Name: Préparation des cellules CD4 + Cellules T pour lanalyse de GD3 et GD2 ganglioside Membrane Expression par Microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Apprenez à préparer des cellules CD4+ T pour visualiser les gangliosides GD3 et GD2 par microscopie. Cette méthode optimise l'utilisation de faibles quantités cellulaires pour l'étude de la leucémie T.

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Nous remercions le Dr José Luis Daniotti pour ses commentaires. Nous remercions le Dr J. Arturo Pimentel et le Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM pour l’acquisition d’images confocales. I.M.-D. et T.M.V.C. ont été soutenus par des subventions 157634 et 253596 du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), de la Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. est récipiendaire d’une bourse (245192) du CONACYT. Nous remercions également le soutien de la Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

Le sang périphérique provenant de donneurs sains de sexe masculin a été obtenu avec le consentement éclairé et à l&#39;approbation du Comité de bioéthique du Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos. 1. Isolement et activation de Human Naïf cellules T CD4 + <ol><li> Recueillir 2 ml de sang périphérique provenant de donneurs humains sains grâce à un consentement éclairé et diluer avec 2 ml de solution stérile PBS-EDTA (1x tampon phosphate salin (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Ajouter le sang dilué lentement au - dessus de 3 ml d&#39; une solution de saccharose avec une densité de 1,077 8 comme décrit précédemment. Remarque: La migration différentielle pendant la centrifugation provoquée par les différences de densité provoque érythrocytes dans les sédiments complètement et une couche de cellules mononucléaires moins denses se former au-dessus. 2 ml de sang périphérique rendra environ 0,5 x 10 6 cellules T CD4 + naïfs après la Purificatisur les marches. </li><li> Centrifugeuse 30 min à 250 g à 21 ° C (utilisation rotor pour tubes à fond rond avec angle fixe de 30 mm) sans interruption pour générer le gradient de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). Après centrifugation, le PBMC peut être clairement observé comme un anneau blanc. Recueillir les PBMC avec une pipette et transférer à tube stérile pour le lavage. </li><li> Après trois lavages avec une solution de PBS-EDTA à 250 g pendant 10 min procéder à la purification des cellules T CD4 + naïves. méthodes de tri ou plusieurs types de kits de purification sont disponibles à cet effet. De préférence, utilisez&gt; 1 x 10 7 PBMC pour la purification. <ol><li> Purifier cellules CD4 + T naïfs par sélection négative avec des billes magnétiques. Effectuer une sélection négative avec des anticorps anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRy / δ, anti-HLA-DR, et CD235a (glycophorine A). Évaluer le pourcentage de pureté en déterminant des cellules CD4 + CD45RA + à ffaible cytométrie. Note: Le cas échéant, procéder à l&#39; incubation des PBMC pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2 avec une densité de 1 x 10 6 cellules / ml dans 10 ml de milieu supplémenté pour favoriser l&#39; adhérence des monocytes et poursuivre la purification naïve de lymphocytes T CD4 +. La récupération efficace des cellules T CD4 + naïves provenant du sang périphérique dépend en grande partie du système de purification. </li></ol></li><li> Préparer des plaques à 24 puits de culture cellulaire par l&#39;addition de 250 ul par puits de PBS contenant 5 pg / anticorps monoclonal anti- CD3 ml et incuber pendant au moins 2 heures à 37 ° C. Remarque: Les plaques à 96 puits peuvent être utilisés quand un petit nombre de cellules CD4 + T naïfs sont utilisés (par exemple, 2 x10 4 -1 x 10 5). </li><li> Retirer anti CD3 dilution du 24 puits ou 96 puits et laver les plaques à deux reprises à l&#39;aide stérile 1x PBS. </li><li> Diluer les cellules T CD4 + naïfs&gt; 95% de pureté (CD4 +CD45RA +) à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml dans avancé du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 3% de sérum fœtal bovin (ou RPMI supplémenté avec 10% de sérum), 2 mM de glutamine et des antibiotiques (1 U / ml de pénicilline, 1 ug / ml de streptomycine). Remarque: Si ganglioside