Name: Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules dADN modifié comme un exemple (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Découvrez la détermination du potentiel zêta de nanoparticules modifiées par ADN en utilisant la technique TRPS. Cette méthode permet une analyse particule par particule pour caractériser la chimie de surface des nanomatériaux.

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Les auteurs remercient Izon Science Ltd pour leur soutien. Le travail a été soutenu par la Commission européenne pour la recherche (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).

1. Faire de la saline tamponnée au phosphate avec du Tween-20 (PBST) Buffer <ol><li> Dissoudre un comprimé de PBS (0,01 M tampon phosphate 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium, pH 7,4) dans 200 ml d&#39;eau déminéralisée (18,2 MQ cm). </li><li> Ajouter 100 ul (0,05 (v / v)%) Tween-20 à la solution tampon de 200 ml en tant que tensio-actif. </li></ol> 2. Préparation des normes de particules Carboxyl Polystyrène <ol><li> Vortexer les particules d&#39;étalonnage pendant 30 secondes avant la sonification pendant 2 minutes à 80 watts pour créer monodispersité des particules. </li><li> Diluer les particules d&#39;étalonnage à 1 100 à une concentration de 1x10 10 particules / ml dans un tampon PBST et vortexer pendant 30 secondes. </li></ol> 3. Préparation des particules recouvertes de streptavidine <ol><li> Vortex les particules pendant 30 secondes avant sonication pendant 2 min à 80 watts pour assurer monodispersité. </li><li> Diluer les particules revêtues de streptavidine 1 à 100 dans un tampon PBST à courant alternatifHieve une concentration résultante de 1x10 9 particules / ml et vortexer pendant 30 secondes. Remarque: Un volume d&#39;échantillon typique est de 200 ul. Par exemple, si l&#39;instruction cinq concentrations d&#39;ADN préparer 1 ml de particules revêtues de streptavidine diluées. </li></ol> 4. Préparation d&#39;oligonucléotides <ol><li> Reconstituer oligonucléotides avec de l&#39;eau déminéralisée à une concentration résultante de 100 uM. </li></ol> 5. Ajout de capture de la sonde (CP) de l&#39;ADN aux particules recouvertes de streptavidine <ol><li> Avant de liaison à l&#39;ADN, vortex les streptavidine particules enrobées (200 volumes d&#39;échantillon pi) pendant 30 secondes, suivie d&#39;une 2 min sonication à 80 watts. </li><li> Sur la base de la capacité de liaison fournie par le fournisseur (4352 pmol / mg), d&#39;ajouter la concentration appropriée de l&#39;ADN aux particules pour les concentrations résultantes de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 et 210 nM d&#39;ADN. </li><li> Vortex les échantillons pendant 10 secondes et les placer sur une roue rotative à la température ambiantependant 30 minutes pour permettre à l&#39;ADN de se lier aux surfaces des particules par l&#39;intermédiaire d&#39;une interaction streptavidine-biotine. </li><li> Une fois que l&#39;ADN de capture a été ajouté et mis en incubation avec les particules revêtues de streptavidine, éliminer l&#39;excès d&#39;ADN en solution par l&#39;intermédiaire d&#39;une séparation magnétique en plaçant les échantillons sur une grille magnétique pendant 30 min. </li><li> Retirer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le cluster nouvellement formé de particules les plus proches de l&#39;aimant, et le remplacer par le même volume de nouveau tampon de PBST. </li></ol> 6. Hybridation ADN complémentaire aux CP-particules <ol><li> Ajouter la quantité requise de l&#39;ADN cible (en excès à 500 nM) pour assurer la liaison a été atteint la cible maximale possible. </li><li> Vortex les échantillons pendant 10 secondes et les placer sur une roue rotative à la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Une fois que l&#39;hybridation est terminée, retirez l&#39;ADN cible en excès par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur une grille magnétique pendant 30 min. </li><li> Retirer le