Name: Mesure de In vitro Activité dintégration du VIH-1 préintégration Complexes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Apprenez à mesurer l'activité d'intégration des complexes pré-intégration du VIH-1 in vitro à partir de cellules SupT1 infectées. Cette méthode permet d'étudier les facteurs viraux et cellulaires impliqués dans l'intégration.

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Ce travail est en partie financé par des subventions DA024558, DA30896, DA033892 et DA021471 du NIDA / NIH sur CD. Nous reconnaissons également l&#39;octroi G12MD007586 RCMI, le Vanderbilt CSTC accorder UL1RR024975, le Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA subvention U54 de RR026140 du NCRR / NIH, le MD007593 U54 de subvention du NIMHD / NIH, et le Tennessee CFAR subvention P30 AI110527.

1. Production de virus Remarque: pour produire des titres élevés de VIH-1 infectieux, transfecter la lignée de rein embryonnaire humain (HEK), des cellules 293T avec un HIV-1 clone moléculaire infectieux en utilisant un réactif de transfection à base de dendrimères activés. Il a été observé que le procédé au phosphate de calcium de transfection donne des résultats comparables. <ol><li> Dans un niveau de biosécurité 2 (NSB2) laboratoire, graines 3 x 10 6 cellules 293T par boîte de 10 cm dans 8 ml de milieu de Eagle modifié Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de la pénicilline et de la streptomycine. Cultiver les cellules dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2 O / N. </li><li> Le lendemain, pour transfecter des cellules dans chaque boîte de 10 cm, diluer 8 pg d&#39;ADN de plasmide pNL4-3 (voir le tableau des matériaux) jusqu&#39;à un volume final de 300 ul de milieu DMEM dépourvu de sérum et d&#39; antibiotiques. Ajouter 80 ul du réactif de transfection, bien mélanger par pipetage, et incuber à température ambiante pendant5 - 10 min pour la transfection formation du complexe. </li><li> Retirez le support de la vaisselle par aspiration et ajouter 7 ml par boîte de DMEM frais contenant du sérum et des antibiotiques. </li><li> Ajouter 1 ml de DMEM contenant du sérum et des antibiotiques pour le complexe de transfection, mélanger par pipetage, et ajoutez ce mélange sur les cellules. Remuer doucement le plat pour faciliter une distribution uniforme des complexes de transfection. </li><li> Transférer immédiatement les cellules au laboratoire BSL3, place dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2, et de la culture des cellules pendant 48 h. </li><li> Recueillir le surnageant de culture de tissus contenant le virus en utilisant une pipette, puis le transférer dans un tube de centrifugation. Centrifuger à 300 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules et les débris, puis filtrer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,45 um de taille de pore. </li><li> Afin d&#39;éliminer tout ADN plasmidique report dans cette préparation de virus exempt de cellules, on traite avec de la DNase 1 (20 ug / ml) à 37 ° C pendant 1 h. </li><li> Pour quantifier laVIH-1 titre, utilisez le spécifique à p24 immuno-enzymatique (ELISA), car il est une méthode rapide et prête pour une utilisation de routine 22. NOTE: Il faut noter que le test ELISA p24 mesure le titre physique (nombre de particules virales). En variante, la mesure de l&#39;activité associée au virus RT (dosage par RT exogène) ou le virus infectieux (dosages d&#39;infectivité basés sur la lignée cellulaire indicatrice TZM-bl) fournira une lecture exclusive des particules virales infectieuses. </li></ol> 2. Virus Infection des cellules Sup-T1 (BSL3 Lab) <ol><li> Dans un laboratoire de NSB2, maintenir les cellules Sup-T1 entre 1,0 x 10 6 et 2,0 x 10 6 cellules / mL à Roswell Park Institute Memorial (RPMI) de milieu additionné de 10% inactivé par la chaleur FBS, de la pénicilline et de la streptomycine (rapport de division de 1 : 2 tous les 2 - 3 d). Réunir les cellules Sup-T1 à partir des flacons de culture, bien mélanger par pipetage, et de déterminer le nombre de cellules viables en utilisant un hémocytomètre et l&#39;exclusion du bleu trypan stméthode aining. <ol><li> Préparer le nombre requis de parties aliquotes de 80 x 10 6 cellules (par infection virale) dans 50 ml tube conique