Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage d'une bibliothèque de fragments d'anticorps

L’objectif global de cette procédure est d’exploiter le contrôle de la qualité du repliement de la voie de translocation de l’arginine jumelle pour concevoir la liaison de fragments d’anticorps et le repliement intracellulaire en une seule étape, ce qui aura des applications dans l’ingénierie des anticorps pour qu’ils fonctionnent intracellulairement. Cette méthode peut aider à surmonter les principaux défis dans le domaine de l’ingénierie des anticorps, tels que la difficulté de surmonter la difficulté de manipuler les anticorps pour qu’ils se replient et fonctionnent correctement dans l’environnement cytoplasmique réducteur. Seuls les anticorps qui se replient bien dans le cytoplasme sont affichés et testés pour la liaison.

Fournir un avantage par rapport à la levure et à l’affichage des phages qui dépendent des voies sécrétoires pour l’affichage. Les implications de cette technique s’étendent à notre traitement des maladies neurodégénératives, du cancer et des infections virales, car ces maladies impliquent une pathogenèse intracellulaire qui pourrait être ciblée par des anticorps. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il est difficile de comprendre comment générer et travailler avec des sphéroplastes.

Après avoir fusionné la bibliothèque scFv à la séquence de signaux ssTorA et l’avoir fait croître à 37 degrés Celsius en secouant pendant trois heures, laissez l’expression de la bibliothèque scFv à 20 degrés Celsius et 225 tr/min pendant une nuit pendant 15 à 22 heures. Après l’incubation, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres. Ensuite, centrifugez le volume calculé de culture induite dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre à 12 000 fois g et à température ambiante pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant et utilisez 100 microlitres de tampon de fractionnement glacé ou fB pour remettre les granulés en suspension. Ensuite, centrifugez les échantillons à 12 000 fois g et à température ambiante pendant une minute. Après avoir retiré le surnageant, utilisez 350 microlitres de fB glacé complétés par 3,5 microlitres de lysozyme de 10 milligrammes par millilitre pour remettre les granulés en suspension.

Ensuite, tout en faisant lentement tourbillonner les tubes, ajoutez goutte à goutte 700 microlitres d’EDTA de 1 millimolaire, puis incubez les tubes sur un rotateur de tube à température ambiante pendant 20 minutes pour mélanger les échantillons. Retirez les tubes du rotateur. Ajoutez 50 microlitres de MgCl2 point cinq molaires glacés dans chaque tube et incubez-les sur de la glace pendant 10 minutes.

Ensuite, centrifugez les échantillons à 11 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Maintenant, à l’aide d’une micropipette et d’un embout d’un millilitre, tirez lentement une partie de la pastille. Ensuite, tout en tenant le tube, à un angle avec l’ouverture directement au-dessus d’un nouveau tube de 1,5 millilitre, soulevez lentement la pointe de la pipette hors du surnageant et faites glisser la pastille dans le nouveau tube.

Après avoir éliminé l’excès de surnageant, utilisez un millilitre de PBS glacé pour remettre les sphéroplastes en suspension. Les sphéroplastes doivent être complètement remis en suspension avant l’orpaillage, car les scFv non liants présents dans les agrégats entraîneront des faux positifs lors de l’orpaillage. Après avoir biotinylé l’antigène cible conformément au protocole de texte, remettre en suspension les billes magnétiques enrobées de streptavidine dans leur flacon d’origine.

Transférez ensuite sept à 10 fois 10 à la 9ème perles dans un tube de 1,5 millilitre. Placez le tube de perles sur le support magnétique pendant deux minutes pour recueillir les perles sur le côté du tube et pipetez pour retirer soigneusement le surnageant. Retirez le tube de l’aimant et utilisez PBS pour remettre les billes en suspension sans générer de bulles.

Remettez ensuite le tube dans l’aimant et retirez le tampon avant de laver les billes deux fois de plus avec du PBS. Ajoutez un millilitre de lysat contenant l’antigène biotinylé aux billes et incubez à température ambiante pendant 30 minutes tout en tournant doucement. Après l’incubation, utilisez du PBS avec 1 % de BSA pour laver les billes cinq fois.

Utilisez ensuite du PBS avec 1 % de BSA pour remettre les billes en suspension. Pour cribler la bibliothèque scFv, commencez par ajouter quatre fois 10 au 9e sphéroplaste et huit fois 10 au 8e bille à un tube stérile de 15 millilitres. Ajoutez un x PBS avec 1 % BSA pour porter le volume total à quatre millilitres.

Ensuite, aliquote la solution dans quatre tubes de 1,5 millilitre d’un millilitre chacun et incubez les réactions à quatre degrés Celsius en tournant doucement pendant cinq heures. Pour préparer les sphéroplastes liés par des billes pour la PCR, placez les tubes de réaction de panoramique sur l’aimant pendant trois minutes. Retirez le surnageant et lavez les billes avec un x PBS avec 1 % BSA quatre fois comme auparavant.