localisation est nécessaire dans les CMSP, suivre le même protocole pour la dilution et de stimulation tel que décrit ci-dessous. </li><li> Ajouter 500 ul de la dilution cellulaire à des puits enduits anti-CD3 et aux puits non revêtus (cellules de contrôle) dans la plaque de 24 puits. En variante, ajouter 100 ul de la dilution des cellules dans les puits de la plaque à 96 puits. </li><li> Remplir les conditions de stimulation des cellules T CD4 + naïfs dans les puits revêtus anti - CD3 en ajoutant 1 pg / ml d&#39;anticorps anti-CD28. </li><li> Gardez les repos cellules T CD4 + que le contrôle dans les puits non revêtus , sans addition d&#39;anticorps anti-CD28. Incuber le repos et de cellules T CD4 + activées pour 0 à 72 heures dans des conditions standard de 37 °C et 5% de CO 2. </li><li> Pour vérifier une activation adéquate évaluer par cytométrie en flux de l&#39;expression du CD69 marqueur d&#39;activation précoce (16 heures après l&#39;activation) ou CD25 marqueur tardif d&#39;activation (48 heures après l&#39;activation) en repos et activé les cellules CD4 + T naïves incubées à 37 ° C et 5% de CO 2 en l&#39; absence ou en présence d&#39;anti - CD3 / CD28 anticorps 9,10. </li></ol> 2. Le respect de repos et de cellules activées Naïf T CD4 + <ol><li> Stériliser 12 mm rondes lamelles par autoclavage et exposition à la lumière UV pendant au moins 15 min. </li><li> Placer les lamelles dans des plaques à 24 puits de culture de cellules stériles. Remarque: Pour les cultures avec moins de 1 x 10 5 cellules , il est préférable d&#39;utiliser des chambres de glissement avec petits godets adaptés pour empêcher la dispersion des cellules dans la lamelle. </li><li> Manteau des lamelles (ou chambre de coulissement) avec 200 ul de poly-L-lysine (poids moléculaire de 150 à 300 kDa) 0,1% (p / v) et incuber pendant 5 minutes à rtempérature oom (RT), enlever et sécher pendant au moins 1 heure à température ambiante. </li><li> Mélanger soigneusement et recueillir le repos et les cellules T CD4 + naïfs activés à partir des plaques à 24 puits. Compter les cellules et ajuster , si nécessaire avec un milieu supplémenté frais pour transférer 1 x 10 5 cellules aux lamelles revêtues de poly-L-lysine. Incuber les cellules pendant au moins 6 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Collecte et fixation du repos et Activé Naïf cellules T CD4 + <ol><li> Retirez délicatement le moyen de repos et de culture des cellules CD4 + T naïfs activés. </li><li> Ajouter 500 ul de PBS stérile RT lentement. Remarque: addition soigneuse et le retrait de solutions de puits empêche le détachement des cellules de la lamelle. </li><li> Jeter le PBS et ajouter un autre 500 ul de PBS pour éliminer complètement les milieux de culture. </li><li> Fixer les cellules par addition de 500 ul filtré paraformaldéhyde 4% (filtration supprime des microparticules qui peuvent interférer avec l&#39;analyse de la microscopie) et incuber pendant 30 min à température ambiante (de préférence) ou une nuit à 4 ° C. Attention: paraformaldéhyde est un composé toxique et volatile. Il est connu pour être cancérigène pour l&#39;homme. Utilisez soigneusement avec un protocole de sécurité approprié. </li><li> Retirer le fixateur et laver au moins deux fois avec du PBS à la température ambiante. </li><li> Procéder à l&#39;étape suivante ou maintenir les puits de la plaque avec 500 ul de PBS à 4 ° C pendant plusieurs jours jusqu&#39;à ce que la coloration. Remarque: Stérilité pendant ce processus permet d&#39;éviter la croissance des micro-organismes. </li></ol> 4. Coloration, Montage et visualisation par microscopie confocale <ol><li> Retirez le PBS des puits. Ajouter 500 pi de tampon de blocage à froid (1 x PBS, 0,5% de qualité standard d&#39;albumine de sérum bovin, 1% de sérum de fœtus bovin à pH 7,4). Incuber pendant 20 min sur la glace. </li><li> Retirez le tampon de blocage avec précaution et ajouter les anticorps primaires (anti-gangliosides GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),anti- CD25 conjugué à PE et APC conjugué anti- TCR et isotypes témoins dilués dans un tampon de blocage à 2,5 pg / ml. </li><li> Incuber 2 h sur la glace ou une nuit à 4 ° C. Remarque: l&#39;agitation orbitale lente est préférable. </li><li> Retirer l&#39;anticorps avec précaution et ajouter