de centrifugeuse. </li><li> Centrifuger les cellules dans un rotor oscillant seau à 500 g et à 25 ° C pendant 5 min. Sans retirer le milieu de culture cellulaire, transférer les tubes contenant les cellules granulées au laboratoire BSL3 pour un traitement ultérieur. aspirer soigneusement le milieu de culture cellulaire à partir du tube sans perturber le culot cellulaire. </li></ol></li><li> Ajouter une quantité appropriée de DNase I-traité inoculum viral aux cellules dans le tube et bien mélanger par pipetage doux. Pour 80 x 10 6 cellules, utiliser 30 ml de virus DNase I-traité (50 pg de virus p24 équivalent). NOTE: L&#39;isolement des PICs fonctionnels nécessite d&#39;infecter les cellules cibles avec des multiplicités très élevés d&#39;infection (MOI). </li><li> Distribuer uniformément le mélange entre deux plaques de culture de tissus à 6 puits (soit 12 aliquotes x 2,5 mL; utiliser 2 plaques par infection). </li><li> Pour spinoculation, placer les plaques de culture dans des supports de plaque et centrifuger à l&#39;aide d&#39;un seau rotor oscillant à 480 xg et 25 ° C pendant 2 h. </li><li> Incuber les cellules spinoculated à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 5 h. </li></ol> 3. La récolte et la lyse des cellules infectées (BSL3 lab) <ol><li> Réunir les cellules correspondant à chaque infection à partir des plaques de culture dans un tube de 50 ml conique de centrifugeuse (~ 30 ml au total). </li><li> Récolter les cellules par centrifugation à 300 x g et à 25 ° C pendant 10 min. Aspirer délicatement le surnageant du tube (en variante, utiliser une pipette). </li><li> Pour éliminer les particules virales résiduelles, laver chaque culot cellulaire en ajoutant 2 ml de tampon K - / - (mM KCI 150 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM de MgCl2 20) et en centrifugeant l&#39;échantillon à 300 x g et à 25 ° C pendant 10 minutes. Puis, sans perturber le culot, retirez soigneusement le surnageant par aspiration ou à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> REPEAt l&#39;étape 3.3. </li><li> Retirez soigneusement le tampon résiduel en utilisant une micropipette. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 2 ml de tampon de lyse K glacée + / + (Tampon K - / - additionné de 0,025% digitonine, 1 mM de DTT, 20 pg / ml d&#39; aprotinine), mélanger le contenu par pipetage doux, et transférer à un 2 microtube mL. </li></ol> 4. Préparation de PICs cytoplasmiques (BSL3 lab) <ol><li> Rock les échantillons sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Centrifuger les échantillons, le rotor prérefroidi à 4 ° C, à 1500 x g et 4 ° C pendant 4 min. </li><li> Sans perturber le culot, transférer soigneusement le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais et centrifuger à 16 000 xg et 4 ° C pendant 1 min. </li><li> Soigneusement transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais. Ajouter la RNase A (20 mg / ml) jusqu&#39;à une concentration finale de 20 pg / mL (2 pi pour 2 ml de PIC) et on incube le contenu à la température ambiante pendant 30 minutes (sans balancement). &lt;/ Li&gt; <li> Ajouter le saccharose (60% p / v dans un tampon K - / -) à une concentration finale de 7% et bien mélanger par pipetage doux. Préparer des aliquotes (par exemple, 200 pi) des PICs dans des tubes à centrifuger, flash-gel dans de l&#39; azote liquide, et placer dans un -80 ° C congélateur pour le stockage à long terme. </li></ol> 5. In Vitro Intégration (IVI) Assays Utilisation du VIH-1 PICs <ol><li> Préparer l&#39;ADN cible utilisée dans le dosage IVI en amplifiant une région de 2,0 kb provenant de l&#39;ADN de plasmide avec phiX174 PCR utilisant des amorces sur mesure, phiX174-F et phiX174-R. <ol><li> Assembler le mélange de PCR comme décrit dans le Tableau 1. Faire la PCR dans un cycleur thermique en utilisant les conditions de cyclage thermique recommandées dans le tableau 2. Gel purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification sur gel (selon le protocole recommandé par le fabricant) et stocker l&#39;ADN cible purifié sous forme d&#39;aliquotes à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Ajouter 600 ng d&#39;ADN cible à 200 - &amp; #181; L aliquote de PICs, bien mélanger et incuber à 37 ° C pendant 45 min. Remarque: les réactions IVI omettant l&#39; ADN cible ou incluant un inhibiteur de l&#39; intégrase (par exemple, le raltégravir) sont recommandés réactions de contrôle. </li><li> Arrêter la réaction par addition d&#39;IVI SDS, de l&#39;EDTA et de la proteinase K à une concentration finale de 0,5%, 8 mM et 0,5 mg / mL, respectivement. Mélanger le contenu de réaction à fond et incuber une nuit à 56 ° C. </li><li> Le lendemain, la purification de l&#39;ADN total de la réaction IVI par extraction au phénol / chloroforme et précipitation à l&#39;éthanol. Effectuer toutes les étapes de centrifugation à 16.000 xg et RT. </li><li> Ajouter un volume égal de phénol à l&#39;échantillon déprotéiné, mélanger énergiquement par tourbillonnement, et centrifuger pendant 2 min. Retirez délicatement la phase aqueuse supérieure et le transférer dans un nouveau tube. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.5. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter un volume égal de 1: 1 de phénol: un mélange de chloroforme, mélanger énergiquement par tourbillonnement, et centrifuger foR 2 min. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter un volume égal de chloroforme, mélanger énergiquement par tourbillonnement, et centrifuger pendant 2 min. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. </li><li> Pour précipiter l&#39;ADN, ajouter le glycogène à une concentration finale de 0,1 pg / pl, 3 M d&#39;acétate de sodium à une concentration finale de 0,3 M et 2,5 volumes d&#39;éthanol à 100% (glacé). Vortex pour mélanger, centrifuger brièvement pour recueillir le contenu, et placez le tube à -80 ° CO / N. </li><li> Le lendemain, centrifuger l&#39;échantillon pendant 30 min à 16 000 x g et 4 ° C pendant 30 min. Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol à 80% (glacé) à la pastille et centrifuger à 16 000 x g et 4 ° C pendant 10 min. Sécher à l&#39;air la pastille d&#39;ADN à température ambiante et remise en suspension à fond dans 50 ul d&#39;eau exempte de nuclease. Conserver les échantillons d&#39;ADN à -20 ° C. </li></ol> 6. Les dosages PCR pour Quantifier PIC Activité <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Remarque: le nombre de copies de l&#39;ADN du VIH-1 intégré dans l&#39;ADN cible est quantifié par une stratégie de PCR imbriquée qui emploie 2 ensembles d&#39;amorces et de 2 cycles séquentiels de PCR. <ol><li> Effectuer la première ronde PCR conventionnelle en utilisant des amorces ciblant le LTR viral et l&#39;ADN phiX174 (LTR et PhiX174 amorces, respectivement) pour amplifier les jonctions du VIH-1 ADN intégré. <ol><li> Assembler le mélange PCR premier tour comme décrit dans le tableau 3. Assembler un mélange maître de tous les composants à l&#39;exclusion de l&#39;ADN modèle, distribuer des aliquotes de 45 pi dans des tubes de PCR séparés, et ajouter 5 ul d&#39;ADN matrice ou de l&#39;eau sans nucléase (contrôle). </li><li> Faire la PCR dans un cycleur thermique en utilisant les conditions de cyclage thermique recommandées dans le tableau 4. </li></ol></li><li> Effectuer la deuxième ronde qPCR utilisant des amorces qui flanquent une courte région du LTR viral (LTR-R et LTR-U amorces) pour amplifier sélectivement les séquences vDNA intégrées de la première-round produits de PCR. Pour déterminer les nombres de copies intégrées vDNA, générer une courbe standard en utilisant des dilutions en série de 10 x nombres de copies connus (par exemple, 10 0 - 10 8) du clone moléculaire de VIH-1. <ol><li> Assembler le qPCR mélange deuxième ronde comme décrit dans le tableau 5. Assembler un mélange maître de tous les composants à l&#39;exclusion de l&#39;ADN modèle, soigneusement distribuer 25 aliquotes uL dans le nombre approprié de puits dans un 96 puits PCR plaque de réaction, puis ajouter 5 ul de la non purifiée au premier tour des produits de PCR ou de l&#39;eau sans nucléase (contrôle). Effectuer toutes les réactions qPCR en triple. </li><li> Chargez la plaque PCR dans l&#39;instrument de PCR en temps réel et effectuer des qPCR en utilisant les conditions de cyclisme recommandées dans le tableau 6. </li><li> Analyser les données en utilisant un logiciel approprié. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financiers et non financiers concurrents.

