Name: Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage dune bibliothèque de fragments danticorps (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Découvrez l'affichage intracellulaire d'anticorps utilisant la voie de translocation twin-arginine d'Escherichia coli pour cribler simultanément l'affinité de liaison et la solubilité des fragments d'anticorps.

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Nous remercions Tomer Zohar pour son travail sur les tests de criblage et de caractérisation du scFv. Une partie de ce travail a été financée par le numéro de bourse F32CA150622 de l’Institut national du cancer (à l’AJK). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national du cancer ou des Instituts nationaux de la santé.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ingénierie des anticorps pour l&#39; activité cytoplasmique est une tâche difficile en raison du milieu réducteur du cytoplasme, ce qui empêche la formation de liaisons disulfure stabilisant à 6,7. Cela provoque la plupart des anticorps pour être inactif dans le cytoplasme, sauf si elles sont conçues pour assurer la stabilité et la solubilité dans le cytoplasme, en plus d&#39;être conçu pour une affinité de liaison. Les méthodes de phage display, affichage de la surface bactérienne, et les méthodes d&#39;affichage de surface de levure existantes tout utiliser la voie sécrétoire 14-16 pour l&#39;affichage des anticorps génétiquement modifiés , mais ces méthodes ont aucun moyen de pliage ingénieur intracellulaire. Anticorps modifiés génétiquement en utilisant l&#39;affichage membrane interne ont permis d&#39;améliorer la stabilité et la solubilité dans cytoplasmique parce que le contrôle de la qualité du repliement de la voie Tat empêche la translocation des anticorps qui sont mal repliées et instables dans le cytoplasme. Cette méthode simplifie le processus itératif d&#39;anticorps intracellulaires d&#39;ingénierie pour l&#39;affinité d&#39;unnd solubilité, comme les deux propriétés sont conçues en une seule étape. Bien que ce procédé a été conçu pour l&#39;ingénierie des anticorps ayant une solubilité dans l&#39;environnement intracellulaire réducteur, il pourrait également être appliquée à des anticorps d&#39;ingénierie pour fonctionner dans des conditions non réductrices, étant donné que les protéines conçues en utilisant cette méthode conservent leur pliage dans l&#39;environnement oxydant du périplasme. Bien que cette technique simplifie le processus d&#39;ingénierie des anticorps avec une affinité élevée et une haute solubilité cytoplasmique, plusieurs limitations sont importants à considérer lors de l&#39;utilisation de ce protocole. Lors de l&#39;analyse des signaux ELISA écran secondaire pour identifier des variants prometteurs scFv, le seuil pour discerner entre les variantes potentiellement intéressantes et celles qui ne peuvent pas exposer adéquate liaison à l&#39;antigène ne sont pas susceptibles d&#39;être apparent qu&#39;après plusieurs clones ont été caractérisés davantage. Il est important de rechercher une liaison améliorée sur l&#39;anticorps parent; cependant,un signal anormalement élevé pourrait être le signe de l&#39; avidité 29 ou des effets d&#39;agrégation 30, un défi qui est pas unique à l&#39;approche de criblage d&#39;affichage membrane interne. Une limitation clé à retenir lors de l&#39;utilisation de ce protocole est l&#39;incapacité de récupérer sphéroplastes après le panoramique, car ils sont non-viables (données non publiées). Cela nécessite l&#39;amplification de l&#39;ADN et de transformation des mesures pour récupérer les plasmides codant pour les anticorps. Plusieurs étapes critiques du protocole permettent l&#39;ingénierie simultanée de pliage et de liaison des anticorps. Pour le dépistage, pour réussir, la bibliothèque scFv projeté doit être exprimé comme une fusion au signal peptide ssTorA. Sans cette séquence, les anticorps ne seront pas dirigés vers la voie Tat et ne seront donc pas translocation vers le périplasme 19. En outre, il est impératif qu&#39;un marqueur d&#39;épitope C-terminale est fusionnée à des anticorps pour permettre la détection des anticorps présentés dans le bacdosages ding. Il est clair que E. coli utilisé pour exprimer les scFv doit également avoir la machinerie de la voie Tat nécessaire, mais cela est