lentement 500 pi de PBS. Répéter deux fois. </li><li> Ajouter des anticorps secondaires (FITC anti IgG3 anti- conjuguée à R24 GD3, Alexa Fluor 488 IgG2a anti- conjugué Alexa Fluor 647 ou conjugué pour 14G2a contre GD2) dilué dans du tampon de blocage à 0,1 pg / ml. </li><li> Incuber pendant 1 heure sur la glace dans l&#39;obscurité sans agitation. </li><li> Laver trois fois dans du PBS comme décrit dans la section 4.4). Gardez les puits avec suffisamment de PBS pour éviter la déshydratation des échantillons. </li><li> Ajouter Hoechst 333258 colorant dilué dans du PBS à 0,1 pg / ml. </li><li> Incuber 15 min à température ambiante et à enlever. Laver trois fois dans du PBS. </li><li> Placer les lames sur une serviette en papier et ajouter 20 ul de solution de fixation (50% de glycerol dans du PBS) ou de la solution de montage commerciales pour éviter la décoloration et la trempe à partir d&#39;échantillons. </li><li> Prenez soigneusement la lamelle avec des pincettes fines et placez-le sur la solution de montage. Faire en sorte que le côté de la lamelle couvre-objet, où les cellules sont fixées en contact avec la solution. Sceller les lamelles avec le vernis à ongles et d&#39;analyser en utilisant la fluorescence ou microscopie confocale. </li></ol> 5. Isolement d&#39;ARN <ol><li> Préparer un anticorps anti CD3 (5 ug / ml) revêtu de plaques à 96 puits. Incuber 4 x 10 4 naïves cellules T CD4 + / puits dans 100 ul de milieu de culture supplémenté avec un anticorps anti- CD28 (1 pg / ml) pour compléter le stimulus. Incuber à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 0-72 h. </li><li> Après différents temps post-activation placer les cellules dans un tube de microcentrifugeuse. </li><li> Ajouter 500 pi de PBS et centrifuger à 250 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 1ml réactif Trizol. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante et de garder l&#39;échantillon à -8076; C pendant au moins 24 heures. Procéder à l&#39;isolement de l&#39;ARN en cas de besoin. Remarque: En quittant l&#39;échantillon à -80 ° C pendant au moins 24 h améliore le rendement de l&#39;ARN. En outre, l&#39;utilisation de gants en main est essentielle pour éviter la dégradation de l&#39;ARN par RNases. </li><li> Décongeler l&#39;échantillon par incubation à 37 ° C pendant 2 minutes dans un bain d&#39;eau. </li><li> Ajouter 200 ul de chloroforme et agiter vigoureusement à la main pendant 30 secondes (pour éviter le mélange agressif de l&#39;ARN par vortex). Incuber 5 minutes à température ambiante. </li><li> Centrifugeuse 15 min à 12000 xg à 4 ° C. </li><li> Récupérer la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;isopropanol et inverser le tube trois fois. </li><li> Incuber 10 min à température ambiante et centrifuger pendant 10 min à 12 000 xg à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant par inversion. </li><li> Ajouter 1 ml de glace froide éthanol à 75% et centrifuger 10 min à 12000 xg à 4 ° C. </li><li> Complètement jeter le surnageant et sécher le culot d&#39;ARN en laissant le bouchon du tube ouvert. ne pase: A ce stade, le culot est pas clairement visible. Continuer malgré tout. </li><li> Reprendre le culot dans 20 pi d&#39;eau moléculaire de qualité. Calculer la concentration et la pureté des acides nucléiques en mesurant 260 nm et 280 nm, l&#39;absorbance à l&#39;aide NanoDrop. </li><li> Procédez avec précaution à la synthèse de l&#39;ADNc en utilisant tout kit classique de la transcriptase inverse et en suivant le protocole Référence rechange. Remarque: Environ 0,5-2 pg d&#39; ARN est obtenue à partir de 4 x 10 4 cellules T CD4 + naïfs. ADNc peut être synthétisé à partir de 100 ng d&#39;ARN et utilisé dans des réactions de PCR en temps réel, sans qu&#39;il soit nécessaire pour les kits d&#39;entrée faible d&#39;ARN. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser les gangliosides ou de protéines dans des suspensions cellulaires de lymphocytes T CD4 + ou d&#39; autres cellules du système immunitaire (par exemple, PBMC, figure 5) à partir d&#39;un petit nombre de cellules. En raison de la petite taille des cellules T et les propriétés non-adhérentes, l&#39;acquisition de fluorescence images microscopiques résultats dans une mauvaise information ou de faible qualité si les cellules ne sont pas...