surnageant, En prenant soin de ne pas perturber le cluster nouvellement formé de particules les plus proches de l&#39;aimant, et le remplacer par le même volume de nouveau tampon de PBST. </li><li> Répétez les étapes 6.1 à 6.4 pour les échantillons en double et placer ces échantillons sur une roue rotative à la température ambiante pendant 16 heures pour étudier les temps d&#39;hybridation d&#39;ADN. </li></ol> Configuration 7. TRPS <ol><li> Branchez l&#39;appareil dans un système informatique avec le logiciel en place. </li><li> Calibrer le tronçon initial à l&#39;aide d&#39;un étrier. <ol><li> Mesurer la distance entre l&#39;extérieur des deux mâchoires parallèles. </li><li> Entrée dans le logiciel en tapant l&#39;étirement dans le champ «stretch» ​​dans l&#39;onglet «Paramètres Instrument et en cliquant sur« Calibrer stretch &#39;sous l&#39;onglet. </li></ol></li><li> Latéralement adapter une membrane de polyuréthane nanopore de dimensionnement approprié pour l&#39;analyse sur les mâchoires avec le nombre nanopore ID vers le haut. Ensuite, étirer les mâchoires à l&#39;étirement nécessaire à l&#39;analyse à l&#39;aide duPoignée de réglage extensible sur le côté de l&#39;instrument. Étirez les mâchoires entre 43 et 48 mm. Note: La valeur exacte de l&#39;étendue est déterminée aux côtés de la tension appliquée afin que les blocages d&#39;étalonnage de particules sont au moins 0,3 nA en taille. Le tronçon est déjà entré dans le logiciel à l&#39;étape 7.2 et ajustera automatiquement les mâchoires sont tendues. </li><li> Placez 80 pi de tampon PBST dans la cellule fluide inférieure, sous le nanopore, assurant qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles présentes qui peuvent affecter la mesure. S&#39;il y a des bulles vu, enlever et remplacer le tampon. </li><li> Cliquez sur la cellule de fluide supérieure en place et placer 40 ul de tampon en elle, assurant à nouveau il n&#39;y a pas de bulles présente. Si des bulles sont présentes dans la cellule fluide supérieur, retirez-les en remplaçant le liquide. </li><li> Lorsqu&#39;un courant de référence reproductible a été atteint de remplacer la cellule de fluide supérieure avec un tampon, ajouter 40 ul de l&#39;échantillon dans la cellule de mesure de fluide supérieure et en cliquant sur &quot;start &quot;dans l&#39;onglet&quot; Data Acquisition &quot;sur l&#39;écran du logiciel. Remarque: L&#39;acquisition des données est terminée à une fréquence de 50 kHz avec une limite d&#39;une magnitude de blocage inférieure de 0,05 nA, même si cela peut être modifié à l&#39;aide du logiciel via l&#39;onglet &#39;Analyse de données&#39; (sous la rubrique «Paramètres d&#39;analyse» et «Resistive Blockades &#39;) . </li><li> Placer une cage de Faraday sur la partie supérieure du système de cellules de fluide pour réduire le bruit de fond électrique sur les mesures. </li><li> Utilisez un module de pression variable (VPM) pour appliquer une pression ou un aspirateur pour les échantillons. <ol><li> Pour appliquer une pression externe Brancher la buse sur la cellule fluide supérieur, puis tourner le bras de pression et cliquez en place (selon que la pression positive (PRE) ou un vide (VAC) seront appliqués). </li><li> Appliquer une pression dans un «cm» ou échelle »mm» en utilisant le bouton de niveau de pression situé sur le haut de la VPM. Appuyez sur le bouton vers le bas pour appliquer une pression sur l&#39;échelle «cm» et tirer vers le haut to appliquer une pression sur l&#39;échelle &#39;mm&#39;. </li></ol></li></ol> 8. Préparation des échantillons pour l&#39;analyse de TRPS <ol><li> échantillons Vortex pendant 30 secondes et sonication pendant 2 min à 80 watts avant l&#39;analyse de TRPS. </li></ol> 9. Calibrage de l&#39;Nanopore pour l&#39;analyse Zeta <ol><li> Après avoir placé 40 particules d&#39;étalonnage ul (1x10 10 particules / ml) dans la cellule fluide supérieur, effectuer une mesure de TRPS (configuration comme dans la section 7) à 3 tensions appliquées. Modifiez la tension en cliquant