Utilisez ensuite 25 microlitres de ddH20 par tube pour remettre les billes en suspension. Comme décrit dans le protocole textuel, effectuez une PCR du plasmide entier pour amplifier les gènes des scFv liés aux billes, puis recircularisez le plasmide à partir du produit PCR. Transformez l’ensemble de la réaction en cellules égalisées MC4100 selon le protocole texte.

Pour identifier les clones à l’aide d’ELISA, décongelez un tube de la sous-bibliothèque panoramique et une plaque sur des plaques de gélose LB. Ajoutez 200 microlitres de LB avec 20 microgrammes par millilitre de chloramphénicol dans chaque puits d’une plaque de culture à fond rond de 96 puits. À l’aide d’une pointe de pipette, prélevez une colonie individuelle dans la plaque de gélose.

Placez ensuite l’embout dans le premier puits de la plaque à 96 puits et remuez doucement pour inoculer. Continuez à inoculer une colonie dans chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures sur un agitateur de microplaques.

Après avoir préparé une solution de revêtement d’antigène cible conformément au protocole de texte, ajoutez 50 microlitres de la solution dans chaque puits d’une plaque ELISA en polystyrène transparent à haute liaison de 96 puits. Incuber les plaques à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, répliquez les colonies des plaques de culture à 96 puits sur des plaques de gélose selon le protocole de texte.

Ensuite, videz la solution d’enrobage des plaques ELISA et ajoutez 100 microlitres de solution de blocage préparée selon le protocole textuel dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant au moins deux heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ajoutez 20 microlitres d’un détergent concentré de lyse cellulaire dans chaque puits de la plaque de culture à fond rond et incubez la plaque de culture sur un agitateur de microplaques à température ambiante pendant 15 à 20 minutes.

Videz la solution de blocage des plaques ELISA et lavez les puits quatre fois avec 200 microlitres de tampon de lavage préparé selon le protocole de texte. Après avoir retiré le lavage final, transférez 50 microlitres de chaque puits de la plaque de lyse cellulaire vers le puits correspondant de la plaque ELISA. Incuber les plaques à température ambiante pendant une à deux heures.

Procédez à la vidange des échantillons de la plaque ELISA et lavez les puits quatre fois. Ensuite, préparez la solution d’anticorps pour détecter les scFvs selon le protocole textuel. Ajoutez 50 microlitres d’anticorps dans chaque puits et incubez pendant une à deux heures à température ambiante.

Lavez les plaques ELISA quatre fois avec un tampon de lavage avant d’ajouter 200 microlitres par puits de substrat HRP préparé selon le protocole du fabricant. Incuber les assiettes à l’obscurité à température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Pour éteindre la réaction, ajoutez 50 microlitres de trois molaires de H2SO4 dans chaque puits et pipetez doucement pour mélanger la solution.

Enfin, mesurez l’absorbance à l’aide d’une lecture de plaque à 492 nanomètres. Dans cette expérience, les anticorps scFv scFv13 et scFv13. R4 ont été fusionnés soit à la séquence native ssTorA, soit à un ssTorA modifié qui n’est pas reconnu par la voie de translocation jumelle-arginine, également appelée voie Tat.ScFv.

R4 se plie bien et s’exprime sur la membrane interne lorsqu’il est infusé à ssTorA natif. ScFv13 ne se plie pas bien et n’est pas affiché sur la membrane interne, quel que soit le peptide de signal Tat auquel il est fusionné. Ces résultats démontrent que seules les protéines qui contiennent le peptide signal Tat et qui sont correctement repliées dans le cytoplasme sont affichées sur la membrane interne, permettant à la voie Tat de fonctionner comme un écran pour le repliement intracellulaire.

Dans cette expérience, une banque de PCR sujette aux erreurs basée sur scFv13, qui a un faible niveau d’affinité de liaison pour la bêta-galactosidase, a été comparée à la bêta-gal. ScFv 1-4 a été isolé et a montré une affinité de liaison plus élevée au bêta-gal que scFv13 ainsi qu’un niveau plus élevé de solubilité cytoplasmique. En utilisant scFv 1-4 comme concurrent de la banque scFv 1-4 de deuxième génération, scFv 2-1 et 2-3 ont été isolés et ont démontré des affinités de liaison encore plus élevées pour le bêta-gal que scFv13 1-4, mettant en évidence l’ingénierie simultanée de la solubilité et de la liaison de l’antigène.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme celle d’ELISA utilisant du lysat purifié peuvent être effectuées afin de vérifier la spécificité de l’antigène et de déterminer l’affinité de liaison des clones isolés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment cribler un anticorps pour qu’il fonctionne pour se lier à un antigène d’intérêt en utilisant la voie Tat pour afficher cette bibliothèque et le panoramique des billes magnétiques pour enrichir et isoler les liants d’antigènes. N’oubliez pas que travailler avec de l’acide sulfurique peut être extrêmement dangereux et que le port d’un équipement de protection individuelle approprié est nécessaire.