Les cellules T CD4 + orchestrer la réponse immunitaire par l&#39; intermédiaire de leurs fonctions effectrices après activation par les cellules présentant l&#39; antigène 1. L&#39;étude des mécanismes cellulaires qui sont modulés lors de l&#39;activation permet un aperçu d&#39;un processus de base de la fonction immunitaire. Cependant, l&#39;étude des cellules T CD4 + naïfs peut être compliqué , car ils représentent une très petite population de cellules dans la périphérie de sang 2. Grâce à la microscopie par fluorescence à plusieurs rapports ont étudié la localisation de différentes molécules impliquées dans l&#39; activation des lymphocytes T CD4 +, principalement des protéines associées à la membrane plasmique 3. Les gangliosides sont des glycosphingolipides contenant de l&#39; acide sialique , et même si elles ont été largement étudiées dans les cellules nerveuses où ils sont abondants, d&#39; autres cellules telles que les cellules immunitaires expriment également des gangliosides avec des fonctions pertinentes biologiquement 4,5. Nous avons précédemment rapporté that lors de l&#39; activation des cellules naïves humaines T CD4 + il y a une régulation positive de l&#39;α2,8 sialyltransférase ST8Sia 1 (GD3 synthase) et la synthase GM2 / GD2, qui induisent la neoexpression de surface importante de GD2 et la régulation positive de ganglioside GD3 6. Une étude plus poussée de GD3, GD2 et d&#39;autres gangliosides dans les cellules immunitaires est nécessaire pour compléter une vue partielle de la fonction immunitaire à base de protéines. Généralement, l&#39;étude de l&#39; expression des gangliosides est basée sur des techniques telles que la Chromatographie sur couche mince (CCM) 7, mais cette technique ne permet pas la localisation spatiale de gangliosides à la membrane plasmique ou dans des compartiments sub - cellulaires, en limitant l&#39; analyse biologique. Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour l&#39;identification d&#39;anticorps médiée et la localisation de GD3 et GD2 gangliosides dans les cellules CD4 + T naïfs humains et CMSP après anti-CD3 / activation anti-CD28. Avec ce protocole, il is également possible d&#39;analyser l&#39;expression génique et moléculaire de gangliosides dans un faible nombre de cellules en suspension, avec l&#39; acquisition d&#39;images de haute qualité 6, compte tenu de la petite taille des lymphocytes (9 pm).

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 avancé&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Complété avec 3</td></tr> % de souris FBS <tr><td>anticorps anti-CD3 humain</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 souris clone</td></tr><tr><td>anti humain Anticorps CD28</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 souris clone</td></tr><tr><td>anti humain GD3&nbsp ; anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 souris clone</td></tr><tr><td>anti humain GD2 anticorps</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>Clone 14G2a</td></tr><tr><td>FITC-conjugué anti-souris IgG3 anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-souris conjugué</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl ; tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a anticorps anti-souris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>conjugué Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl ; tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a Anticorps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, humain</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Tri&nbsp ;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek système de lames de chambre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Microscope confocal laser (Olympus)&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI et IX81&nbsp ;</td></tr><tr><td>Amorce de séquence directe GD3 synthase</td><td>5&acute ;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&acute ;</td><td></td><td>Réf. 7</td></tr><tr><td>Amorce à séquence inverse GD3 synthase</td><td>5&acute ;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&acute ;</td><td></td><td>Réf. 7</td></tr><tr><td>Amorce de séquence directe GM2/GD2 synthase</td><td>5&acute ;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&acute ;</td><td></td><td>Réf. 7</td></tr><tr><td>Amorce à séquence inverse GM2/GD2 synthase</td><td>5&acute ;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&acute ;</td><td></td><td>Réf. 7</td></tr></tbody></table>

préparation des cellules cd4<sup&gt; +</sup&gt; cellules t pour l&#39;analyse de gd3 et gd2 ganglioside membrane expression par microscopie

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Les procédés décrits ici pour l&#39; activation de cellules T CD4 + naïves en suspension et leur adhérence à lamelles pour une analyse par microscopie confocale permettent la localisation spatiale et la visualisation des gangliosides impliqués dans l&#39; activation des lymphocytes T CD4 + que l&#39; expression du complément de profilage des expériences telles que la cytométrie de flux, occidental buvard ou PCR en temps réel. La quantification de l&#39;expression des gangliosides par cytométrie de flux et de leur localisation cellulaire par microscopie peut être obtenue par l&#39;utilisation d&#39;anticorps anti-ganglioside avec une haute affinité et spécificité. Néanmoins, un traitement adéquat des cellules en suspension implique le traitement des plaques de culture pour promouvoir l&#39;adhérence nécessaire requis pour la fluorescence ou l&#39;acquisition de la microscopie confocale. Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour déterminer GD3 et GD2 expression de ganglioside et colocalisation avec le TCR lors de l&#39; activation naïve de lymphocytes T CD4 +. Aussi, real-texpériences ime PCR en utilisant &lt;40.000 cellules sont décrites pour la détermination de la GD3 et des gènes de synthase GM2 / GD2, ce qui démontre que les expériences d&#39;analyse de gène peut être réalisé avec un faible nombre de cellules, et sans qu&#39;il soit nécessaire de kits supplémentaires d&#39;ARN d&#39;entrée bas.

