In vitro Enregistrement de mésentérique Afférent activité nerveuse chez la souris jéjunale et Segments colique

L'objectif général de cette technique est d'enregistrer in vitro l'activité des nerfs afférents splanchiques à partir d'un seul faisceau nerveux jéjunal ou colique en réponse à des distensions progressives et à l'application de composés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que de savoir si les nerfs afférents qui innervent le tube digestif sont hypersensibilisés ou désensibilisés lors de divers états pathologiques. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle permet l'enregistrement de la décharge nerveuse in vitro et qu'elle permet de quantifier l'activité nerveuse sans modulation ni entrées provenant du système nerveux central.

L'application de cette technique s'étend au traitement ou au diagnostic de plusieurs syndromes douloureux, tels que le syndrome du côlon irritable, puisque la sensibilisation nerveuse joue un rôle majeur dans la pathogenèse. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la dissection des faisceaux nerveux et l'analyse unitaire unique du signal enregistré nécessitent une formation substantielle. Pour commencer cette procédure, placer la souris sacrifiée en position dorsale.

Réalisez une incision médiane abdominale à travers la peau et la couche musculaire abdominale à l’aide d’un scalpel, en partant du processus xiphoïde jusqu’au pubis. Ensuite, rincez la cavité abdominale avec une solution froide de Krebs afin d’éviter le dessèchement des tissus intra-abdominaux. Puis, excisez rapidement tout le jéjunum à l’aide de ciseaux pointus, en retirant environ 20 centimètres de l’intestin grêle, en commençant immédiatement au niveau de la flexure duodéno-jéjunale.

Veillez à ne pas endommager les structures environnantes et conservez intact le mésentère de l'intestin grêle, qui contient les vaisseaux sanguins jéjunaux et les nerfs afférents. Ensuite, placez le jéjunum excisé dans une solution froide de Krebs sur de la glace tout en l'oxygénant continuellement avec du Carbigen. Puis, découpez le jéjunum en anses d'environ trois centimètres de longueur.

Localisez le cordon mésentérique contenant les vaisseaux et le nerf splanchique près du centre de la boucle respective afin de faciliter le montage de la boucle dans la chambre d’enregistrement. Ensuite, rincez chaque segment avec une solution de Krebs à l’aide d’un cathéter contondant pour éliminer le contenu luminal et le chyme, car ceux-ci contiennent des enzymes digestives qui accéléreront la détérioration de l’échantillon de tissu in vitro. Par la suite, sélectionnez un segment pour mesurer l’activité nerveuse afférente et placez-le dans la chambre d’enregistrement recouverte d’une couche d’élastomère de silicone.

Conserver la température du Krebs dans la chambre d’enregistrement à 34 degrés Celsius. Ensuite, monter le segment jéjunal dans le bain d’organe de manière à ce que l’extrémité orale soit reliée au pilote de seringue assurant le flux luminal et que l’extrémité aborale soit connectée au débit de sortie. Étirer légèrement le segment, mais prendre soin de ne pas exercer une tension excessive.

Fixez fermement les deux extrémités à l'aide de ligatures en soie aux orifices d'entrée et de sortie. Ensuite, fixez le pilote de seringue à l'extrémité orale et perfusez le segment jéjunal de manière intraluminale avec une solution de Krebs à 10 millilitres par heure. Épinglez le mésentère du segment intestinal monté à plat contre la couche inférieure en élastomère de silicone.

Ensuite, étirez le mésentère afin d'optimiser la visualisation du cordon mésentérique. Puis, effectuez un test de distension par paliers en fermant le port de sortie jusqu'à ce que la pression intraluminale du segment intestinal atteigne 60 millimètres de mercure, afin de vérifier qu'aucune solution de Krebs intraluminale ne s'échappe du segment monté. Observez une augmentation régulière de la pression intraluminale, sans interruption.

Prévoir de petites contractions du segment pendant la phase initiale de distension. Si nécessaire, bloquer l'activité péristaltique en ajoutant un micromole du bloqueur des canaux calciques de type L, la nifédipine, à la solution de Krebs. Sous un microscope stéréo, commencer délicatement à retirer le tissu adipeux du mésentère en le tirant doucement avec deux petites pinces, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux et le nerf afférent qui sont enfouis dans le tissu adipeux.