vrai du E. couramment utilisé souches de E. coli. Les modifications apportées à ce protocole sont possibles pour améliorer son potentiel pour isoler des anticorps avec les caractéristiques souhaitées. Une étape de balayage panoramique soustractive peut être complété avant lavage contre l&#39;antigène cible pour épuiser la bibliothèque scFv des constituants non désirés. Les sphéroplastes de la bibliothèque peuvent être incubées avec des billes magnétiques revêtues d&#39;BCCP seul ou enduit d&#39;une protéine non désirée et les sphéroplastes qui se lient à ces billes peuvent être éliminés avant le criblage des sphéroplastes non liés restants pour se lier à la cible souhaitée. Comme indiqué dans les résultats représentatifs, un procédé pour améliorer l&#39;affinité d&#39;un scFv isolé est d&#39;inclure un concurrent soluble dans la réaction de panning pour rivaliser avec les scFv affichées sur les sphéroplastes. Parce que l&#39;échantillon solubleetitor est une protéine purifiée, aucun ADN est amplifié à partir d&#39;elle, de sorte que seules des séquences de scFv présentées sur les sphéroplastes seront récupérés dans la réaction PCR. En outre, cette méthode pourrait être étendue à d&#39;autres types d&#39;ingénierie d&#39;anticorps ou de protéines de liaison non-anticorps. E. affichage membrane interne coli est une plate - forme puissante pour les anticorps d&#39;ingénierie avec une affinité élevée et des niveaux élevés de solubilité intracellulaire. Cette méthode est particulièrement adaptée pour l&#39;ingénierie efficace des anticorps conçus pour fonctionner dans l&#39;environnement intracellulaire. Ces anticorps intracellulaires sont déjà explorés en tant qu&#39;agents thérapeutiques potentiels dans un certain nombre de domaines, y compris les maladies neurodégénératives, le cancer et les infections virales 31. Cette technique permettra une utilisation plus répandue des anticorps intracellulaires comme outils de recherche et de la médecine dans ces domaines et dans tout autre domaine où l&#39; étude d&#39; une protéine cible in situ est souhaitée.

Des anticorps capables de se replier et de fonctionner dans l&#39;environnement intracellulaire sont des outils prometteurs pour la recherche et des applications thérapeutiques. Ils ont la capacité de moduler l&#39; activité des protéines en se liant à une protéine cible dans les cellules pour éviter des interactions protéine-protéine, les interactions perturber protéine-acide nucléique, ou d&#39; empêcher l&#39; accès du substrat aux enzymes 1-5. Bien que les anticorps ont un grand potentiel pour des applications intracellulaires, les ingénierie pour le pliage correct et la solubilité dans le milieu intracellulaire, tout en maintenant la capacité à se lier à un antigène cible est difficile. L&#39;environnement cytoplasmique réduisant empêche la formation de liaisons disulfures normalement requises pour le pliage stable d&#39;anticorps pleine longueur et des fragments d&#39; anticorps, y compris à chaîne unique fragment variable (scFv) des anticorps 6,7. Un certain nombre d&#39;approches d&#39;évolution dirigée ont été utilisées pour concevoir des anticorps avec haffinités IGH pour cible les antigènes 8-10. Ces approches utilisent couramment phage display, l&#39; affichage de surface de levure ou d&#39; affichage de surface bactérienne pour cribler de grandes banques d&#39;anticorps 11-13. Ces méthodes sont puissantes et efficaces pour identifier des anticorps qui se lient à des cibles, mais ils dépendent de la voie sécrétoire de protéines de transport qui seront affichées 14-16. La voie de sécrétion de protéines dépliées translocation du cytoplasme réducteur dans la lumière du réticulum endoplasmique de la levure ou dans le périplasme dans les bactéries. Les protéines se replient alors dans des conditions d&#39;oxydation et sont affichées sur la surface des cellules ou encapsidés dans des particules de phage pour cribler une affinité de liaison 17,18. Par conséquent, les anticorps isolés à l&#39;aide de ces techniques ne seront pas nécessairement bien plier dans le cytoplasme, et la solubilité intracellulaire doivent souvent être conçus séparément si les anticorps sont utilisés dans des applications intracellulaires. Améliorerl&#39;efficacité des anticorps d&#39;ingénierie qui sont bien pliés dans le