Le protocole décrit dans ce manuscrit rend une bonne qualité de culture et de repos adhéré et les cellules T CD4 + activés humains naïfs (figure 1). Les cellules T CD4 + activés présentent le profil proliférative caractéristique (figure 1B) par rapport à l&#39;état de repos (figure 1A). Le marqueur de fin d&#39;activation CD25 est utile pour évaluer l&#39;activation efficace à 72 h observé par microscopie confocale ...

Nous décrivons un protocole anticorps coloration standard pour une utilisation en microscopie pour déterminer l&#39;expression de la membrane et la localisation des gangliosides dans repos et les cellules T CD4 + activés humains naïfs. On décrit également des expériences de PCR en temps réel en utilisant &lt;40.000 cellules qui ne nécessitent pas de kits supplémentaires d&#39;ARN d&#39;entrée faible.

Préparation des cellules CD4<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T pour l&#39;analyse de GD3 et GD2 ganglioside Membrane Expression par Microscopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la préparation d'une suspension de cellules T CD4+ pour la coloration permettant de visualiser la localisation des gangliosides GD3 et GD2 à la surface cellulaire en utilisant un faible nombre de cellules. Cette méthode permet la visualisation des glycolipides membranaires à partir d'un petit nombre de cellules en suspension, comme c'est le cas pour les cellules mononucléées. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'évaluer l'expression et la localisation des gangliosides à partir de faibles quantités de cellules T CD4+ en optimisant l'utilisation de l'échantillon.Les implications de cette technique pourraient s'étendre à la recherche et au diagnostic de certains types de leucémie des lymphocytes T. Comme nous l'avons observé, certaines lignées cellulaires leucémiques surexpriment les gangliosides GD3 et GD2. Commencez par diluer deux millilitres de sang périphérique provenant de donneurs humains sains avec deux millilitres de PBS stérile contenant du EDTA.Dispenser lentement le sang dilué au-dessus de trois millilitres de solution de saccharose de densité 1,077. Ensuite, centrifuger pendant 30 minutes à 250 × g à 21 °C sans frein pour former le gradient des cellules mononucléées du sang périphérique. Après la centrifugation, les PBMC peuvent être clairement observées sous forme d'un anneau blanc.Prélève les PBMC à l’aide d’une pipette et transfère-les dans un tube stérile pour lavage. Après avoir lavé les cellules avec du PBS EDTA, purifie les lymphocytes T CD4+ naïfs par sélection négative à l’aide de billes magnétiques en utilisant un kit disponible commercialement. Une fois qu’une population de lymphocytes T CD4+ de pureté supérieure à 95 % a été obtenue, prépare des plaques de culture cellulaire en 24 puits en ajoutant 250 microlitres d’anticorps monoclonal anti-CD3 à cinq microgrammes par millilitre dans du PBS dans chaque puits.Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Après l'incubation, retirez la dilution d'anticorps anti-CD3 des plaques et effectuez deux lavages à l'aide de PBS 1x stérile. Ensuite, diluez les cellules T CD4+ naïves avec le milieu RPMI 1640 avancé complémenté pour obtenir une densité de 1 × 10⁶ cellules par millilitre.Ensuite, ajoutez 500 microlitres de cellules diluées dans les puits revêtus d'anticorps anti-CD3 de la plaque 24 puits. Puis terminez la stimulation des cellules T CD4+ naïves dans les puits revêtus d'anti-CD3 en ajoutant un microgramme par millilitre d'anticorps anti-CD28. Incubez les cellules T CD4+ au repos et activées de zéro à 72 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Une fois le temps d'incubation imparti écoulé, récupérez les cellules T CD4+ naïves au repos et activées à partir des plaques 24 puits. Effectuez un dénombrement cellulaire et, si nécessaire, diluez les cellules avec du milieu frais supplémenté afin d'obtenir une concentration de un fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Ensemencez 500 microlitres de cellules diluées dans les puits d'une plaque 24 puits contenant des lamelles recouvertes de poly-L-lysine ou une chambre à lamelle, puis incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant un minimum de six heures.Après l'incubation, les