>conservé à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Microscope inversé DMI600</td><td>Leica Confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Unit&nbsp ; CSU-X1M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW laser</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objectif</td><td>Leica</td><td></td><td>Objectif ; Grossissement 100X ; Ouverture numérique 1,40 ; Huile d’immersion</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) Appareil</td><td>photo Photométrie</td><td></td><td>Taille de pixel 6.45 &micro ; m x 6,45 et micro ; m ; Définition 1 392 x 1 040 ; Encodage de l’image dans le</td></tr><tr><td>logiciel Metamorph 7.7.5</td> 14 <td>bits Dispositifs</td><td></td> moléculaires <td>Pour le contrôle du microscope</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td></td><td></td> GraphPad Prism <td>Pour l’analyse des statistiques</td></tr></tbody></table>

phagosome migration et velocity mesurée en direct primaire des macrophages humains infectés par le vih-1

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Les macrophages sont des cellules phagocytaires qui jouent un rôle majeur à la croisée des chemins entre l’immunité innée et l’immunité spécifique. Ils peuvent être infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1 et, en raison de leur résistance à ses effets cytopathiques, ils peuvent être considérés comme des réservoirs viraux persistants. De plus, les macrophages infectés par le VIH présentent des fonctions défectueuses qui contribuent au développement de maladies opportunistes.
Le mécanisme exact par lequel le VIH-1 altère la réponse phagocytaire des macrophages était inconnu. Nous avions précédemment montré que l’absorption de diverses particules par les macrophages était inhibée lorsqu’ils étaient infectés par le VIH-1. Cette inhibition n’était que partielle et des phagosomes se sont formés dans les macrophages infectés par le VIH. Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur l’analyse du devenir de ces phagosomes. La maturation des phagosomes s’accompagne d’une migration de ces compartiments vers le centre cellulaire, où ils fusionnent avec les lysosomes, générant des phagolysosomes, responsables de la dégradation du matériel ingéré. Nous avons utilisé des globules rouges de mouton opsonisés aux IgG comme cible de phagocytose. Pour mesurer la vitesse de mouvement centripète des phagosomes dans des macrophages infectés par le VIH, nous avons utilisé une combinaison de microscopie confocale à fond clair et à fluorescence. Nous avons établi une méthode pour calculer la distance des phagosomes vers le noyau, puis pour calculer la vitesse des phagosomes. Les cellules infectées par le VIH ont été identifiées grâce à un virus exprimant la GFP, mais la méthode est applicable aux cellules non infectées ou à tout type d’infection ou de traitement.

Phagocytose FcR-médiée par hMDMs VIH-1-infectés et non infectés est décrite ici en utilisant GRM IgG-opsonisées comme cibles de modèle (figure 1). Les étapes essentielles de ce protocole sont la préparation de hMDMs et l&#39;infection par le VIH-1. En effet, le rendement et la qualité des macrophages différenciés varie entre les donateurs, ainsi que le taux d&#39;infection avec des rendements de l&#39;ordre de 10-40%. En outre, la préparation d&#39;IgG opsonisé-globules ...

Nous décrivons une méthode pour mesurer la vitesse des phagosomes se déplaçant vers le centre cellulaire dans des cellules vivantes infectées avec ou sans le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) de type 1, en utilisant la microscopie confocale à fluorescence à disque rotatif pour identifier les cellules infectées par fluorescence et la microscopie à champ clair pour détecter les phagosomes.

Phagosome Migration et Velocity Mesurée en direct primaire des macrophages humains infectés par le VIH-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