cytoplasme, nous avons précédemment rapporté le succès de MAD-TRAP (affichage à membrane ancrée pour la reconnaissance des protéines associant à base de Tat), un procédé de criblage d&#39; une banque d&#39;anticorps scFv en utilisant Escherichia coli Intérieures affichage de la membrane 19. Affichage interne de la membrane bactérienne repose sur la voie de translocation à double arginine (TAT) pour le transport d&#39;anticorps présentés, contrairement à d&#39;autres méthodes d&#39;affichage commun qui utilisent la voie sécrétoire. La voie Tat contient un mécanisme de contrôle de qualité qui ne permet que des protéines solubles, correctement repliées pour être transportés à partir de E. cytoplasme coli, à travers la membrane interne et dans le périplasme 20,21. Substrats surexprimé Tat (ie., Les protéines ciblées pour la voie Tat avec une fusion N-terminale du peptide signal de Tat ssTorA) qui sont bien plié dans le cytoplasme forment une translocation à long terme intermédiaire à l&#39; extrémité N-terminale in cytoplasme et l&#39; extrémité C-terminale 19 dans le périplasme. Ceci permet l&#39; affichage des substrats de Tat correctement repliés, y compris des fragments d&#39; anticorps, sur la face périplasmique de E. membrane interne coli. Après avoir enlevé la membrane externe par digestion enzymatique pour produire des sphéroplastes, des anticorps sont exposés à l&#39;espace extracellulaire (figure 1). Ceci permet à des substrats de Tat affichés sur la membrane interne devant être criblés pour la liaison à une cible spécifique. Il est important, en exploitant la voie Tat pour l&#39;affichage de la surface cellulaire garantit que seuls les anticorps dans la bibliothèque qui sont bien pliés dans le cytoplasme seront interrogés pour la liaison, ce qui permet l&#39;ingénierie simultanée d&#39;affinité et de pliage intracellulaire de liaison. Dans ce protocole, nous décrivons comment afficher une bibliothèque scFv sur la E. membrane interne coli, pan la bibliothèque contre un antigène cible, et d&#39; effectuer un écran secondaire pour identifier les constituants les plus prometteurs de la bibliothèque. Alors que nous nous concentrons<html> le protocole sur scFv, la méthode pourrait être appliquée à l&#39;ingénierie toute protéine dont l&#39;application nécessite le pliage de liaison et intracellulaire. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> Figure 1. Affichage membrane interne Tat. Dans E. coli, des anticorps scFv exprimés sous la forme d&#39; une fusion avec la séquence signal et ssTorA correctement replié dans le cytoplasme sont transportés à travers la membrane intérieure. Une translocation des formes intermédiaires, où les scFv sont ancrées dans la membrane interne de l&#39;extrémité N-terminale dans le cytoplasme et l&#39;extrémité C-terminale dans le périplasme. E. la membrane externe coli est digéré par voie enzymatique pour former des sphéroplastes, exposant ainsi les anticorps ancrés dans l&#39;espace extracellulaire et leur mise à disposition pour la détection en utilisant un anticorps qui se lie au marqueur fusionné en C-terminal de l&#39; épitope de l&#39;anticorps présenté.charge / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

<table><tbody><tr><td></td> Une <td>bibliothèque scFv appropriée doit être obtenue auprès d’une source commerciale ou universitaire.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC4100 Cellules E. coli</td><td>Centre de stock génétique Coli</td><td>6152</td><td>Les cellules doivent être chimiquement compétentes ou électrocompétentes, selon la méthode de transformation choisie.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Milieux de culture déshydratés Difco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (détergent à lyse cellulaire)</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3 000&nbsp ; daltons</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>Antigène cible</td><td>Varie</td><td>N/A</td><td>L’antigène cible purifié peut être acheté ou produit/purifié.</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Aimant Dynamag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de tube</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>Amorces PCR</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Les séquences d’amorces sont décrites dans le protocole.