cellules T CD4+ seront adhérées aux lamelles. Retirez soigneusement le milieu des puits, puis ajoutez lentement 500 microlitres de PBS stérile. L'ajout de PBS lors du lavage doit être effectué avec beaucoup de précaution, en particulier lors de la préparation de chambres porte-objets contenant moins de 50 000 cellules par puits.Aspirez le PBS et ajoutez 500 microlitres supplémentaires de PBS dans les puits afin d'éliminer complètement le milieu de culture. Après avoir retiré tout le PBS, ajoutez 500 microlitres de paraformaldéhyde filtré à 4 % et incubez pendant 30 minutes à température ambiante pour fixer les cellules. Après la fixation, retirez le fixateur et lavez au moins deux fois avec du PBS.Si désiré, la plaque peut être conservée avec 500 microlitres de PBS dans chaque puits pendant plusieurs jours à quatre degrés Celsius. Commencez par retirer le PBS des cellules fixées et ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage froid. Incubez pendant 20 minutes sur de la glace.Pendant l'incubation, il est essentiel de ne pas agiter vigoureusement la plaque, car cela risquerait d'éliminer les cellules. Aspirez délicatement le tampon de blocage et ajoutez un tampon de blocage contenant 2,5 microgrammes par millilitre de l'un des anticorps primaires ou de l'anti-CD25 conjugué au PE, de l'anti-TCR conjugué à l'APC ou d'un contrôle d'isotype. Incubez deux heures sur de la glace en protégeant de la lumière ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.Après l'incubation, retirez soigneusement la solution d'anticorps et ajoutez lentement 500 microlitres de PBS. Ajoutez ensuite les anticorps secondaires appropriés dilués dans le tampon de blocage à 0,1 microgramme par millilitre. Protégez de la lumière et incubez une heure sur de la glace en prenant soin d'éviter tout agitation.Après avoir lavé trois fois dans le PBS comme précédemment, ajoutez la coloration Hoechst diluée dans le PBS à 0,1 microgramme par millilitre et incubez, à l’abri de la lumière, pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, placez les lames lavées sur une serviette en papier et ajoutez 20 microlitres de solution de montage ou de solution de montage commerciale afin d’éviter la décoloration et l’extinction de la fluorescence. Enfin, prenez une lamelle avec des pinces fines, retournez-la face vers le bas et placez-la sur la solution de montage de sorte que le côté de la lamelle sur lequel les cellules sont fixées soit en contact avec la solution.Scellez les lamelles avec du vernis à ongles et analysez à l’aide d’une microscopie à fluorescence ou confocale. Cette image montre une visualisation en champ clair de cellules T CD4+ fixées 72 heures après leur activation. La validation d'une activation efficace après coloration est évaluée à l’aide d’un anticorps anti-CD25 représenté en rouge.Le ganglioside GD3 est localisé au niveau intracellulaire et à la surface des cellules T CD4+, comme le montre la coloration par l'anticorps anti-GD3, représenté en vert. Le GD3, à nouveau représenté en vert, ne présente pas de co-localisation avec le TCR, illustré en rouge, comme le révèle une double coloration par les anticorps anti-GD3 et anti-TCR. En revanche, le ganglioside GD2 co-localise avec le TCR dans les cellules T CD4+, comme le montre la coloration par l'anticorps anti-GD2, représenté en vert, et celle par l'anticorps anti-TCR, représenté en rouge.La coloration du ganglioside GD3 montre la localisation intracellulaire et à la surface cellulaire dans un sous-ensemble de PBMC activés. Alors que la coloration du ganglioside GD2 montre une localisation intracellulaire et à la surface cellulaire dans tous les PBMC activés. Après cette procédure d'adhérence et de manipulation des cellules T CD4+, d'autres méthodes telles que la coloration des compartiments intracellulaires peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la localisation ou le traitement intracellulaire spécifique des gangliosides.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment manipuler et fixer un faible nombre de cellules T CD4+ afin d'obtenir des images de microscopie de fluorescence de haute qualité pour analyser l'expression des gangliosides.

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