Mesure de In vitro Activité d'intégration du VIH-1 préintégration Complexes

L’objectif général de cette procédure est de mesurer l’activité d’intégration in vitro de complexes de pré-intégration, ou PIC, isolés à partir de cellules SupT1 infectées par le VIH-1. Cette méthode répondra à certaines des questions clés de la biologie du VIH, en particulier comment certains facteurs de l’hôte et facteurs viraux, par exemple la capside virale, jouent un rôle dans l’intégration de l’ADN du VIH-1, ce qui nous aidera à concevoir ou à identifier de nouvelles cibles pour le traitement antirétroviral. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle nécessite une quantité relativement faible de préparation du complexe de pré-intégration, ou PIC, pour mesurer l’activité d’intégration in vitro.

Les implications de cette technique peuvent s’étendre au diagnostic ainsi qu’au traitement du VIH-1 SIDA, et cela parce que les versions antérieures de cette technique ont joué un rôle crucial dans la découverte des inhibiteurs de l’intégrase du VIH-1, qui sont l’un des principaux médicaments anti-VIH utilisés en clinique aujourd’hui, de sorte que cette méthode peut non seulement être utilisée pour comprendre l’intégration du VIH-1, mais il peut également être appliqué à l’étude d’autres rétrovirus, tels que le VRS et le MLV. La démonstration de ce protocole sera assurée par le Dr Muthukumar Balasubramaniam, boursier postdoctoral au laboratoire. Pour infecter SupT1 par le VIH-1, dans un laboratoire BSL-2, maintenez les cellules SupT1 entre une et deux fois 10 à six cellules par millilitre dans le milieu du Roswell Park Memorial Institute ou du RPMI complété par 10 % de FBS et Pen-Strep.

Après avoir généré des titres élevés de VIH-1 infectieux conformément au protocole textuel, regrouper les cellules SupT1 des flacons de culture, bien mélanger par pipetage et utiliser la coloration d’exclusion au bleu de trypan dans un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules viables. Aliquote huit fois 106 cellules par infection virale dans des tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres, puis centrifuger les cellules dans un rotor à godets oscillant à 500 fois g et 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Sans retirer le milieu de culture cellulaire, transférez les tubes contenant des cellules granulées au laboratoire BSL-3 pour un traitement ultérieur, puis aspirez soigneusement le milieu du tube sans déranger la pastille.

Ensuite, ajoutez 30 millilitres d’inoculum du virus traité à la DNase I dans les cellules et mélangez en pipetant doucement, puis répartissez le mélange uniformément entre deux plaques de culture tissulaire à six puits. Pour la spinoculation, placez les plaques de culture dans des porte-plaques et centrifugez-les dans un rotor à godets oscillants à 480 fois g et 25 degrés Celsius pendant deux heures, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq heures. Pour récolter et lyser les cellules infectées, regroupez les cellules correspondant à chaque infection dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres.

Centrifugez les cellules à 300 fois g et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis aspirez ou pipetez soigneusement le surnageant. Pour éliminer toute particule virale résiduelle, lavez chaque pastille en ajoutant deux millilitres de tampon K moins moins et essorez à nouveau l’échantillon, puis sans déranger la pastille, retirez soigneusement le surnageant par aspiration ou à l’aide d’une pipette avant de répéter le lavage une fois de plus. Après avoir soigneusement retiré tout tampon résiduel à l’aide d’une micropipette, utilisez le tampon de lyse glacé K plus plus pour remettre doucement chaque pastille en suspension et transférez-la dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres.

Pour préparer des complexes de pré-intégration cytoplasmique, ou PIC, secouez l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes, puis placez les tubes dans un rotor pré-refroidi à quatre degrés Celsius et centrifugez à 1 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant quatre minutes. Sans déranger la pastille, transférez soigneusement le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais et faites-le tourner à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute. Transférez soigneusement le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais, puis ajoutez la RNase A à une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre et incubez le contenu à température ambiante sans basculer pendant 30 minutes.

