Name: Sporulation efficace de Saccharomyces cerevisiae Dans un 96 Multiwell Format (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Apprenez la sporulation efficace de Saccharomyces cerevisiae en format 96 puits pour le criblage à haut débit. Cette méthode optimise l'aération pour améliorer les rendements de sporulation en génétique.

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Ce travail a été soutenu par une subvention Joseph P. Healey de l&#39;Université du Massachusetts à Boston (LSH) et R15 GM86805 du NIH (LSH). SMP est supporté en partie par une Sanofi-Genzyme Fellowship à l&#39;Université du Massachusetts à Boston.

1. Préparation de sporulation Remarque:. Les milieux décrits dans ce protocole sont réalisés en utilisant des recettes et des méthodes standard 13,17 Le tableau 1 donne la formulation pour 1 L des différents médias utilisés dans ce protocole. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> bactopeptone </td><td style="width: 50px;"> Extrait de levure </td><td style="width: 50px;"> gélose Bacto </td><td style="width: 60px;"> Dextrose </td><td style="width: 70px;"> L&#39;acétate de potassium </td><td style="width: 60px;"> Glycérol </td><td style="width: 60px;"> ddH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> plaques GPJ </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml </td><td> 970 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> des boîtes de YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> liquide YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> liquide YPA </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> médias sporulation </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Formulations des médias Les montants sont donnés pour 1 L de médias. Spécificités sur les médiasles ingrédients peuvent être trouvés dans la table des matières. <ol><li> Si toutes les cellules sporulantes sera le même Génotype, suivez cette procédure: <ol><li> la souche de levure Thaw à utiliser sur un (YPGlycerol) plaque GPJ. Cultivez levure pour 12-16 heures à 30 ° C. Fait important, les cellules SK1 sont également prêts à sporuler, donc les souches SK1 ne doivent pas être laissés trop longtemps sur des plaques de GPJ, ou ils peuvent sporuler sur la plaque. Remarque: Une souche fraîchement décongelé cultivée sur YPG est préféré, que l&#39;utilisation du glycérol comme source de carbone nécessite la phosphorylation oxydative, et sélectionne ainsi les cellules qui ont l&#39;ADN mitochondrial fonctionnel. les cellules SK1 ont tendance à perdre de l&#39;ADN mitochondrial fonctionnel et devenir petites. L&#39;ADN mitochondrial fonctionnelle est nécessaire pour la sporulation. </li><li> Streak levure à partir de la plaque de GPJ sur un YPD (YPDextrose) plaque pour des colonies isolées. Cultiver la levure sur la plaque YPD 24-28 h à 30 ° C. </li><li> Après environ 36-48 h de la croissance sur YPD milieux solides, démarrer une culture YPD 25 ml en utilisant une seule coloniede la plaque YPD. Cultivez cette culture jusqu&#39;à ce que les cellules sont sur ​​DO 600 = 4,0 à 7,0. Effectuez cette étape à 30 ° C pendant la nuit dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute. </li><li> De la culture YPD, utiliser une quantité appropriée de cellules pour démarrer 1000 ml de YPA (YPAcetate) culture qui est DO 600 = 0,1 pour chaque besoin plaque à 96 puits dans la section 2. Cultiver la levure dans un incubateur agitateur à 30 ° C (agitation à 220 rpm) jusqu&#39;à ce que la DO600 de la culture est compris entre 1,3 et 1,5. Note: inoculer 100 ml de culture LPJ pour chaque plaque multipuits 96 à cribler dans la section 2. Par exemple, si le dépistage quatre 96 plaques multipuits, 400 ml de culture LPJ seront nécessaires. A partir de 10% du volume supplémentaire dans la culture LPJ est nécessaire pour protéger contre la perte de volume par évaporation. En règle générale, il faudra compter entre 12-16 h pour les cellules pour atteindre la DO appropriée 600; la durée peut varier en fonction du génotype de la souche de levure. LPJ est le média de présporulation. préculturedans de l&#39; acétate aide