</td></tr><tr><td>10x tampon de réaction de ligase d’ADN T4</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucelotide kinase (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>Assurez-vous que le tampon de ligase T4 utilisé dans la réaction de phosphorylation de l’amorce contient 1 mM d’ATP.</td></tr><tr><td>5x Phusion HF buffer pack</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de solution de désoxynucléotide (dNTP), 10 mM chacun dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polymérase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>D’autres polymérases haute fidélité peuvent être utilisées comme alternative, mais la température de recuit en <fort>Tableau 3</fort> doit être ajustée.</td></tr><tr><td>Thermocycleur C1000 Touch avec double module de réaction rapide 48/48</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Coloration sûre du gel d’ADN</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV système de nettoyage et PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microdialyse filtre à membrane</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à fond rond en polystyrène à 96 puits</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar Couvercles de plaques de test en polystyrène général</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de plaques de microtitrage</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 puits EIA/RIA Easy Wash transparent à fond plat polystyrène à liaison élevée Microplaque</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-buvard polycarbonate 96 puits outil de réplication</td><td>Bel-Art Produits</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé instantané en poudre</td><td>Qualité Biologique</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polysorbate 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Réactif PopCulture (détergent concentré à lyse cellulaire)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxydase(HRP) produit chez la souris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique (H2SO4), 10&nbsp ; N solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap feuille d’aluminium</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre de microplaques BioTek Epoch</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

bacterial affichage intérieur-membrane pour le criblage d&#39;une bibliothèque de fragments d&#39;anticorps

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Les anticorps conçus pour la fonction intracellulaire doivent non seulement avoir une affinité pour leur antigène cible, mais doivent également être solubles et correctement repliés dans le cytoplasme. Les méthodes couramment utilisées pour l’affichage et le criblage des banques d’anticorps recombinants n’intègrent pas le contrôle de la qualité du repliement des protéines intracellulaires et, par conséquent, la capacité de liaison à l’antigène et le repliement cytoplasmique et la solubilité des anticorps modifiés à l’aide de ces méthodes doivent souvent être modifiés séparément. Ici, nous décrivons un protocole pour cribler une banque recombinante d’anticorps à fragment variable à chaîne unique (scFv) pour la liaison à l’antigène et le repliement cytoplasmique approprié simultanément. Le procédé exploite le mécanisme intrinsèque de contrôle de la qualité du repliement intracellulaire de la voie de translocation jumelle d’arginine (Tat) d’Escherichia coli pour afficher une banque scFv sur la membrane interne d’E. coli. La voie Tat garantit que seules les protéines solubles et bien repliées sont transportées hors du cytoplasme et affichées sur la membrane interne, éliminant ainsi les scFv mal repliés avant l’interrogation de la liaison à l’antigène. Après le retrait de la membrane externe, les scFv affichés sur la membrane interne sont placés contre un antigène cible immobilisé sur des billes magnétiques pour isoler les scFv qui se lient à l’antigène cible. Un criblage secondaire basé sur un test immuno-enzymatique (ELISA) est utilisé pour identifier les scFv les plus prometteurs pour une caractérisation supplémentaire. La liaison à l’antigène et la solubilité cytoplasmique peuvent être améliorées grâce à des cycles ultérieurs de mutagenèse et de criblage pour concevoir des anticorps à haute affinité et à haute solubilité cytoplasmique pour des applications intracellulaires.