sur le &#39;+&#39; et &#39;-&#39; des boutons sur l&#39;échelle de tension dans l&#39;onglet &quot;Paramètres Instrument sur le logiciel. </li><li> Vérifiez que les 3 tensions retour courants d&#39;environ 140, 110 arrière-plan, et 80 nA. Veiller à ce que, à la tension moyenne des particules d&#39;étalonnage produisent une magnitude de blocage moyenne d&#39;au moins 0,3 nA. </li><li> Appliquer une pression de sorte que la moitié pleine largeur maximale moyenne (FWHM) durées des particules d&#39;étalonnage sont au moins0,15 ms. Pour ce faire manuellement à l&#39;aide du bras de pression fixé au module de pression variable. Sélectionnez la pression (PRE) ou vide (VAC) en faisant tourner le bras jusqu&#39;à ce qu&#39;il clique dans la position désirée et appliquer en conséquence ce qui suit a mis en place des instructions à l&#39;étape 7.8.2. Une fois que ces conditions ont été atteints, commencer la course en cliquant sur «start» sur le logiciel dans l&#39;onglet «Acquisition des données». </li><li> Terminez la course en appuyant sur «stop» dans l&#39;onglet «Acquisition des données» quand au moins 500 particules ont été mesurées (voir «comte de particules&quot; au bas de l&#39;écran du logiciel lors de la mesure) et la course a dépassé 30 sec (voir &#39; Run Time &#39;également vers le bas de l&#39;écran). </li><li> Calibrer le système en remplissant une course d&#39;étalonnage comme indiqué chaque fois qu&#39;une nouvelle nanopore est introduite ou pour chaque nouveau jour de l&#39;analyse en remplissant étape 9.1-9.4. </li></ol> 10. Exécution d&#39;un échantillon <ol><li> Exécutez les échantillons au plus haut oudeuxième tension la plus élevée que les échantillons d&#39;étalonnage à assurer un similaire (± 10 nA), sinon le même, le courant de référence. <ol><li> Une fois que le courant de référence approprié est atteint, remplacer l&#39;électrolyte dans la cellule de fluide supérieure à 40 pl de l&#39;échantillon. Quand un échantillon est introduit, les blocages seront visibles sur la trace du signal. Démarrez l&#39;échantillon exécuter en cliquant sur &#39;start&#39; dans l&#39;onglet &quot;Data Acquisition&quot; et enregistrer un minimum de 500 particules (cocher «nombre de particules» situé sous la trace du signal) et assurer le temps d&#39;exécution est un minimum de 30 secondes (voir &#39;Run Time &#39;également situé au-dessous de la trace du signal). </li><li> Pour terminer la mesure, cliquez sur «stop» dans l&#39;onglet &quot;Data Acquisition&quot; et enregistrez le fichier de données. </li></ol></li><li> Pour enregistrer le fichier, saisissez les informations de fichier dans le format suivant; «Enquête» est le dossier le fichier sera enregistré dans, &#39;Nanopore ID&#39; est le numéro de série du pore utilisé, &#39;Part #&#39; iest le type de pores (ie, NP150 / NP200), «ID échantillon» est le nom de l&#39;échantillon, &#39;étalonnage ou de l&#39; échantillon &quot;détails si elle est une mesure d&#39;étalonnage ou de l&#39; échantillon,« Dilution »est utilisé si l&#39;échantillon a été dilué ( tapez 100 si l&#39;échantillon a été dilué 100 fois), «pression» est la pression appliquée à l&#39;échantillon (en cm - voir la section 7.8), &#39;Electrolyte ID&#39; est le nom de la mémoire tampon de l&#39;échantillon est composé de, et &#39; Remarques »sont des notes personnelles sur l&#39;échantillon ou courir. </li><li> Entre chaque échantillon run, laver le système en plaçant 40 pl de PBST tampon dans la cellule fluide supérieur à plusieurs reprises et en appliquant différentes pressions (habituellement à -10, -5 cm (vide), et 5 et 10 cm (à pression positive)) jusqu&#39;à ce que pas plus d&#39;événements de blocus sont présents, assurant qu&#39;il n&#39;y a pas de particules résiduelles dans le système, et donc pas de contamination croisée entre les échantillons. échantillons en triple avec cette étape de lavage terminé entre chaque échantillon de répétition fonctionnent comme well entre différents échantillons. </li></ol>