Les analyses biochimiques de PICs rétrovirales ont fourni des informations critiques dans le mécanisme de l&#39;intégration de l&#39;ADN rétroviral. La mesure de l&#39;activité d&#39;intégration des PIC rétroviraux peut être obtenue par un essai de formation de plaque, l&#39;analyse par transfert de Southern et emboîtée qPCR. La stratégie expérimentale de l&#39; essai sur plaque est laborieuse et utilise une méthode indirecte pour mesurer l&#39; intégration 6, 7,...

HIV-1 replication dans la cellule cible implique plusieurs étapes, de façon générale regroupées en deux phases: les événements précoces et tardifs. Les événements précoces commencent lorsque le VIH-1 de façon séquentielle se lie au récepteur de surface des cellules cibles CD4 et l&#39; un des deux co-récepteurs (CCR5 ou CXCR4) 1. Par conséquent, la membrane fusible virus des cellules, et la capside virale (CA) de base est libérée dans le cytoplasme 2. Le noyau CA contient l&#39;ARN viral génomique simple brin (ssRNA) et plusieurs protéines, à la fois virale et cellulaire à l&#39;origine. Les protéines virales associées CA comprennent la transcriptase inverse (RT) et intégrase (IN), deux enzymes qui interviennent dans les étapes critiques pendant les événements précoces de la réplication virale. La RT et IN fonction dans le contexte des complexes de nucléoprotéine, à savoir la transcription inverse complexe (RTC) et le complexe de pré-intégration (PIC), respectivement 3, 4, 5 &lt;sup&gt;, 6. Les extrémités du génome viral de ssRNA terminal portuaire répétition (R) des éléments adjacents aux séquences U5 uniques (à l&#39;extrémité 5 &#39;) et U3 (à l&#39;extrémité 3&#39;). Le RTC convertit le ssRNA génome viral dans un (ds) copie d&#39;ADN double brin (vDNA). Ce processus de transcription inverse se traduit également par une duplication des séquences U3 et U5, générant ainsi des longues répétitions terminales (LTR) aux deux extrémités de la vDNA 7, 8. Par la suite, IN PIC associé catalyse deux réactions biochimiques successives qui permettent l&#39;intégration du vDNA dans le chromosome hôte 9, 10, 11. Tout d&#39; abord, dans le cytoplasme, IN multimères s&#39;engager les deux LTR et 12 cliver un dinucléotide à partir de chacune des extrémités 3 &#39;terminales. Ce traitement génère l&#39; extrémité 3 &#39; d&#39; un groupe hydroxyle à chaque extrémité 3&#39; (OH CA) de la vDNA.Ensuite, PIC trafique vers le noyau, dans lequel IN utilise le vDNA CA OH comme nucléophile pour couper les deux brins de l&#39;ADN chromosomique en quinconce. Simultanément, se dissocie de façon coordonnée les deux extrémités du vDNA aux liaisons phosphodiester résultant sur des brins opposés de l&#39;ADN chromosomique. Après cette étape de transfert de brin, la machinerie de la cellule hôte supprime les deux nucléotides non appariés aux extrémités 5 &#39;de la vDNA et répare les lacunes simple brin qui en découlent à la jonction du site d&#39;intégration. Les événements précoces aboutissent donc à la création d&#39;une copie d&#39;ADN intégré (provirus) du génome du VIH-1. Provirus fournit un environnement approprié pour l&#39;expression des gènes viraux efficaces, ce qui déclenche des événements ultérieurs, y compris l&#39;expression des protéines codées par le virus; assemblage du virus immature; et le bourgeonnement, la libération et la maturation dans des virions infectieux 13. Purifié rétroviral IN recombinant est compétent pourréaliser, in vitro, les deux traitement et de transfert de brin activités 3&#39;-terminales sur exogène ADN substrat LTR-like. Des études biochimiques utilisant de tels recombinant purifié IN ont révélé des aspects critiques de l&#39; intégration vDNA 14, 15, 16, 17. Cependant, contrairement à une infection naturelle, cette réaction biochimique in vitro ne supporte