Le pliage de la protéine mécanisme de contrôle de la qualité intracellulaire de la voie Tat chez E. coli limite le transport à travers la membrane cellulaire interne à des protéines qui sont bien pliées dans l&#39;environnement cytoplasmique réducteur. En surexprimant une fusion d&#39;un scFv à la séquence de signal ssTorA (la séquence signal de la protéine TorA, qui est naturellement transportées par la voie Tat 20), la translocation est bloqué, ce qui entraîne l&#39; affichage de scFv sur la membrane interne 19. Après rupture enzymatique de la membrane externe, les anticorps affichés sont mis à disposition pour le criblage pour l&#39;activité de liaison à l&#39;antigène. La capacité à tirer parti de la voie Tat pour l&#39; affichage scFv a été montré par Karlsson et al. 19 (Figure 6). Les anticorps scFv scFv13 et scFv13.R4 ont été fusionnés soit la séquence ssTorA native ou un ssTorA modifié qui n&#39;a pas la paire de résidus arginine-arginine reconnu parla voie Tat. scFv13.R4 a été conçu par Martineau et al. de scFv13 grâce à quatre tours de l&#39; évolution dirigée et est connu pour bien plier dans le cytoplasme 9. Ce scFv a été affiché sur la membrane intérieure, mais seulement lorsqu&#39;il est exprimé en tant que fusion à la séquence native de signal ssTorA (figure 6). Au contraire, scFv13 est pas bien plié cytoplasme 9, donc il est pas bien affiché sur la membrane interne, quelle que soit la séquence de signal auquel il est fusionné. En outre, si les scFv ont été exprimés dans des cellules qui ne disposaient pas de la protéine TATC, une composante essentielle de la machine Tat 20,28, l&#39; affichage n&#39;a pas été observée, montrant le lien important entre l&#39; affichage membrane interne et la voie Tat. Ces résultats montrent que seules les protéines qui contiennent le peptide signal Tat et qui sont correctement repliées dans le cytoplasme sont affichés sur la membrane intérieure, ce qui permet le transport à travers la voie Tat pour fonctionner comme un écran pour fol intracellulaireding. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> Figure 6. Détection de scFv affichés sur la membrane interne. Cytométrie de flux analyse a été effectuée pour détecter l&#39;affichage de mal plié scFv13 et bien plié scFv13.R4 sur la membrane interne. scFv ont été fusionnés à ssTorA native ou ssTorA (KK), où la paire Arg-Arg dans la séquence a été modifiée pour ssTorA Lys-Lys. Les balises C-terminal épitope FLAG sur les scFv ont été détectés avec un isothiocyanate de fluorescéine (FITC) anticorps anti-FLAG. Les cellules sans la protéine TATC (ΔtatC) et ssTorA-scFv13 sans l&#39;étiquette FLAG ont été testés comme témoins. M indique la valeur médiane de la fluorescence. Reproduit de référence 19 avec la permission. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; affichage intérieur-membrane peut isoler avec succès des anticorps scFv avec des niveaux élevés d&#39;affinité pour une protéine cible et des niveaux élevés de solubilité cytoplasmique. En outre, les cycles suivants de l&#39; évolution dirigée à l&#39; aide de l&#39; affichage membrane interne améliorent les caractéristiques d&#39; anticorps 19. Pour le démontrer, une bibliothèque PCR sujette aux erreurs sur la base de scFv13, qui a un niveau d&#39;affinité de liaison pour les β-galactosidase faible, a été éreinté contre l&#39;antigène cible β-galactosidase en utilisant l&#39;affichage et de panoramique méthode décrite dans le protocole. scFv 1-4 a été isolé après un tour de mutagenèse et de panoramique, et présentait une affinité de liaison supérieure à la ß-galactosidase que scFv13 (figure 7A) et un niveau plus élevé de solubilité cytoplasmique (figure 7B). Une nouvelle bibliothèque, sur la base de scFv 1-4, a été faite par PCR sujette à l&#39;erreur, et le panoramique de cette bibliothèque de deuxième génération contreβ-galactosidase a été effectuée en utilisant une modification du protocole décrit. Le panoramique contre β-galactosidase pour le second tour de l&#39;évolution a été faite en présence de purifiée, soluble scFv 14 comme un concurrent pour améliorer la probabilité d&#39;isoler des clones avec une affinité supérieure scFv 1-4. Après ce deuxième cycle de mutagenèse et de panoramique, scFv 2-1 et 2-3 scFv ont été isolés en utilisant le criblage secondaire à base d&#39;ELISA. Ces scFv non seulement présentent une affinité de liaison plus élevée pour les β-galactosidase que scFv13, mais aussi présenté une meilleure liaison que le clone de première ronde scFv 1-4. scFv 01/02 présentait β-galactosidase de liaison comparable à celle de scFv13.R4 (figure 7A). scFv 2-3 montre également une nouvelle augmentation de la solubilité cytoplasmique par rapport à scFv 14, mettant en évidence l&#39;ingénierie simultanée de solubilité et de liaison d&#39;antigène. Etant donné que l&#39;affinité et l&#39;expression soluble des scFv sont criblés pour en même temps, il est possible qu&#39;un scFv sélectionné a modnérer solubilité, mais haute versa liaison ou vice. Par exemple, scFv 01/02 a l&#39;expression soluble inférieure à celle scFv 2-3, mais il présente une affinité de liaison supérieure à la ß-galactosidase. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> Figure 7. Cible de liaison et d&#39; expression cytoplasmique de scFv variants isolés en utilisant l&#39; affichage membrane interne. (A) scFv ont été exprimées dans le cytoplasme de E. coli (par exemple des cellules., sans la séquence signal ssTorA) avec une hexahistidine (6 × -Son) tag et purifiée en utilisant l&#39; acide spin-colonnes de nickel-nitrilotriacétique. La liaison du scFv purifiées à la ß-galactosidase a été mesurée par un test ELISA. scFv purifiées ont été chargés sur des plaques ELISA β-galactosidase revêtues et les scFv liés ont été détectés avec un anticorps anti-6 x His. Les données sont une moyenne de six répétitions, et la barre d&#39;erreur indique l&#39;erreur standard de la moyenne.(B) Les fractions solubles et insolubles des lysats cellulaires provenant de cellules exprimant scFv cytoplasmique ont été analysés par Western blot sondé avec un anticorps anti-6 x His. La concentration totale des protéines a été utilisée pour normaliser le chargement des échantillons. Reproduit (A) et adapté (B) de référence 19 avec la permission. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous proposons une méthode permettant de cribler simultanément une bibliothèque de fragments d’anticorps pour l’affinité de liaison et la solubilité cytoplasmique en utilisant la voie de translocation jumelle-arginine d’Escherichia coli, qui a un mécanisme de contrôle de qualité inhérent pour le repliement des protéines intracellulaires, pour afficher les fragments d’anticorps sur la membrane interne.

Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage d&#39;une bibliothèque de fragments d&#39;anticorps

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

L'objectif général de cette procédure est d'exploiter le contrôle de qualité du repliement de la voie de translocation à double arginine pour concevoir en une seule étape la liaison de fragments d'anticorps et leur repliement intracellulaire, ce qui aura des applications dans l'ingénierie d'anticorps fonctionnant à l'intérieur des cellules. Cette méthode peut aider à surmonter des défis clés dans le domaine de l'ingénierie des anticorps, tels que la difficulté à concevoir des anticorps capables de se replier et de fonctionner correctement dans l'environnement cytoplasmique réducteur. Seuls les anticorps qui se replient correctement dans le cytoplasme sont exposés et testés pour leur capacité de liaison.Offre un avantage par rapport à l'affichage chez la levure et chez le phage, qui reposent sur des voies sécrétoires pour l'affichage. Les implications de cette technique s'étendent à notre thérapie des maladies neurodégénératives, du cancer et des infections virales, car ces maladies impliquent une pathogenèse intracellulaire qui pourrait être ciblée par des anticorps. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la compréhension de la génération et de la manipulation des sphéroplastes est difficile.Après avoir fusionné la bibliothèque d'anticorps scFv à la séquence signal ssTorA et l'avoir cultivée à 37 degrés Celsius sous agitation pendant trois heures, laisser s'exprimer la bibliothèque scFv à 20 degrés Celsius et 225 tr/min pendant la nuit, soit de 15 à 22 heures. À l'issue de l'incubation, utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres. Puis centrifuger le volume calculé de culture induite dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre à 12 000 ×g et à température ambiante pendant cinq minutes.