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<html> Le calcul du potentiel zêta utilisé une méthode basée sur l&#39; étalonnage lié au travail par Arjmandi et al. 21. La durée de la translocation des particules lorsqu&#39;elles traversent un nanopore est mesurée en fonction de la tension appliquée, en utilisant une vitesse moyenne de champ électrique et de particules sur la totalité d&#39;un pore conique régulière. La mobilité électrophorétique est la dérivée de 1 / T (où T est la durée du blocage) par rapport à la tension, multipliée par le car...

nanoparticules fonctionnalisés sont de plus en plus populaire en tant que biocapteurs dans les deux domaines de la médecine et de l&#39;environnement. La possibilité de modifier la chimie de surface d&#39;une nanoparticule, avec de l&#39; ADN, par exemple, se révèle utile pour les systèmes de délivrance de médicaments ciblés 1 et de suivi des interactions ADN-protéines 2-4. Une propriété de nanoparticules de plus en plus commun étant utilisé dans des essais biologiques et dans la prestation de produits thérapeutiques est superparamagnétisme 5. particules superparamagnétiques (SPPS) sont extrêmement utiles pour identifier et éliminer les analytes spécifiques à partir de mélanges complexes et peuvent le faire avec la simple utilisation d&#39;un seul aimant. Une fois enlevés, les particules d&#39;analyte lié peuvent être caractérisés et analysés adaptés à l&#39;usage. Les procédés antérieurs utilisés pour la détection et la caractérisation des nanoparticules comprennent des techniques optiques telles que la diffusion dynamique de lumière (DLS), autrement connu comme la spectroscopie de corrélation de photons. Bien qu&#39;un saluttechnique de débit gh, DLS est limitée à être une technique basée sur la moyenne et lors de l&#39; analyse des échantillons multimodaux sans ajout de logiciels spécialisés, les plus grosses particules produisent un signal beaucoup plus dominante, laissant certaines des plus petites particules complètement inaperçues 6,7. Particule par particule techniques de caractérisation sont donc beaucoup plus favorable pour analyser nanoparticule et les systèmes de nanoparticules fonctionnalisés. technologies basées RPS sont basés sur l&#39;application d&#39;un champ électrique à un échantillon et la surveillance du mécanisme de transport des particules à travers un nanopore synthétique ou biologique. Une technique relativement récente de détection de nanoparticules et la caractérisation basée sur RPS est résistive accordable impulsion de détection (TRPS) 8-16. TRPS est un système à deux électrodes séparées par une membrane poreuse en élastomère, accordable. Une méthode accordable de pores permet analytes d&#39;une gamme de forme 17 et la taille à mesurer via leur transdes mécanismes de port à travers les pores. Les pores accordables ont déjà été utilisés pour la détection de petites particules (diamètre 70-95 nm) produisant des résultats comparables à d&#39; autres techniques telles que la spectroscopie électronique à transmission (MET) 10. Lorsqu&#39;un champ électrique est appliqué, un courant ionique est observé et que des particules / molécules passent à travers les pores, ils bloquent temporairement les pores, ce qui provoque une réduction du courant qui peut être défini comme un «événement de blocage. Chaque événement de blocus est représentatif d&#39;une seule particule de sorte que chaque particule dans un échantillon peut être caractérisé individuellement en fonction de l&#39;ampleur du blocus, Δ <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54577/54577eq1.jpg" /> Et toute la largeur à mi-hauteur, LMH, ainsi que d&#39; autres propriétés de blocus. L&#39;analyse des particules individuelles lors de leur passage à travers un nanopore est avantageux pour les échantillons multimodales comme TRPS peuvent réussir et efficacement distinguer une gamme de tailles de particules amongst un seul échantillon. Accordable détection d&#39;impulsion résistive complète taille 10, zeta potentiels 12,18 et la concentration de 15 mesures simultanément en une seule opération et peut donc différencier encore des échantillons de semblable, sinon la même taille par leur charge de surface 19; un avantage par rapport