Commencez par détacher le tissu adipeux à distance du jéjunum afin d'exposer les deux vaisseaux sanguins du cordon mésentérique. Identifiez le nerf jéjunal afférent, situé entre les deux vaisseaux, sous la forme d'un fin filament blanc encapsulé dans le tissu adipeux. Ensuite, disséquez-le plus en amont, en direction du jéjunum, en écartant délicatement le tissu adipeux à l’aide de pinces.

Ensuite, disséquez le nerf mésentérique du jéjunum en retirant le tissu adipeux adhérent au nerf. Sectionnez le nerf à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins. Si nécessaire, retirez délicatement la graisse résiduelle ainsi que le tissu conjonctif et la gaine épineurale en tirant doucement dessus.

Dans cette procédure, utilisez un micromanipulateur pour abaisser la pointe de l'électrode de succion dans le bain d'organe. Ensuite, aspirez délicatement un peu de solution de Krebs du bain d'organe, de sorte que la pointe de l'électrode soit immergée dans la solution de Krebs. Veillez à ce que la solution de Krebs recouvre l'électrode métallique située à l'intérieur de l'électrode de succion.

Ensuite, positionnez la pointe de l'électrode d'aspiration immédiatement à côté du cordon nerveux afférent sectionné et aspirez le cordon nerveux sectionné dans le capillaire sur toute sa longueur. Dirigez la pointe de l'électrode vers le tissu adipeux, puis aspirez ce dernier dans le capillaire en verre à l’aide du piston, scellant ainsi mécaniquement le nerf dans le capillaire et l’isolant du contenu du bain d'organe. Un scellement adéquat du capillaire en verre par rapport à la chambre d’enregistrement, obtenu en aspirant une partie du tissu graisseux environnant dans le capillaire, est essentiel afin de minimiser le bruit de fond parasite qui compromettrait in fine l’analyse finale.

Pour vérifier l'enregistrement de l'activité nerveuse afférente, effectuez une augmentation progressive de la pression dans le segment intestinal en fermant le port de sortie, ce qui provoque une montée graduelle de la pression et une augmentation de la fréquence de décharge afférente. N'effectuez le protocole expérimental souhaité que lorsque trois distensions progressives consécutives produisent une décharge multineuronale reproductible. Après l'isolement du nerf, stabilisez la préparation pendant 15 minutes afin d'obtenir une activité nerveuse afférente spontanée stable avant de réaliser les expériences proprement dites.

Voici une représentation schématique de différentes unités de fibres afférentes selon leur profil mécanosensible. Les fibres à seuil bas présentent principalement une activité nerveuse accrue à de faibles pressions d'étirement, ce qui se traduit par un pourcentage de fibres à seuil bas (LT) supérieur à 55 %. Les unités à seuil élevé, au contraire, n'augmentent leur fréquence de décharge qu'en réponse à des pressions douloureuses. Les fibres à large plage dynamique montrent une augmentation progressive de l'activité nerveuse tout au long de l'étirement, tandis que les fibres mécaniquement insensibles ne répondent pas aux pressions croissantes d'étirement.

Cette figure montre la décharge du nerf afférent mésentérique chez les souris de type sauvage pendant une distension progressive. Remarquez que, dans le profil de distension biphasique, l'augmentation initiale de la décharge nerveuse est due aux fibres à seuil bas et à large gamme dynamique, tandis que les fibres à seuil élevé et à large gamme dynamique contribuent à la seconde augmentation de la décharge. Une fois maîtrisée, l'isolation du nerf jéjunal et l'enregistrement initial de la ligne de base peuvent être réalisés en moins d'une heure si les manipulations sont effectuées correctement.

Un temps plus long est nécessaire lors de l'étude de l'effet de composés administrés dans le bain d'organe. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une approche bien standardisée, comme l'identification systématique du même segment pour toutes les expériences. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'isolement des ganglions de la racine dorsale suivie d'une imagerie calcique, peuvent être réalisées afin d'évaluer quelles stations relais du système nerveux gastro-intestinal sont impliquées dans la pathogenèse de plusieurs maladies.

Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine des neurosciences d'explorer la pathogenèse de plusieurs syndromes douloureux dans le cadre de recherches gastro-intestinales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode permettant d'isoler les nerfs afférents du jéjunum à partir du tractus gastro-intestinal de la souris, et d'enregistrer leur activité au cours de distensions progressives.