Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules d'ADN modifié comme un exemple

L’objectif général de cette procédure est de caractériser la chimie de surface des nanoparticules à l’aide de la post-détection résistante accordable, ou TRPS, et de déterminer le potentiel zêta du matériau. C’est ce que démontre la caractérisation de nanoparticules modifiées par l’ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la caractérisation des nanomatériaux et le développement d’essais biologiques.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’effectuer une analyse particule par particule. Chaque signal de particule d’ADN est traduit en une mesure du potentiel zêta, fournissant une image complète de l’échantillon analysé. La méthode la plus ancienne pourrait donner un aperçu de la caractérisation des matériaux.

Il peut également être appliqué à d’autres applications, telles que le développement d’essais biologiques pour la détection de cellules, de virus, d’ADN et de protéines. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il ne s’agit pas simplement d’injecter le samp et d’attendre la réponse. Il faut une certaine contribution du scientifique.

Pour commencer cette procédure, vortex les particules enrobées de streptavidine pendant 30 secondes avant de sonicationner pendant deux minutes à 80 watts pour assurer la monodispersion. Diluez les particules enrobées de streptavidine une sur cent dans un tampon PBST pour obtenir une concentration résultante de une fois dix à neuf particules par millilitre. Ensuite, faites tourbillonner les particules pendant 30 secondes.

Basé sur une capacité de liaison de 4 352 picomols par milligramme à la concentration appropriée d’ADN aux particules pour les concentrations résultantes de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 et 210 nanomolaires. Après avoir fait tourbillonner les échantillons pendant 10 secondes, placez-les sur une roue rotative à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre à l’ADN de se lier à la surface des particules via une interaction streptavidine et biotine. Une fois que l’ADN capturé a été ajouté et incubé avec les particules, retirez l’excès d’ADN et la solution par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur un support magnétique pendant 30 minutes.

Ensuite, retirez le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber l’amas de particules nouvellement formé, le plus proche de l’aimant. Remplacez ensuite le surnageant par le même volume de tampon PBST frais. Ajoutez maintenant la quantité requise d’ADN cible à chaque échantillon pour vous assurer que la liaison maximale possible à la cible a été atteinte.

Agitez les échantillons pendant 10 secondes. Et placez-les sur la roue rotative à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois l’hybridation terminée, retirez l’excès d’ADN cible par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur le support magnétique pendant 30 minutes.

Retirez ensuite le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber l’amas de particules nouvellement formé, le plus proche de l’aimant. Remplacez ensuite le surnageant par le même volume de tampon PBST frais. Après avoir répété les étapes précédentes pour les échantillons en double, placez les échantillons sur la roue rotative à température ambiante pendant 16 heures pour étudier les temps d’hybridation de l’ADN.

À ce stade, branchez un instrument TRPS dans un système informatique avec un logiciel en place. À l’aide d’un pied à coulisse, mesurez la distance entre l’extérieur de deux mâchoires parallèles. Tapez la distance dans le champ d’étirement de l’onglet des paramètres de l’instrument et cliquez sur calibrer l’étirement sous l’onglet.

Ensuite, installez latéralement une membrane de nanopores de polyuréthane de taille appropriée pour l’analyse sur les mâchoires avec le numéro d’identification du nanopore vers le haut. Ensuite, étirez les mâchoires jusqu’à l’étirement nécessaire à l’analyse à l’aide de la poignée de réglage de l’étirement sur le côté de l’instrument. Placez 80 microlitres de tampon PBST dans la cellule inférieure du fluide sous le nanopore, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles présentes qui pourraient affecter la mesure.

Maintenant, enclenchez la cellule supérieure du liquide en place et ajoutez 40 microlitres de tampon, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles présentes. Placez ensuite une cage de Faraday sur le système et appliquez une pression externe comme décrit dans le protocole texte. Après avoir placé 40 microlitres de particules d’étalonnage dans la cellule de fluide supérieure, effectuez une mesure TRPS à trois tensions appliquées.

Modifiez la tension en cliquant sur les boutons plus et moins de l’échelle de tension dans l’onglet des paramètres de l’instrument dans le logiciel. Vérifiez que les trois tensions renvoient les courants de fond appropriés. Et assurez-vous qu’à la tension moyenne, les particules d’étalonnage produisent une amplitude de blocage moyenne d’au moins 0,3 nanoampères.

Une fois que les conditions décrites dans le protocole texte ont été remplies, lancez l’exécution en cliquant sur démarrer dans le logiciel dans l’onglet d’acquisition de données. Pour terminer la mesure, cliquez sur arrêter dans l’onglet Acquisition de données et enregistrez le fichier de données. Lavez le système en remplaçant plusieurs fois les particules d’étalonnage par 40 microlitres avec tampon PBST dans les cellules de fluide supérieures.

Et l’application de diverses pressions jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’événements de blocage, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de particules résiduelles et pas de contamination croisée. Une fois que le courant de base approprié est atteint, remplacez l’électrolyte dans la cellule de fluide supérieure par 40 microlitres d’échantillon. Démarrez l’exécution de l’exemple en cliquant sur Démarrer dans l’onglet Acquisition de données.

Enregistrez un minimum de 500 particules et assurez-vous que la durée d’exécution est d’au moins 30 secondes. Pour terminer la mesure, cliquez sur arrêter dans l’onglet Acquisition de données et enregistrez le fichier de données. Un exemple d’analyse de la taille et du potentiel zêta de particules recouvertes de streptavidine sans modifications et de particules recouvertes de streptavidine saturées d’ADN simple brin à la surface est présenté ici.

Bien que les deux échantillons soient de taille similaire, le potentiel zêta était significativement différent et beaucoup plus grand lorsque l’ADN était fonctionnalisé à la surface de la particule. Les données sur la taille et le potentiel zêta présentées pour les échantillons présentant les concentrations les plus faibles et les plus élevées d’ADN hybridé aux particules enrobées de streptavidine sont présentées ici. Une valeur de potentiel zêta plus élevée est enregistrée pour les particules hybridées avec une concentration plus élevée d’ADN.

La variation du potentiel zêta mesurée pour la capture d’ADN sondé uniquement, une cible d’ADN entièrement complémentaire, une cible d’ADN de liaison intermédiaire, une cible d’ADN de liaison d’extrémité et une cible d’ADN en surplomb est illustrée ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de bien laver un nanopôle entre chaque étalonnage et échantillon pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination croisée entre les échantillons et éviter tout blocage de nanopôles.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des biosens pour explorer les interactions protéine-protéine et protéine-ADN dans des tests multiplexes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir le potentiel zêta à l’aide du TRPS et de préparer des particules modifiées à l’ADN pour les essais biologiques.