Éliminer le surnageant et utiliser 100 microlitres de tampon de fractionnement glacé ou fB pour resuspendre les culots. Puis centrifuger les échantillons à 12 000 ×g et à température ambiante pendant une minute. Après l'élimination du surnageant, utiliser 350 microlitres de fB glacé supplémenté avec 3,5 microlitres de lysozyme à 10 milligrammes par millilitre pour resuspendre les culots.Ensuite, tout en vortexant lentement les tubes, ajouter goutte à goutte 700 microlitres de EDTA 1 millimolaire, puis incuber les tubes sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 20 minutes afin de mélanger les échantillons. Retirer les tubes de l’agitateur rotatif. Ajouter 50 microlitres de MgCl₂ à 0,5 molaire prélevé sur glace à chaque tube et incuber ceux-ci sur glace pendant 10 minutes.Ensuite, centrifuger les échantillons à 11 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Maintenant, à l’aide d’une micropipette et d’une pointe de un millilitre, aspirer lentement une partie du culot. Puis, en tenant le tube incliné, l’ouverture étant directement au-dessus d’un nouveau tube de 1,5 millilitre, sortir lentement la pointe de la pipette du surnageant et faire glisser le culot dans le nouveau tube.Après avoir éliminé le surnageant en excès, utilisez un millilitre de PBS glacé pour resuspendre les sphéroplastes. Les sphéroplastes doivent être complètement resuspendus avant le panning, car les scFv non liants présents dans les agrégats entraîneraient des faux positifs lors du panning. Après avoir biotinylé l'antigène cible conformément au protocole décrit, resuspendez les billes magnétiques revêtues de streptavidine dans leur flacon d'origine.Ensuite, transférez sept à dix fois 10 à la puissance 9 billes dans un tube de 1,5 millilitre. Placez le tube contenant les billes sur le support magnétique pendant deux minutes afin de regrouper les billes sur le côté du tube, puis aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Retirez le tube de l’aimant et utilisez du PBS pour resuspendre les billes sans générer de bulles.Ensuite, remettez le tube sur l'aimant et éliminez le tampon avant de laver les billes deux fois supplémentaires avec du PBS. Ajoutez un millilitre de lyzat contenant l'antigène biotinylé aux billes et incubez à température ambiante pendant 30 minutes en agitant doucement. Après l'incubation, lavez les billes cinq fois avec du PBS contenant 1 % de BSA.Ensuite, utiliser du PBS avec 1 % de BSA pour resuspendre les billes. Pour cribler la bibliothèque d'anticorps scFv, commencer par ajouter quatre fois dix puissance neuf spheroplastes et huit fois dix puissance huit billes dans un tube stérile de 15 millilitres. Ajouter du PBS 1x pour amener le volume total à quatre millilitres.Ensuite, aliquoter la solution dans quatre tubes de 1,5 millilitre contenant chacun un millilitre, puis incuber les réactions à quatre degrés Celsius en agitant doucement pendant cinq heures. Pour préparer les sphéroplastes liés aux billes en vue de la PCR, placer les tubes de réaction de trempage sur l'aimant pendant trois minutes. Éliminer le surnageant et laver les billes quatre fois avec du PBS 1 x contenant 1 % de BSA, comme précédemment.Ensuite, utiliser 25 microlitres d’eau ddH2O par tube pour remettre en suspension les billes. Comme décrit dans le protocole écrit, effectuer une PCR sur tout le plasmide afin d’amplifier les gènes codant pour les scFv liés aux billes, puis recirculairiser le plasmide à partir du produit de PCR. Transformer l’ensemble de la réaction dans des cellules MC4100 équilibrées selon le protocole écrit.Pour identifier les clones à l'aide d'un ELISA, décongeler un tube de la sous-bibliothèque triée et étaler sur des géloses LB. Ajouter 200 microlitres de LB contenant 20 microgrammes par millilitre de chloramphénicolole dans chaque puits d'une plaque de culture 96 puits à fond rond. À l'aide d'une pipette, prélever une colonie individuelle depuis la gélose.Ensuite, placer la pointe dans le premier puits de la plaque 96 puits et mélanger doucement pour inoculer. Continuer à inoculer une colonie dans chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures sur un agitateur de microplaque.Après avoir préparé une solution de revêtement d'antigène cible conformément au protocole décrit dans le texte, ajouter 50 microlitres de la solution dans chaque puits d'une plaque ELISA en polystyrène clair à liaison élevée de 96 puits. Incuber les plaques à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, répliquer les colonies des plaques de culture de 96 puits sur des plaques d'agar conformément au protocole décrit dans le texte.Ensuite, videz la solution de revêtement des plaques ELISA et ajoutez 100 microlitres de solution de blocage préparée selon le protocole indiqué dans le texte à chaque puits. Incubez à température ambiante pendant au