induire l&#39; expression des gènes (comme IME1) nécessaire pour efficace et synchrone sporulation 6. </li><li> Spin à 1.800 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min pour sédimenter les cellules cultivées dans LPJ. Laver les cellules 1x avec 0,5 volume d&#39;eau désionisée autoclavée stérile. Spin à nouveau, et jeter laver. Resuspendre les cellules dans les médias 1x volume de sporulation. Continuer à la section 2. </li></ol></li><li> Si l&#39; utilisation de cellules pour sporulation qui sont des génotypes différents, (c. -à- transformées avec des plasmides différents ou contenant différentes mutations, généralement obtenues et stockées sous forme de stocks congelés), des cellules de tableau des différents génotypes dans un format 96 multipuits. Ensuite, suivez cette procédure: <ol><li> Utilisez un 96 broches frogger stérile pour transférer des cellules à partir de stocks congelés décongelés dans 96 plaque (s) multipuits sur YPG milieux solides. Cultiver la levure pendant la nuit à 30 ° C. </li><li> Utilisation d&#39;un 96 broches frogger stérile, transférer les cellules de YPG milieux solides sur YPD milieux solides ou sélectiveun milieu solide ( par exemple, un milieu minimal synthétique dépourvu des acides aminés, si les cellules contiennent des plasmides qui nécessitent une sélection). Cultiver la levure à 30 ° C jusqu&#39;à ce que les colonies sont formées pour chaque souche, typiquement 1 jour sur YPD et 2 jours si des milieux sélectifs est nécessaire. </li><li> Aliquoter 1,2 ml de milieu liquide YPD ou des milieux liquides sélectifs dans chaque puits d&#39;une plaque multipuits 96 profondeur de 2 ml. Transfert des cellules à partir de supports solides dans des milieux liquides en utilisant un frogger, couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban, et de croître pendant une nuit dans 30 ° C shaker, agitation à 220 rpm. Remarque: Pour minimiser la contamination, des plaques de couverture en utilisant les couvercles en plastique à partir d&#39;une boîte de Pétri rectangulaire. Tenir les paupières en place au moyen d&#39;un morceau de ruban adhésif, de sorte que la circulation de l&#39;air est très peu limité. </li><li> plaques centrifuger à 1800 xg pendant 5 min, en utilisant un seau centrifuge oscillant avec des adaptateurs pour accueillir plaques à 96 puits. Décanter médias de cellules; ajouter 500 ul LPJ à chaque puits et resuspendre cellules sédimentées dans la LPJ. Couvertureavec couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. </li><li> Cultiver les cellules pendant 15 heures à 30 ° C dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute. Continuer à la section 2. </li></ol></li></ol> 2. Les cellules sporulantes dans un 96 Multiwell Format <ol><li> Ajouter un ou l&#39;autre de 3 mm perle de verre solide stérile ou un stériles 5 mm x 2 mm barre d&#39;agitation magnétique dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits avec 1,3 ml de puits. (Voir résultats représentatifs ci - dessous pour une discussion sur l&#39; opportunité d&#39;utiliser un cordon ou d&#39; une barre d&#39;agitation.) </li><li> Si toutes les cellules à cribler sont du même génotype, aller à 2.2.1. Si les cellules à cribler sont de différents génotypes, aller à 2.2.2. <ol><li> Prenez des cellules de l&#39;étape 1.1.5 et aliquote de 500 pi de cellules plus les médias dans chaque puits de la plaque multipuits 96. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3. </li><li> les cellules de spin qui sont LPJ de 1.2.4 à 1800 g pendant 5 min, en utilisant une centrifugeuse à godet oscillant avec des adaptateurs pour recevoir des plaques à 96 puits. verser def support de cellules. Ajouter 500 ul de milieu de sporulation dans chaque puits et les remettre en suspension les cellules sédimentées dans le milieu de sporulation. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3. </li></ol></li><li> Si vous utilisez une perle de verre, placer les échantillons dans un incubateur sous agitation à 30 ° C et agiter à 220 rpm pour la sporulation. Si vous utilisez une barre d&#39;agitation magnétique, placer les échantillons sur une plaque d&#39;agitation à l&#39;intérieur d&#39;un 30 ° C incubateur pour sporulation. Remarque: La vitesse d&#39;agitation exacte pour les barres d&#39;agitation magnétique est pas très important, aussi longtemps que toutes les barres se déplacent énergiquement et la culture est aéré. </li><li> Pour surveiller la progression à travers la sporulation, prélever des échantillons de la culture sporulée pour la visualisation, Ajouter 6 ul de cellules à partir des cultures sporulées à 24 pi de milieu de sporulation dans une plaque à 96 puits lamelle couvre-objet (1: 5 de dilution). Laisser les cellules se contenter de 5 minutes avant d&#39;examiner les cellules en utilisant un microscope inversé. Remarque: Dans les cellules SK1 de type sauvage, les spores matures compacts formeront par 36 heures après le transfert aux médias de sporulation. La progression à travers la sporulation peut être contrôlée par microscopie en utilisant des marqueurs fluorescents, comme un marqueur nucléaire (c. -à -HTB2 mCherry 18) pour examiner la méiose ou un marqueur de la membrane ProSpore (c. -à- G20 19) pour examiner la morphogenèse des spores. En variante, la formation de spores réfringents peut être vu à l&#39;aide de DIC Nomarski microscopie à partir d&#39;environ 12 heures après le transfert au milieu de sporulation. </li></ol>

<ol><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+in+budding+yeast%3A+sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li>
<li>Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+meiotic+recombination+initiation%3A+general+principles+and+molecular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways.</a> Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).</li>
<li>Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+signaling+pathways+orchestrate+yeast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development.</a> Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).</li>
<li>Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+growth+and+development+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of growth and development in yeast.</a> Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparison+of+recombination+and+synaptonemal+complex+formation+during+meiosis+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae.</a> Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).</li>
<li>Liti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+domestic+and+wild+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population genomics of domestic and wild yeasts.</a> Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).</li>
<li>McCusker, J. H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+sporulation+of+yeast+in+media+buffered+near+pH6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6.</a> J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).</li>
<li>Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+which+affect+the+frequency+of+sporulation+and+tetrad+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+baker%27s+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22">Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2015 (11), 1003-1008 (2015).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protocols%22">Cold Spring Harb. Protocols</a>. (10), 908-913 (2015).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpession+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpession screen.</a> J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).</li>
<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Labooratory+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous présentons ici un protocole de sporulation SK1 levure dans un format de 96 multipuits. Aération est la clé pour la sporulation efficace, ce qui nécessite l&#39;utilisation soit d&#39;un barreau d&#39;agitation ou une perle de verre dans chaque puits. Lorsque les cellules sont sporulés dans une plaque multipuits 96 dans un incubateur à agitation sans soit une perle ou une barre d&#39;agitation, les cellules ne sporulation pas efficacement. Seule une petite augmentation de l&#39;efficacité de la sporulation est obser...

