Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules d'ADN modifié comme un exemple

L'objectif général de cette procédure est de caractériser la chimie de surface de nanoparticules à l'aide de la détection par résistance ajustable sur plots, ou TRPS (tunable resistive pulse sensing), et de déterminer le potentiel zêta du matériau. Cela est illustré par la caractérisation de nanoparticules modifiées par de l'ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la caractérisation des nanomatériaux et le développement de tests biologiques.

Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez effectuer une analyse particule par particule. Chaque signal provenant d'une particule d'ADN est traduit en une mesure de potentiel zêta, fournissant une image complète de l'échantillon analysé. La méthode la plus ancienne pouvait offrir des informations sur la caractérisation des matériaux.

Il peut également être appliqué à d'autres domaines, tels que le développement de tests biologiques pour la détection de cellules, de virus, d'ADN et de protéines. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il ne s'agit pas d'une simple injection de l'échantillon suivie d'une attente de la réponse. Une intervention de la part du scientifique est nécessaire.

Pour commencer cette procédure, vortexer les particules revêtues de streptavidine pendant 30 secondes avant une sonication de deux minutes à 80 watts afin d'assurer une monodispersion. Diluer les particules revêtues de streptavidine au 1/100 dans du tampon PBST pour obtenir une concentration finale de 1 × 10⁹ particules par millilitre. Ensuite, vortexer les particules pendant 30 secondes.

Sur la base d'une capacité de liaison de 4 352 picomoles par milligramme à la concentration appropriée d'ADN par rapport aux particules, pour des concentrations finales de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 et 210 nanomolaires. Après avoir vortexé les échantillons pendant 10 secondes, placez-les sur une roue rotative à température ambiante pendant 30 minutes afin de permettre la liaison de l'ADN aux surfaces des particules par une interaction streptavidine-biotine. Une fois l'ADN capturé ajouté et incubé avec les particules, éliminez l'excès d'ADN et de solution par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur un support magnétique pendant 30 minutes.

Ensuite, retirez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber l'amas nouvellement formé de particules, situé le plus près de l'aimant. Remplacez alors le surnageant par le même volume de tampon PBST frais. Ajoutez maintenant la quantité requise d'ADN cible à chaque échantillon afin de garantir une liaison maximale possible de la cible.

Vortexez les échantillons pendant 10 secondes. Placez-les ensuite sur la roue rotative à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois l'hybridation terminée, éliminez l'ADN cible en excès par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur le support magnétique pendant 30 minutes.

Ensuite, retirez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber l'amas nouvellement formé de particules, situé le plus près de l'aimant. Remplacez ensuite le surnageant par le même volume de tampon PBST frais. Après avoir répété les étapes précédentes pour les échantillons en double, placez les échantillons sur la roue rotative à température ambiante pendant 16 heures afin d'étudier les durées d'hybridation de l'ADN.

À ce stade, branchez un instrument TRPS à un système informatique disposant du logiciel approprié. À l’aide d’un pied à coulisse, mesurez la distance entre l’extérieur de deux mâchoires parallèles. Saisissez cette distance dans le champ « stretch » sous l’onglet des paramètres de l’instrument, puis cliquez sur « calibrate stretch » situé sous l’onglet.

Ensuite, insérez latéralement une membrane nanopore en polyuréthane de taille appropriée pour l'analyse sur les mâchoires, en orientant le numéro d'identification du nanopore vers le haut. Puis étirez les mâchoires à l'allongement requis pour l'analyse à l'aide de la poignée de réglage de l'étirement située sur le côté de l'appareil. Ajoutez 80 microlitres de tampon PBST dans la cellule inférieure située sous le nanopore, en veillant à ce qu'aucune bulle ne soit présente, car elle pourrait affecter la mesure.

Cliquez maintenant pour mettre en place la cellule supérieure de fluide et ajoutez 40 microlitres de tampon, en veillant à ce qu’il n’y ait aucune bulle. Ensuite, placez une cage de Faraday autour du système et appliquez une pression externe comme décrit dans le protocole textuel. Après avoir introduit 40 microlitres des particules d’étalonnage dans la cellule supérieure de fluide, effectuez une mesure TRPS à trois tensions appliquées.

Modifiez la tension en cliquant sur les boutons plus et moins de l'échelle de tension dans l'onglet de paramètres de l'appareil du logiciel. Vérifiez que les trois tensions restituent les courants de fond appropriés. Assurez-vous également qu’à la tension moyenne, les particules de calibration produisent une amplitude de blocage moyenne d’au moins 0,3 nanoampère.

Une fois les conditions décrites dans le protocole textuel atteintes, lancez l'analyse en cliquant sur « démarrer » dans le logiciel sous l'onglet d'acquisition des données. Pour terminer la mesure, cliquez sur « arrêter » dans l'onglet d'acquisition des données et enregistrez le fichier de données. Nettoyez le système en remplaçant les particules d'étalonnage par 40 microlitres de tampon PBST dans les cellules fluides supérieures, plusieurs fois.

Et appliquer différentes pressions jusqu'à ce qu'aucun événement de blocage ne soit plus observé, en s'assurant qu'il n'y ait aucune particule résiduelle ni contamination croisée. Une fois le courant de base approprié obtenu, remplacer l'électrolyte dans la cellule fluide supérieure par 40 microlitres d'échantillon. Démarrer l'analyse de l'échantillon en cliquant sur « Démarrer » dans l'onglet d'acquisition des données.

Enregistrez un minimum de 500 particules et assurez-vous que la durée d'acquisition est d'au moins 30 secondes. Pour terminer la mesure, cliquez sur « stop » dans l'onglet d'acquisition des données et enregistrez le fichier de données. Un exemple d'analyse de la taille et du potentiel zêta de particules revêtues de streptavidine sans modification et de particules revêtues de streptavidine saturées par de l'ADN simple brin à la surface est présenté ici.

Bien que les deux échantillons aient une taille similaire, le potentiel zêta était nettement différent et beaucoup plus élevé lorsque l'ADN était fixé à la surface des particules. Les données de taille et de potentiel zêta obtenues pour les échantillons ayant les concentrations les plus faibles et les plus élevées d'ADN hybridé sur les particules revêtues de streptavidine sont présentées ici. Une valeur plus élevée de potentiel zêta est enregistrée pour les particules hybridées avec une concentration plus forte d'ADN.

La variation du potentiel zêta mesurée pour l'ADN marqué de capture uniquement, une cible d'ADN complémentaire complète, une cible d'ADN à liaison intermédiaire, une cible d'ADN à liaison terminale et une cible d'ADN en surplomb est présentée ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien se rappeler de rincer soigneusement une nanopointe entre chaque étalonnage et échantillon afin d'éviter toute contamination croisée entre les échantillons et de prévenir tout blocage de la nanopointe.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des biocapteurs pour explorer les interactions protéine-protéine et protéine-ADN dans des tests multiplex. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment obtenir le potentiel zêta à l'aide de la TRPS et préparer des particules modifiées par de l'ADN pour des tests biologiques.