aux techniques de dimensionnement alternatives. Le potentiel zêta est défini comme étant le potentiel électrostatique au niveau du plan de cisaillement 20, et elle est calculée à partir des vitesses de particules comme ils traversent un pore 19. mesures de potentiel Zeta de particules individuelles donne ainsi un aperçu des mécanismes et le comportement des systèmes de nanoparticules en solution, de précieuses informations pour l&#39;avenir des modèles de test de nanoparticules pour une gamme d&#39;applications translocation. analyse de particules par particule de cette nature permet également la diffusion et la distribution des valeurs de potentiel zêta parmi un échantillon de population à explorer, permettant plus d&#39;informations ocinétique n de réaction (simple brin à l&#39;ADN double brin, par exemple) et des stabilités de particules en solution à atteindre. Ici, nous décrivons une technique qui détecte et caractérise les deux surfaces SPP non modifiées et modifiées par l&#39;ADN. Le protocole décrit ici est applicable à toute une gamme de nanoparticules inorganiques et biologiques, mais nous démontrons la procédure en utilisant des surfaces d&#39;ADN modifiées en raison de leur large éventail d&#39;applications. Cette technique permet à l&#39;utilisateur de distinguer entre les cibles d&#39;ADN simple brin et double brin sur une surface nanoparticulaire, sur la base des vitesses de translocation de particules à travers un système de pores et donc leurs potentiels zêta.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma Aldrich, Royaume-Uni</td><td>P4417</td><td>1 comprimé dissous dans 200&nbsp ; ml d’eau désionisée pour faire une solution tampon.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich, Royaume-Uni</td><td>P1379</td><td>0,05 % (v/v) dans un tampon PBS en tant que tensioactif</td></tr><tr><td>Nanoparticules de polystyrène carboxyle</td><td>Bangs Laboratories, US</td><td>CPC200</td><td>Diamètre nominal de 220&nbsp ; nm, concentration brute de 1 x 1012 particules/ml, charge de surface spécifique de 86 & micro ; eq/g (équivalent à une densité de charge de surface de 3,2 x 1019 C/nm2.</td></tr><tr><td>Nanoparticules enrobées de streptavidine</td><td>Ademtech, France</td><td>3121</td><td>Le lot avait une capacité de liaison de 4 352 pmol/mg (capacité théorique de liaison à l’ADN de 188 nM) à une concentration brute de 1,1 x 1011 particules/ml.</td></tr><tr><td>Oligonucléotides biotinylés</td><td>Sigma Aldrich, Royaume-Uni</td><td>VC00001</td><td>Spécification du fournisseur : Purification de phase 1 inverse (échelle 0,05) ; Modification de la biotine à l’extrémité 3' ; Poudres lyophilisées reconstituées à 100&nbsp ; et micro ; M à l’aide d’eau désionisée et diluée au besoin. Séquences : CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC
GCGTGGC[Btn]3'Standard</td></tr> <tr><td>olignonucleotides</td><td>Sigma Aldrich, Royaume-Uni</td><td>VC00001</td><td>Spécifications du fournisseur : Purification de phase inverse 1 (échelle 0,05) ; Poudres lyophilisées reconstituées à 100 & micro ; M à l’aide d’eau désionisée et diluée au besoin. Séquences des cibles d’ADN : Entièrement complémentaires - 5'GCCACGCGTAGTGA
GGTTTAACCAT3', Reliure centrale - 5'GTAGTGAGGT3', Reliure d’extrémité - 5'GTTTAACCAT3', Porte-à-faux partiellement complémentaire - 5'GTGAGGTTTAACCAT
TTTTTTTTTTTTTTT3 ».</td></tr><tr><td>Izon qNano</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>Pression inhérente sur le système de 47&nbsp ; </td></tr><tr><td>Module à pression variable (VPM)Izon</td> <td>Science, NZ</td><td></td><td>Chaque « cm » de pression équivaut à environ 100 Pa.</td></tr><tr><td>Membranes nanoporeuses de polyuréthane</td><td>Izon Science, NZ</td><td>NP150</td><td>Gamme de taille d’analyte 60-480 nm, diamètre des pores calculé à 799 nm avec un étirement de 45 mm.</td></tr><tr><td>Magrack 6</td><td>GE Healthcare, Royaume-Uni</td><td>28-9489-64</td><td></td></tr><tr><td>Bain sonique</td><td>Fisher Scientific, Royaume-Uni</td><td>10692353</td><td>Vortexer 80 watts</td></tr><tr><td></td><td>IKA, Allemagne</td><td>0003365000</td><td></td></tr><tr><td>Roue rotative&nbsp ;</td><td>Labnet International, États-Unis</td><td>H5500-230 V</td><td></td></tr></tbody></table>