La sporulation chez la levure en herbe a été étudié pour donner un aperçu de nombreux aspects de la biologie, y compris le contrôle de la ségrégation des chromosomes lors de la méiose 1, les mécanismes de recombinaison génétique 2, le contrôle du développement par la cellule de signalisation 3, contrôle nutritionnel du développement 4, la transcription régulation du développement 5, et l&#39;examen de la formation de spores 6. La formation de spores comprend un événement de division cellulaire nouvelle impliquant la formation de nouveaux compartiments à l&#39; intérieur de la membrane de la cellule mère , suivie par le dépôt d&#39;une paroi protectrice 6 spores. Ces études qui examinent les cellules sporulantes profitent souvent de la souche de levure sporulation rapidement SK1, qui peut subir le processus de sporulation dans environ 24 heures de façon relativement efficace 7,8. Bien que l&#39; optimisation des conditions de sporulation de la levure bourgeonnante ont été décrits 13/09, ces expériencess examiné sporulation sur des supports solides ou dans les grandes cultures liquides à grande échelle où sporulation est effectuée en utilisant des tubes de culture ou flacons. Nous décrivons ici un procédé pour la sporulation de la levure dans un format de plaque multipuits 96. Nous constatons que, pour ce procédé, l&#39;aération est essentielle pour la sporulation synchrone et efficace, et ont mis au point des techniques pour assurer une sporulation suffisante d&#39;un format multi-puits de faible volume. Sporuler dans un format de plaque multipuits 96 permet de cellules devant être criblés en utilisant des techniques à haut débit et des réactifs optimisés pour un format de plaque multipuits, un tel criblage pour des suppresseurs de copies élevé en utilisant une bibliothèque de tuiles 14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1,3 ml DeepWell Plates ThermoScientific</td><td></td><td>260251</td><td>Utilisé pour la sporulation</td></tr><tr><td>Nunc 2,0 ml Plaques DeepWell</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Utilisé pour la croissance par présporulation, étape 1.2.3</td></tr><tr><td>Bille de verre de 3 mm</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Utilisé pour la sporulation</td></tr><tr><td>Barre d’agitation de 5 mm x 2 mm, paquet de 12</td><td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Utilisée pour la sporulation</td></tr><tr><td>96 bien frogger</td><td>V& P Scientific</td><td>VP407</td><td>nécessaire pour l’étape 1.2</td></tr><tr><td>copieur de bibliothèque</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381</td><td>nécessaire pour l’étape 1.2 ; à utiliser avec la</td></tr><tr><td>boîte de Pétri rectangulaire</td> frogger <td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>nécessaire pour l’étape 1.2</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD</td><td>212750</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Plaque inférieure en verre noir à 96 puits</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>nécessaire pour l’étape 2.4</td></tr></tbody></table>

sporulation efficace de<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; dans un 96 multiwell format

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Pendant les périodes de stress nutritionnel, Saccharomyces cerevisiae subit une gamétogenèse, connue sous le nom de sporulation. Les cellules de levure diploïdes qui sont privées d’azote et de carbone initieront le processus de sporulation. Le processus de sporulation comprend une méiose suivie de la formation de spores, où les noyaux haploïdes sont emballés dans des spores résistantes à l’environnement. Nous avons développé des méthodes pour la sporulation efficace de levures bourgeonnantes dans 96 plaques multipuits, afin d’augmenter le débit de criblage des cellules de levure pour les phénotypes de sporulation. Ces méthodes sont compatibles avec le criblage avec des plasmides contenant des levures nécessitant une sélection nutritionnelle, lorsque des milieux minimaux appropriés sont utilisés, ou avec le criblage de levures avec des altérations génomiques, lorsqu’un régime de présporulation riche est utilisé. Nous constatons que pour cette méthode, l’aération pendant la sporulation est essentielle à la formation des spores, et nous avons mis au point des techniques pour assurer une aération suffisante qui sont compatibles avec le format de plaques multipuits 96. Bien que ces méthodes n’atteignent pas le niveau typique de sporulation de ~80 % qui peut être atteint dans des expériences basées sur des flacons de grand volume, ces méthodes permettront d’atteindre de manière fiable un niveau de sporulation d’environ 50 à 60 % dans des plaques multipuits de petit volume.

<html> Pour évaluer ce protocole, l&#39; efficacité de sporulation obtenus à partir de cellules sporulantes dans des plaques multipuits (comme décrit ci - dessus) ont été comparées à des cellules sporulées en utilisant des volumes plus importants dans des flacons (tableau 2). L&#39;utilisation de plaques multipuits n&#39;a pas atteint le rendement élevé vu quand sporulation dans des flacons, où ~ 80% d&#39;efficacité peut être régulièrement vu. Sporulation dans des plaque...