pas l&#39; intégration concertée des deux extrémités de l&#39;ADN de substrat dans l&#39;ADN cible. En revanche, les PIP rétrovirales isolées à partir de cellules infectées de façon aiguë intégration concertée des deux extrémités du vDNA endogène dans un ADN cible hétérologue. Cela a conduit à l&#39;adoption généralisée et des améliorations ultérieures de Vitro Intégration (IVI) essais I n en utilisant PICs indigènes isolés. Dans le premier essai rapporté IVI rétroviraux, des extraits cytoplasmiques provenant de cellules infectées par un recombinant murineVirus de la Leucémie (MLV) hébergeant le gène de E. coli SupF dans sa LTR a servi comme source d&#39;activité IN et l&#39;ADN d&#39;un mutant de phage lambda défectueux dans la croissance lytique a été fourni de manière exogène comme l&#39;ADN cible. l&#39;intégration réussie de l&#39;ADN recombinant MLV la copie dans l&#39;ADN du phage et l&#39;expression qui suit SupF conduit à la restauration de la capacité des phages recombinants de formation de plaques. Cependant, cette stratégie expérimentale est laborieuse et l&#39;intégration de mesures d&#39;une manière indirecte. Pour faire face à ces mises en garde, un test de fin marquage indirect basé blot-Sud, qui quantifie l&#39;activité IVI PIC associée en tant que mesure de la vDNA endogène intégré dans bactériophage linéarisé exogène phiX174 ADN, a été mis au point 6, 7, 18. Bien que cette méthode fournit une mesure directe des événements d&#39;intégration, des quantités relativement élevées de la préparation des PIC sont nécessaires, ce qui reste un défi techniqueeffort. Pour contourner cela, des tests basés sur la PCR imbriquées ne nécessitant que des quantités modestes de PICs ont été développés 4, 5, 19. Dans ce rapport, nous décrivons une version mise à jour d&#39;une PCR nichée à base in vitro conçu pour récapituler l&#39;activité d&#39;intégration du VIH-1 PIC médiée survenant au cours de l&#39; infection naturelle. Cette méthode utilise les extraits cytoplasmiques des cellules cibles du VIH-1 infectées en tant que source d&#39;activité PIC endogène, qui est mesurée à l&#39;aide d&#39;une polymérase en temps réel quantitative Chain Reaction (PCR quantitative). Les procédures d&#39;isolement PICs et mesurer leurs activités d&#39;intégration sont adaptées, avec des modifications, des protocoles publiés par le laboratoire Engelman 20. Dans ce procédé, l&#39;activité d&#39;intégration PIC associée est déclenchée en fournissant un ADN cible exogène linéaire 21, et les produits d&#39;ADN résultant decette réaction d&#39;intégration sont purifiés et utilisés comme matière de départ pour la quantification par PCR ultérieure. Dans le premier tour de PCR classique, les jonctions d&#39;ADN viral cible sont amplifiés en utilisant des amorces appropriées. Dans le second tour qPCR, amorces LTR-spécifiques sont utilisés pour enrichir spécifiquement la population vDNA des produits de première ronde de PCR. S&#39;il vous plaît voir la section de protocole pour une description détaillée de cette méthode. Des études in vitro avec PICs rétroviraux ont permis des avancées significatives dans notre compréhension du mécanisme d&#39;intégration de l&#39; ADN rétroviral et dans le développement d&#39;inhibiteurs IN. Sur la base de la récente focalisation accrue sur la cartographie du VIH-1 des sites d&#39;intégration, déterminer le rôle des facteurs viraux et d&#39;accueil du VIH-1 l&#39;intégration et le développement de nouveaux médicaments antiviraux dans la lutte contre la résistance aux médicaments, nous envisageons un intérêt accru et l&#39;utilisation généralisée des IVI essais , comme celle décrite dans le présent rapport. Ceci, à son tour, conduira àaméliorations futures dans la méthode, diversifiant ainsi la portée de ses applications.