L'objectif général de cette analyse est de quantifier la vitesse des phagosomes dans des macrophages infectés par le VIH-1 à l'aide d'une méthode simple de suivi manuel. L'avantage de ce protocole réside dans sa facilité à calculer les déplacements relatifs de groupes d'objets au sein d'une cellule, qu'ils soient en mouvement ou déformés. Cette méthode permet d'observer le déplacement des phagosomes dans des macrophages infectés exprimant la GFP, mais elle pourrait également être utilisée pour d'autres compartiments intracellulaires dans des cellules marquées par fluorescence.Après avoir infecté des macrophages dérivés de monocytes humains et opsonisé des globules sanguins de mouton, conformément au protocole décrit, mettez en place un test de phagocytose en utilisant un système d'imagerie confocale, tel qu'un microscope à disque tournant, équipé d'une chambre chauffante à 37 degrés Celsius, avec du dioxyde de carbone. Avant l'expérience, allumez la chambre chauffante afin de porter la platine du microscope à 37 degrés Celsius. Ensuite, allumez le microscope et l'ordinateur, puis lancez le logiciel d'imagerie.Optimisez les paramètres d'imagerie, tels que la vitesse de balayage, le grossissement, la résolution, etc., afin d'obtenir au moins une cellule par champ et d'acquérir une image toutes les minutes entre 60 et 120 minutes. Placez la boîte d'imagerie sur la platine du microscope. Ajustez la mise au point et la position pour ne visualiser qu'un seul macrophage entier infecté par le VIH-1 dans le champ.Utilisez des réglages d'excitation et d'émission appropriés en fonction du système d'imagerie et de la sonde utilisés. Incluez un canal de champ clair. Optimisez son apparence en ajustant le temps d'exposition.Ensuite, retirez la boîte de microscopie et ajoutez un millilitre de suspension de globules rouges de mouton, ou SRBC, à sept fois dix puissance cinq SRBC par millilitre, dans la boîte. Centrifugez la boîte à 500 ×g pendant deux minutes à température ambiante afin de synchroniser la phagocytose, puis enregistrez l'heure à la fin de la centrifugation et replacez la boîte sur la platine. Optimisez la mise au point et définissez les limites supérieure et inférieure de la pile avec un pas de 0,3 micromètre.Démarrez l'acquisition des empilements en Z des images GFP et BF à travers l'épaisseur de la cellule, puis enregistrez la vidéo en laps de temps au format natif du système d'imagerie. Pour effectuer le montage vidéo, dans le logiciel de montage, cliquez sur le menu déroulant Applications et sur l'onglet Examiner les données multidimensionnelles. Pour ouvrir le fichier, cliquez sur Sélectionner le fichier de base, puis sur Sélectionner le répertoire.Dans la zone Jeux de données, sélectionnez l'acquisition à analyser et cliquez sur Afficher. Pour représenter l'infection selon une projection Z, dans la zone Longueurs d'onde, sélectionnez la longueur d'onde de 491 nanomètres et cliquez sur l'onglet projection Z avec tous les plans. Ensuite, pour analyser une séquence temporelle, dans la zone Longueurs d'onde, sélectionnez la longueur d'onde de champ clair (BF) et choisissez le plan optimal sur l'axe Z afin de distinguer les globules rouges ovins (SRBC) externes, les SRBC internes et le noyau.Enregistrez les montages vidéo en cliquant sur l'onglet Sélection Xs, puis sur Charger les images. Enfin, enregistrez les images chargées au format tif. Après avoir téléchargé le plugin de suivi manuel Image J, ouvrez le plugin dans Image J, puis ouvrez la séquence d'images à analyser.Saisissez les paramètres, tels que l'intervalle de temps, qui représente la durée entre deux images consécutives, et l'étalonnage XY, qui représente la distance par pixel. Pour commencer le suivi, cliquez sur Ajouter un suivi, puis cliquez sur le centre d'un globule rouge à l'instant initial où il est internalisé. L'image suivante s'affiche automatiquement.Par commodité, pour visualiser les GRCS sur le canal BF, utilisez la fenêtre de luminosité et de contraste pendant le suivi. Continuez à cliquer sur le centre des GRCS dans toutes les images afin d'obtenir différentes positions au cours du temps. Entre chaque suivi de GRCS, cliquez sur « Terminer le suivi », puis sur « Ajouter un suivi » pour commencer un nouveau suivi.Le numéro de suivi changera dans la deuxième colonne du tableau des résultats. Commencez à suivre le noyau pour obtenir sa position dans toutes les images en cliquant sur son centre, comme effectué précédemment. Enregistrez les données dans un tableur, puis ouvrez-les dans un logiciel de tableur, et créez un nouveau fichier de tableur.Transférez dans ce nouveau fichier l'heure, ainsi que les coordonnées X et Y des globules rouges de mouton (SRBC) et du noyau. Enfin, utilisez le logiciel de tableur pour calculer la distance parcourue par les phagosomes contenant les SRBC en direction du noyau, ainsi que la vitesse des phagosomes durant les cinq premières minutes suivant l'internalisation des SRBC, conformément au protocole décrit dans le texte. L'analyse du déplacement des phagosomes dans des macrophages vivants infectés par le VIH, en temps réel à l'aide d'une microscopie confocale à disque tournant, est présentée ici.Les réglages du canal de champ clair sont essentiels pour visualiser le noyau et pour distinguer les GRBS externes des GRBS internalisés. Ce graphique représente la distance parcourue par un phagosome dans des HMDM non infectés au cours des cinq premières minutes suivant l’internalisation d’un GRBS, en fonction du temps. La vitesse du phagosome correspond à la pente de la courbe de régression linéaire indiquée ici.Enfin, dans cette étude, on a observé que la vitesse du phagosome durant les cinq premières minutes suivant l'internalisation chez les HMDM infectés par le VIH est inférieure à celle des HMDM non infectés. Ces méthodes ont montré que le déplacement du phagosome vers le centre de la cellule, et donc la maturation du phagosome en phagolysosome, était altéré dans les macrophages infectés par le VIH. Après son acquisition, une cellule peut être soumise à une microscopie électronique corrélative ou l'ensemble de la population cellulaire peut être fixé pour une microscopie en immunofluorescence classique et une analyse statistique.La phagocytose est très sensible à la température ; par conséquent, la température à l'intérieur de la chambre de chauffage et du milieu du plat de culture doit être maintenue constante à 37 degrés Celsius tout au long de la procédure. N’oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes peut présenter des risques, et que des précautions telles que le travail dans une salle de sécurité biologique et le port d’équipements de protection individuelle doivent être prises conformément à la législation locale.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

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