détermination du potentiel zeta via nanoparticulaires translocation velocities à travers un accordable nanopore: utilisation de particules d&#39;adn modifié comme un exemple

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

technologies de Nanopore, connus collectivement comme capteurs de pulsations résistifs (RPS), sont utilisées pour détecter, quantifier et caractériser les protéines, les molécules et les nanoparticules. détection d&#39;impulsion résistive accordable (de TRPS) est une adaptation relativement récente au RPS qui incorpore un pore accordable peut être modifiée en temps réel. Ici, nous utilisons TRPS pour surveiller les temps de translocation des nanoparticules d&#39;ADN modifiées comme ils traversent la membrane poreuse réglable en fonction de la concentration d&#39;ADN et de la structure ( par exemple, simple brin en ADN double brin). TRPS repose sur deux électrodes Ag / AgCl, séparés par une membrane poreuse en élastomère qui établit un courant ionique stable lors d&#39;un champ électrique appliqué. Contrairement à diverses technologies de caractérisation des particules optiques à base, TRPS peuvent caractériser des particules individuelles dans une population de l&#39;échantillon, ce qui permet pour les échantillons multimodales à analyser avec facilité. Ici, nous démontrons mesures du potentiel zêtavia des vitesses de translocation de particules de normes connues et les appliquer à l&#39;échantillon des temps de translocation analyte, conduisant ainsi à la mesure du potentiel zeta de ces analytes. En plus d&#39;acquérir des valeurs de potentiel zêta moyennes, les échantillons sont tous mesurés en utilisant une perspective particule par particule présentant plus d&#39;informations sur un échantillon donné par l&#39;échantillon répartition de la population, par exemple. De ce fait, cette méthode démontre un potentiel dans les applications de détection pour les domaines médicaux et environnementaux.

<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54577/54577fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique des procédés de purification magnétique et une mesure de TRPS. A) Exemple de purification magnétique de l&#39; échantillon à partir d&#39;un échantillon contenant un excès, l&#39; ADN de sonde de capture non lié. B) TRPS exemple de mesure i) des particules passant par le nanopore et ii) événement Blockade produite à partir de part...

Ici, nous utilisons un nanopore accordable en polyuréthane intégré dans une technique de détection d&#39;impulsions résistif pour caractériser les nanoparticules de la chimie de surface par la mesure des vitesses de translocation de particules, qui peut être utilisé pour déterminer le potentiel zéta des nanoparticules individuelles.

Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules d&#39;ADN modifié comme un exemple