<table><tbody><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco' Eagle modifié' s milieu (DMEM) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Saline tamponnée au phosphate (PBS) (1x)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (0,25 %) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 25200-056 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Pénicilline-Streptomycine solution (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI </td> HEK293T cellules (293T)<td></td></tr><tr><td> </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-3216 </td><td></td></tr><tr><td> HIV-1 Clone moléculaire proviral pNL4-3 </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Program </td><td> 114 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif de transfection PolyFect </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 </td><td> Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Sup-T1 cellules</td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,2 - 7,5 (solution prête à l’emploi)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> solution de chlorure de potassium (KCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60142 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium (MgCl2) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> dithiothréitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinine </td><td> Sigma-Ald<rich /p> </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> Digitonine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 < </td><td></td></tr><tr><td> p>phiX174 Forme réplicative 1 ADN </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX174-F amorce : 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R amorce : 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen et/ou IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq DNA polymérase </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick kit d’extraction de gel </td><td> Qiagen < </td><td> p>28706 </td> <td></td></tr><tr><td>Eau distillée ultrapure </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) tampon (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> Acide éthylènediamine tétraacétique, solution de sel disodique (EDTA), 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td><td></td></tr><tr><td>protéinase K (solution prête à l’emploi 20 mg/mL)</td><td> Qiagen </td><td> 19131 </td><td></td></tr><tr><td> phénol (équilibré avec 10&nbsp ; mM Tris HCl, pH&nbsp ; 8,0 et 1 mM EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroforme </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 288306 </td><td></td></tr><tr><td>Glycogène (solution 5 mg/mL)</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium (3 M, pH 5,2)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td> éthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>Premier tour LTR primer : 5'-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3' Premier tour phiX174 amorce : 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen et/ou IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>Second tour LTR-R primer : 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Amorce LTR-U du deuxième tour : 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' Enquête Taqman du deuxième tour : &nbsp ; 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAACAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' </td><td> Invitrogen et/ou IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de in vitro activité d'intégration du vih-1 préintégration complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

les protéines d&#39;enveloppe du VIH-1 engagent récepteurs correspondants sur la surface de la cellule cible, ce qui conduit à la cellule d&#39;origine virale fusion membranaire, suivie par la libération du noyau capside (CA) dans le cytoplasme. Par la suite, le virus de la transcriptase inverse (RT), dans le cadre d&#39;un complexe du même nom nucléoprotéine appelée Reverse Transcription Complex (RTC), convertit le génome d&#39;ARN simple brin viral dans une copie d&#39;ADN double brin (vDNA). Cela conduit à la biogenèse d&#39;un autre complexe de nucléoprotéine, appelé le complexe de pré-intégration (PIC), composée de la vDNA et des protéines virales associées et les facteurs de l&#39;hôte. L&#39;intégrase virale PIC-associé (IN) orchestrant l&#39;intégration du vDNA dans l&#39;ADN chromosomique de l&#39;hôte dans un processus en deux étapes régulé temporellement et spatialement. D&#39;abord, le processus IN extrémités 3 &#39;du vDNA dans le cytoplasme et, en second lieu, après que le PIC trafique vers le noyau, il médie l&#39;intégration du vDNA transformé dans l&#39;ADN chromosomique. Les PICs isolésà partir de cellules cibles infectées de façon aiguë par le VIH-1 sont fonctionnelles in vitro, car ils sont compétents pour intégrer la vDNA associée à un ADN cible hétérologue ajouté de manière exogène. Dans des tests d&#39;intégration in vitro telle base PIC ont considérablement contribué à délimiter les détails mécanistiques de l&#39; intégration rétrovirale et à la découverte de inhibiteurs de l&#39; IN. Dans ce rapport, nous élaborons sur un VIH-1 PIC test mis à jour qui utilise un imbriquée en temps réel Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR) stratégie à base de mesure de l&#39;activité d&#39;intégration in vitro de PICs indigènes isolés.

Isolement du VIH-1 PICs Un schéma du protocole utilisé pour l'isolement du HIV-1 provenant de cellules PIP Sup-T1 infection aiguë est représenté sur la figure 1. Ce protocole est dérivé des méthodes décrites par Engelman et al. 19, 20. VIH-1 PICs sont complexes nucléoprotéine qui sont assemblés dans des cellules infectées et s...