Ici, la sporulation de Saccharomyces cerevisiae est réalisée dans un format multipuits 96.

Sporulation efficace de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Dans un 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

L'objectif général de ce protocole est de réaliser efficacement la sporulation de levures bourgeonnantes dans un format 96 puits. Bien que de nombreux criblages à grande échelle aient été menés sur la levure bourgeonnante, les études à haut débit portant sur la méiose et la sporulation ont été limitées. La technique décrite dans cette vidéo présente l'avantage de permettre une sporulation efficace des levures de manière économique, dans un format 96 puits compatible avec le criblage à haut débit.J'ai eu l'idée de cette méthode parce que je souhaitais utiliser une banque de plasmides en mosaïque de deux microns afin de rechercher des suppresseurs à haut nombre de copies d'un mutant incapable de former des spores réfractiles. Initialement, mes rendements de sporulation étaient faibles en format 96 puits. J'ai constaté que cela était dû à une aération insuffisante.Commencez cette procédure en décongelant la souche de levure SK1 sur une plaque de YPG (extrait de levure, peptone, glycérol). À l’aide d’un bâtonnet stérile, prélève une petite quantité de cellules à partir du flacon congelé contenant la souche en glycérol et étale-la sur une plaque de YPG. Incubez la levure pendant 12 à 16 heures à 30 degrés Celsius.Ensuite, étaler les levures provenant de la boîte YPG sur une boîte contenant du milieu extrait de levure peptone dextrose, ou YPD, afin d'obtenir des colonies isolées. Faire croître les levures sur la boîte YPD pendant 24 à 48 heures à 30 degrés Celsius. Après 24 à 48 heures de croissance sur milieu solide YPD, amorcer une culture de 25 millilitres de YPD en utilisant une colonie isolée provenant de la boîte YPD.Faire croître cette culture pendant la nuit dans un incubateur agité à 30 degrés Celsius à 220 tr/min jusqu'à ce que les cellules atteignent une DO600 comprise entre 4,0 et 7,0. Le jour suivant, utiliser une quantité appropriée de cellules provenant de la culture YPD pour démarrer une culture de 125 millilitres dans du milieu extrait de levure peptone acétate, ou YPA, avec une DO600 de 0,1. Faire croître la culture dans un incubateur agité à 30 degrés Celsius à 220 tr/min jusqu'à ce que la DO600 soit comprise entre 1,3 et 1,5.Transférez la culture dans des tubes de centrifugation et centrifugez à 1800×g dans une centrifugeuse de table pendant cinq minutes afin de former un culot cellulaire. Lavez les cellules une fois avec un volume égal à 0,5 fois le volume initial d’eau désionisée stérile et autoclavée. Centrifugez à nouveau puis jetez l’eau.Resuspendre les cellules dans un volume égal de milieu de sporulation. Pour préparer des cellules de génotypes différents, les cellules provenant de stocks congelés décongelés dans une plaque multipuits 96 sont d'abord transférées sur un milieu solide YPG. Passer au flammage un porte-embouts 96 pointes (frogger) puis le refroidir brièvement sur une plaque de milieu solide avant de le mettre en contact avec les colonies de levure.Faire pousser la levure toute la nuit à 30 degrés Celsius. Le jour suivant, transférer les cellules du milieu solide YPG sur le milieu solide YPD ou un milieu sélectif, selon le génotype de la souche. Le milieu YPD est utilisé dans cette démonstration.Faire pousser la levure à 30 degrés Celsius jusqu'à la formation de colonies pour chaque souche. Répartir 1,2 millilitre de milieu liquide YPD dans chaque puits d'une plaque profonde 96 puits. Transférer les cellules du milieu solide vers le milieu liquide.Couvrez la plaque avec un couvercle en plastique provenant d'une boîte de Pétri rectangulaire et fixez le couvercle en place à l'aide d'un morceau de ruban adhésif afin de limiter au