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

L'objectif général de cette procédure est de caractériser la chimie de surface de nanoparticules à l'aide de la détection par résistance ajustable sur plots, ou TRPS (tunable resistive pulse sensing), et de déterminer le potentiel zêta du matériau. Cela est illustré par la caractérisation de nanoparticules modifiées par de l'ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la caractérisation des nanomatériaux et le développement de tests biologiques.Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez effectuer une analyse particule par particule. Chaque signal provenant d'une particule d'ADN est traduit en une mesure de potentiel zêta, fournissant une image complète de l'échantillon analysé. La méthode la plus ancienne pouvait offrir des informations sur la caractérisation des matériaux.Il peut également être appliqué à d'autres domaines, tels que le développement de tests biologiques pour la détection de cellules, de virus, d'ADN et de protéines. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il ne s'agit pas d'une simple injection de l'échantillon suivie d'une attente de la réponse. Une intervention de la part du scientifique est nécessaire.Pour commencer cette procédure, vortexer les particules revêtues de streptavidine pendant 30 secondes avant une sonication de deux minutes à 80 watts afin d'assurer une monodispersion. Diluer les particules revêtues de streptavidine au 1/100 dans du tampon PBST pour obtenir une concentration finale de 1 × 10⁹ particules par millilitre. Ensuite, vortexer les particules pendant 30 secondes.Sur la base d'une capacité de liaison de 4 352 picomoles par milligramme à la concentration appropriée d'ADN par rapport aux particules, pour des concentrations finales de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 et 210 nanomolaires. Après avoir vortexé les échantillons pendant 10 secondes, placez-les sur une roue rotative à température ambiante pendant 30 minutes afin de permettre la liaison de l'ADN aux surfaces des particules par une interaction streptavidine-biotine. Une fois l'ADN capturé ajouté et incubé avec les particules, éliminez l'excès d'ADN et de solution par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur un support magnétique pendant 30 minutes.Ensuite, retirez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber l'amas nouvellement formé de particules, situé le plus près de l'aimant. Remplacez alors le surnageant par le même volume de tampon PBST frais. Ajoutez maintenant la quantité requise d'ADN cible à chaque échantillon afin de garantir une liaison maximale possible de la cible.Vortexez les échantillons pendant 10 secondes. Placez-les ensuite sur la roue rotative à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois l'hybridation terminée, éliminez l'ADN cible en excès par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur le support magnétique pendant 30 minutes.Ensuite, retirez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber l'amas nouvellement formé de particules, situé le plus près de l'aimant. Remplacez ensuite le surnageant par le même volume de tampon PBST frais. Après avoir répété les étapes précédentes pour les échantillons en double, placez les échantillons sur la roue rotative à température ambiante pendant 16 heures afin d'étudier les durées d'hybridation de l'ADN.À ce stade, branchez un instrument TRPS à un système informatique disposant du logiciel approprié. À l’aide d’un pied à coulisse, mesurez la distance entre l’extérieur de deux mâchoires parallèles. Saisissez cette distance dans le champ « stretch » sous l’onglet des paramètres de l’instrument, puis cliquez sur « calibrate stretch » situé sous l’onglet.Ensuite, insérez latéralement une membrane nanopore en polyuréthane de taille appropriée pour l'analyse sur les mâchoires, en orientant le numéro d'identification du nanopore vers le haut. Puis étirez les mâchoires à l'allongement requis pour l'analyse à l'aide de la poignée de réglage de l'étirement située sur le côté de l'appareil. Ajoutez 80 microlitres de tampon PBST dans la cellule inférieure située sous le nanopore, en veillant à ce qu'aucune bulle ne soit présente, car elle pourrait affecter la mesure.Cliquez maintenant pour mettre en place la cellule supérieure de fluide et ajoutez 40 microlitres de tampon, en veillant à ce qu’il n’y ait aucune bulle. Ensuite, placez une cage de Faraday autour du système et appliquez une pression externe comme décrit dans le protocole textuel. Après avoir introduit 40 microlitres des particules d’étalonnage dans la cellule supérieure de fluide, effectuez une mesure TRPS à trois tensions appliquées.Modifiez la tension en cliquant sur les boutons plus et moins de l'échelle de tension dans l'onglet de paramètres de l'appareil du logiciel. Vérifiez que les trois tensions restituent les courants de fond appropriés. Assurez-vous également qu’à la tension moyenne, les particules de calibration produisent une amplitude de blocage moyenne d’au moins 0,3 nanoampère.Une fois les conditions décrites dans le protocole textuel atteintes, lancez l'analyse en cliquant sur « démarrer » dans le logiciel sous l'onglet d'acquisition des données. Pour terminer la mesure, cliquez sur « arrêter » dans l'onglet d'acquisition des données et enregistrez le fichier de données. Nettoyez le système en remplaçant les particules d'étalonnage par 40 microlitres de tampon PBST dans les cellules fluides supérieures, plusieurs fois.Et appliquer différentes pressions jusqu'à ce qu'aucun événement de blocage ne soit plus observé, en s'assurant qu'il n'y ait aucune particule résiduelle ni contamination croisée. Une fois le courant de base approprié obtenu, remplacer l'électrolyte dans la cellule fluide supérieure par 40 microlitres d'échantillon. Démarrer l'analyse de l'échantillon en cliquant sur « Démarrer » dans l'onglet d'acquisition des données.Enregistrez un minimum de 500 particules et assurez-vous que la durée d'acquisition est d'au moins 30 secondes. Pour terminer la mesure, cliquez sur « stop » dans l'onglet d'acquisition des données et enregistrez le fichier de données. Un exemple d'analyse de la taille et du potentiel zêta de particules revêtues de streptavidine sans modification et de particules revêtues de streptavidine saturées par de l'ADN simple brin à la surface est présenté ici.Bien que les deux échantillons aient une taille similaire, le potentiel zêta était nettement différent et beaucoup plus élevé lorsque l'ADN était fixé à la surface des particules. Les données de taille et de potentiel zêta obtenues pour les échantillons ayant les concentrations les plus faibles et les plus élevées d'ADN hybridé sur les particules revêtues de streptavidine sont présentées ici. Une valeur plus élevée de potentiel zêta est enregistrée pour les particules hybridées avec une concentration plus forte d'ADN.La variation du potentiel zêta mesurée pour l'ADN marqué de capture uniquement, une cible d'ADN complémentaire complète, une cible d'ADN à liaison intermédiaire, une cible d'ADN à liaison terminale et une cible d'ADN en surplomb est présentée ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien se rappeler de rincer soigneusement une nanopointe entre chaque étalonnage et échantillon afin d'éviter toute contamination croisée entre les échantillons et de prévenir tout blocage de la nanopointe.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des biocapteurs pour explorer les interactions protéine-protéine et protéine-ADN dans des tests multiplex. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment obtenir le potentiel zêta à l'aide de la TRPS et préparer des particules modifiées par de l'ADN pour des tests biologiques.

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