Ajouter du saccharose jusqu’à une concentration finale de 7 % et bien mélanger en pipetant doucement, puis préparer des aliquotes des PIC dans des tubes de microcentrifugation. Congeler rapidement dans de l’azote liquide et placer dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Pour préparer l’ADN cible utilisé dans le test d’intégration in vitro ou IVI, assemblez les mélanges de PCR pour amplifier une région de 2,0 kilobases à partir de l’ADN plasmidique phiX174 à l’aide des amorces personnalisées phiX174-Forward et phiX174-Reverse, et effectuez la PCR à l’aide du programme conformément au protocole texte.

Après la purification et l’aliquotation de l’échantillon, ajoutez 600 nanogrammes d’ADN cible à 200 microlitres de PIC. Bien mélanger et incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Arrêtez la réaction IVI en ajoutant du SDS, de l’EDTA et de la protéinase K, puis mélangez soigneusement le contenu de la réaction et incubez à 56 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, pour purifier l’ADN total de la réaction IVI, ajoutez un volume égal de phénol à l’échantillon déprotéinisé. Mélanger vigoureusement par vortex et centrifuger pendant deux minutes. Retirez soigneusement la phase aqueuse supérieure et transférez-la dans un tube frais avant de répéter l’extraction au phénol, puis ajoutez un volume égal de phénol chloroforme un à un.

Mélangez l’échantillon par vortex et centrifugez le tube pendant deux minutes, puis transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube frais. Après l’extraction au chloroforme selon le protocole textuel, précipitez l’ADN de la phase aqueuse en ajoutant 0,1 microgramme par microlitre de glycogène, 0,3 molaire d’acétate de sodium et 2,5 volumes d’éthanol 100 % glacé. Placez le tube à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, puis retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Pour effectuer une PCR permettant de quantifier l’activité du PIC, il faut commencer par la première série de PCR conventionnelle à l’aide d’amorces ciblant le LTR viral et l’ADN phiX174 afin d’amplifier les jonctions de l’ADN intégré du VIH-1. Assemblez le mélange maître moins l’ADN matrice comme indiqué ici, puis distribuez 45 microlitres d’aliquotes dans des tubes PCR séparés et ajoutez cinq microlitres d’ADN matrice ou d’eau sans nucléase comme contrôle.

Exécutez la réaction dans un thermocycleur à l’aide du programme décrit dans le protocole texte, puis effectuez une deuxième série de PCR quantitative et analysez les données selon le protocole texte. Dans ce test IVI, les SupT1 ont été spinoculés avec le VIH-1 traité par l’ADN I et l’absence ou la présence de l’inhibiteur de l’intégrase du VIH-1, le raltégravir. Après l’incubation, les PIC ont été isolés et l’ADN purifié a été analysé pour l’intégration de l’ADN viral.

Comme le montre le présent document, les PIC du VIH-1 intègrent de manière robuste l’ADN viral associé dans l’ADN cible, et l’efficacité de l’IVI des PIC a été considérablement réduite lors des réactions supplémentées par le raltégravir, ce qui implique fortement l’activité d’intégration mesurée dans ce test avec l’intégrase du VIH-1. Les réactions de contrôle n’ont montré aucune activité d’intégration. De plus, le contrôle qui a exclu la Taq polymérase dans la première série de PCR n’a pas amplifié les produits d’intégration.

Notamment, les données du contrôle des PIC seuls ont indiqué que la stratégie de qPCR imbriquée mesurait spécifiquement l’ADN viral intégré, mais pas l’ADN viral associé au PIC. Collectivement, ces données démontrent l’activité d’intégration associée au PIC. Une fois maîtrisés, la préparation du virus et les tests PCR pour quantifier l’activité PIC peuvent être réalisés en une semaine.

L’infection des cellules SupT1 et l’isolement des PIC des cellules infectées peuvent être effectués en une journée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les PIC du VIH-1 et de mesurer l’activité d’intégration in vitro. N’oubliez pas que travailler avec des titres élevés de VIH-1 infectieux peut être extrêmement dangereux et que des précautions appropriées, y compris des vêtements de protection tels que des tabliers et des blouses, des gants doubles et des lunettes de protection, doivent toujours être prises lors de cette procédure.