Ce rapport décrit un test in vitro pour mesurer l’activité d’intégration associée au complexe de préintégration (PIC) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) dans les extraits cytoplasmiques de cellules gravement infectées. L’intégration de l’ADN du VIH-1 associé au PIC dans l’ADN cible hétérologue est quantifiée à l’aide d’une stratégie de réaction en chaîne par polymérase en temps réel emboîtée.

Mesure de In vitro Activité d'intégration du VIH-1 préintégration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

L’objectif général de cette procédure est de mesurer l’activité d’intégration in vitro de complexes de pré-intégration, ou PIC, isolés à partir de cellules SupT1 infectées par le VIH-1. Cette méthode répondra à certaines des questions clés de la biologie du VIH, en particulier comment certains facteurs de l’hôte et facteurs viraux, par exemple la capside virale, jouent un rôle dans l’intégration de l’ADN du VIH-1, ce qui nous aidera à concevoir ou à identifier de nouvelles cibles pour le traitement antirétroviral. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle nécessite une quantité relativement faible de préparation du complexe de pré-intégration, ou PIC, pour mesurer l’activité d’intégration in vitro.Les implications de cette technique peuvent s’étendre au diagnostic ainsi qu’au traitement du VIH-1 SIDA, et cela parce que les versions antérieures de cette technique ont joué un rôle crucial dans la découverte des inhibiteurs de l’intégrase du VIH-1, qui sont l’un des principaux médicaments anti-VIH utilisés en clinique aujourd’hui, de sorte que cette méthode peut non seulement être utilisée pour comprendre l’intégration du VIH-1, mais il peut également être appliqué à l’étude d’autres rétrovirus, tels que le VRS et le MLV. La démonstration de ce protocole sera assurée par le Dr Muthukumar Balasubramaniam, boursier postdoctoral au laboratoire. Pour infecter SupT1 par le VIH-1, dans un laboratoire BSL-2, maintenez les cellules SupT1 entre une et deux fois 10 à six cellules par millilitre dans le milieu du Roswell Park Memorial Institute ou du RPMI complété par 10 % de FBS et Pen-Strep.Après avoir généré des titres élevés de VIH-1 infectieux conformément au protocole textuel, regrouper les cellules SupT1 des flacons de culture, bien mélanger par pipetage et utiliser la coloration d’exclusion au bleu de trypan dans un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules viables. Aliquote huit fois 106 cellules par infection virale dans des tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres, puis centrifuger les cellules dans un rotor à godets oscillant à 500 fois g et 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Sans retirer le milieu de culture cellulaire, transférez les tubes contenant des cellules granulées au laboratoire BSL-3 pour un traitement ultérieur, puis aspirez soigneusement le milieu du tube sans déranger la pastille.Ensuite, ajoutez 30 millilitres d’inoculum du virus traité à la DNase I dans les cellules et mélangez en pipetant doucement, puis répartissez le mélange uniformément entre deux plaques de culture tissulaire à six puits. Pour la spinoculation, placez les plaques de culture dans des porte-plaques et centrifugez-les dans un rotor à godets oscillants à 480 fois g et 25 degrés Celsius pendant deux heures, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq heures. Pour récolter et lyser les cellules infectées, regroupez les cellules correspondant à chaque infection dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres.Centrifugez les cellules à 300 fois g et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis aspirez ou pipetez soigneusement le surnageant. Pour éliminer toute particule virale résiduelle, lavez chaque pastille en ajoutant deux millilitres de tampon K moins moins et essorez à nouveau l’échantillon, puis sans déranger la pastille, retirez soigneusement le surnageant par aspiration ou à l’aide d’une pipette avant de répéter le lavage une fois de plus. Après avoir soigneusement retiré tout tampon résiduel à l’aide d’une micropipette, utilisez le tampon de lyse glacé K plus plus pour remettre doucement chaque pastille en suspension et transférez-la dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres.Pour préparer des complexes de pré-intégration cytoplasmique, ou PIC, secouez l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes, puis placez les tubes dans un rotor pré-refroidi à quatre degrés Celsius et centrifugez à 1 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant quatre minutes. Sans déranger la pastille, transférez soigneusement le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais et faites-le tourner à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute. Transférez soigneusement le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais, puis ajoutez la RNase A à une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre et incubez le contenu à température ambiante sans basculer pendant 30 minutes.Ajouter du saccharose jusqu’à une concentration finale de 7 % et bien mélanger en pipetant doucement, puis préparer des aliquotes des PIC dans des tubes de microcentrifugation. Congeler rapidement dans de l’azote liquide et placer dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Pour préparer l’ADN cible utilisé dans le test d’intégration in vitro ou IVI, assemblez les mélanges de PCR pour amplifier une région de 2,0 kilobases à partir de l’ADN plasmidique phiX174 à l’aide des amorces personnalisées phiX174-Forward et phiX174-Reverse, et effectuez la PCR à l’aide du programme conformément au protocole texte.Après la purification et l’aliquotation de l’échantillon, ajoutez 600 nanogrammes d’ADN cible à 200 microlitres de PIC. Bien mélanger et incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Arrêtez la réaction IVI en ajoutant du SDS, de l’EDTA et de la protéinase K, puis mélangez soigneusement le contenu de la réaction et incubez à 56 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, pour purifier l’ADN total de la réaction IVI, ajoutez un volume égal de phénol à l’échantillon déprotéinisé. Mélanger vigoureusement par vortex et centrifuger pendant deux minutes. Retirez soigneusement la phase aqueuse supérieure et transférez-la dans un tube frais avant de répéter l’extraction au phénol, puis ajoutez un volume égal de phénol chloroforme un à un.Mélangez l’échantillon par vortex et centrifugez le tube pendant deux minutes, puis transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube frais. Après l’extraction au chloroforme selon le protocole textuel, précipitez l’ADN de la phase aqueuse en ajoutant 0,1 microgramme par microlitre de glycogène, 0,3 molaire d’acétate de sodium et 2,5 volumes d’éthanol 100 % glacé. Placez le tube à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, puis retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Pour effectuer une PCR permettant de quantifier l’activité du PIC, il faut commencer par la première série de PCR conventionnelle à l’aide d’amorces ciblant le LTR viral et l’ADN phiX174 afin d’amplifier les jonctions de l’ADN intégré du VIH-1. Assemblez le mélange maître moins l’ADN matrice comme indiqué ici, puis distribuez 45 microlitres d’aliquotes dans des tubes PCR séparés et ajoutez cinq microlitres d’ADN matrice ou d’eau sans nucléase comme contrôle.Exécutez la réaction dans un thermocycleur à l’aide du programme décrit dans le protocole texte, puis effectuez une deuxième série de PCR quantitative et analysez les données selon le protocole texte. Dans ce test IVI, les SupT1 ont été spinoculés avec le VIH-1 traité par l’ADN I et l’absence ou la présence de l’inhibiteur de l’intégrase du VIH-1, le raltégravir. Après l’incubation, les PIC ont été isolés et l’ADN purifié a été analysé pour l’intégration de l’ADN viral.Comme le montre le présent document, les PIC du VIH-1 intègrent de manière robuste l’ADN viral associé dans l’ADN cible, et l’efficacité de l’IVI des PIC a été considérablement réduite lors des réactions supplémentées par le raltégravir, ce qui implique fortement l’activité d’intégration mesurée dans ce test avec l’intégrase du VIH-1. Les réactions de contrôle n’ont montré aucune activité d’intégration. De plus, le contrôle qui a exclu la Taq polymérase dans la première série de PCR n’a pas amplifié les produits d’intégration.Notamment, les données du contrôle des PIC seuls ont indiqué que la stratégie de qPCR imbriquée mesurait spécifiquement l’ADN viral intégré, mais pas l’ADN viral associé au PIC. Collectivement, ces données démontrent l’activité d’intégration associée au PIC. Une fois maîtrisés, la préparation du virus et les tests PCR pour quantifier l’activité PIC peuvent être réalisés en une semaine.L’infection des cellules SupT1 et l’isolement des PIC des cellules infectées peuvent être effectués en une journée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les PIC du VIH-1 et de mesurer l’activité d’intégration in vitro. N’oubliez pas que travailler avec des titres élevés de VIH-1 infectieux peut être extrêmement dangereux et que des précautions appropriées, y compris des vêtements de protection tels que des tabliers et des blouses, des gants doubles et des lunettes de protection, doivent toujours être prises lors de cette procédure.

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