moins deux heures ou à quatre degrés Celsius toute la nuit. Ajoutez 20 microlitres d'un détergent concentré pour lyse cellulaire à chaque puits de la plaque de culture à fond rond et incubez la plaque sur un agitateur pour microplaque à température ambiante pendant 15 à 20 minutes.Vider la solution de blocage des plaques ELISA et laver les puits quatre fois avec 200 microlitres de tampon de lavage préparé selon le protocole indiqué dans le texte. Après avoir retiré le dernier lavage, transférer 50 microlitres de chaque puits de la plaque de lyse cellulaire vers le puits correspondant de la plaque ELISA. Incuber les plaques à température ambiante pendant une à deux heures.Passez à la vidange des échantillons de la plaque ELISA et lavez les puits quatre fois. Ensuite, préparez la solution d'anticorps pour la détection des scFv conformément au protocole indiqué. Ajoutez 50 microlitres de l'anticorps dans chaque puit et incubez pendant une à deux heures à température ambiante.Lavez les plaques ELISA quatre fois avec le tampon de lavage avant d'ajouter 200 microlitres par puits de substrat HRP préparé selon le protocole du fabricant. Incubez les plaques à l'abri de la lumière, à température ambiante, pendant 30 à 60 minutes. Pour arrêter la réaction, ajoutez 50 microlitres d'H2SO4 trois molaire dans chaque puits et pipetez doucement pour mélanger la solution.Enfin, mesurez l'absorbance en utilisant un lecteur de plaque à 492 nanomètres. Dans cette expérience, les anticorps scFv scFv13 et scFv13.R4 ont été fusionnés soit à la séquence ssTorA native, soit à une version modifiée de ssTorA qui n'est pas reconnue par la voie de translocation à arginine jumelée, également appelée voie Tat. ScFv.R4 se replie correctement et est exprimé sur la membrane interne lorsqu'il est fusionné au ssTorA natif. L'anticorps ScFv13 ne se replie pas correctement et n'est pas affiché sur la membrane interne, quelle que soit la peptide signal Tat auquel il est fusionné. Ces résultats montrent que seules les protéines contenant le peptide signal Tat et correctement repliées dans le cytoplasme sont affichées sur la membrane interne, ce qui permet à la voie Tat de servir de système de criblage pour le repliement intracellulaire.Dans cette expérience, une bibliothèque de PCR sujette aux erreurs, basée sur le scFv13 présentant une faible affinité de liaison pour la bêta-galactosidase, a été criblée contre la bêta-gal. Le scFv 1-4 a été isolé et a montré une affinité de liaison à la bêta-gal supérieure à celle du scFv13, ainsi qu’un niveau plus élevé de solubilité cytoplasmique. En utilisant le scFv 1-4 comme compétiteur contre une bibliothèque de deuxième génération de scFv 1-4, les variants scFv 2-1 et 2-3 ont été isolés et ont démontré des affinités de liaison à la bêta-gal encore plus élevées que celles du scFv13 et du scFv 1-4, mettant en évidence l’ingénierie simultanée de la solubilité et de la liaison à l’antigène.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que les ELISA utilisant un lysat purifié peuvent être réalisées afin de vérifier la spécificité de l'antigène et de déterminer l'affinité de liaison des clones isolés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre comment cribler un anticorps pour détecter sa liaison à un antigène d'intérêt, en utilisant la voie Tat pour exprimer cette bibliothèque et un criblage par billes magnétiques afin d'enrichir et d'isoler les capteurs d'antigène. N'oubliez pas que le travail avec de l'acide sulfurique peut être extrêmement dangereux et qu'il est nécessaire de porter des équipements de protection individuelle adaptés.

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Ce protocole décrit la production d'un anticorps thérapeutique dans un système d'expression mammalien. Les procédés décrits comprennent la préparation d'ADN vecteur, la transfection stable et l'adaptation d'une lignée de cellules embryonnaires de rein 293 humaine sans sérum, mis en place des cultures à grande échelle et la purification par chromatographie d'affinité.

L&#39;échelle du laboratoire: Production et purification d&#39;un anticorps thérapeutique

Découvrez l'affichage intracellulaire d'anticorps utilisant la voie de translocation twin-arginine d'Escherichia coli pour cribler simultanément l'affinité de liaison et la solubilité des fragments d'anticorps.

Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage d'une bibliothèque de fragments d'anticorps

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