minimum la circulation de l'air. Incubez les cellules toute la nuit dans un agitateur à 30 degrés Celsius à 220 tr/min. Le jour suivant, centrifugez à 1800X G pendant cinq minutes.Versez le milieu et ajoutez 500 microlitres de YPA dans chaque puits. Resuspendez les cellules en culot. Couvrez la plaque avec un couvercle en plastique maintenu en place par du ruban adhésif.Faire croître les cellules pendant 15 heures dans un incubateur agité à 30 degrés Celsius à 220 tr/min. Pour assurer une aération adéquate favorisant une sporulation efficace, ajouter dans chaque puits d'une plaque 96 puits soit une bille de verre solide stérile de trois millimètres, soit une barre d'agitation magnétique stérile de cinq millimètres par deux millimètres. Si toutes les cellules sont du même génotype, répartir 500 microlitres de cellules additionnés de milieu dans chaque puits de la plaque 96 puits.Couvrez la plaque avec un couvercle en plastique maintenu en place par du ruban adhésif. Si les cellules sont de génotypes différents, centrifugez les cellules présentes dans du YPA à 1800×g pendant cinq minutes et jetez le milieu. Ajoutez 500 microlitres de milieu de sporulation dans chaque puits.Et resuspendre les cellules en culot dans le milieu de sporulation. Couvrir la plaque avec un couvercle en plastique maintenu en place par du ruban adhésif. Si l'on utilise des billes de verre, placer les échantillons dans un incubateur agitateur à 30 degrés Celsius et agiter à 220 tr/min pour la sporulation.Si l'on utilise des barreaux magnétiques, placer les échantillons sur une plaque agitatrice à l'intérieur d'un incubateur à 30 degrés Celsius pour la sporulation. La vitesse exacte d'agitation des barreaux magnétiques n'est pas très importante, tant que tous les barreaux se déplacent activement et que la culture est aérée. 36 heures plus tard, récupérer les échantillons pour surveiller l'avancement de la sporulation.Prélève six microlitres de cellules à partir de chaque culture sporulante et ajoute-les à 24 microlitres de milieu de sporulation dans une plaque à 96 puits munie d'un fond en lame de couverture. Laisse les cellules se déposer pendant cinq minutes avant de les examiner au microscope inversé. Une sporulation représentative de deux souches différentes est illustrée dans ces images de cellules visualisées à l’aide d’un objectif 63X sur un microscope inversé.Des tétrades réfractiles, indiquées par les flèches, peuvent être observées dans la culture de type sauvage. Mais elles ne sont pas présentes dans la culture contenant les cellules mutantes smk1 dépourvues de sporulation. Des comparaisons ont été effectuées entre les rendements de sporulation de cellules sporulées dans des plaques multi-puits et de cellules sporulées à l'aide de volumes plus importants dans des flacons.L'utilisation de plaques multi-puits n'a pas permis d'atteindre l'efficacité élevée habituellement observée lorsqu'on utilise le protocole plus classique de sporulation en flacon. La sporulation en plaques multi-puits avec une aération adéquate peut atteindre des rendements de sporulation suffisants, supérieurs à 50 %, les meilleurs résultats étant obtenus avec un barreau d'agitation de cinq millimètres. Toutefois, compte tenu du coût élevé des petits barreaux d'agitation, les rendements obtenus avec des billes de verre sont comparables.Bien que les barreaux d'agitation de cinq et sept millimètres s'insèrent tous deux dans une cavité d'une plaque multidose à 96 puits, l'utilisation d'un barreau d'agitation de sept millimètres a entraîné une faible efficacité de sporulation. Le barreau d'agitation de sept millimètres dans une cavité a tendance à interagir avec un barreau d'agitation dans une cavité adjacente, empêchant une agitation correcte et une aération adéquate de la culture.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de faire sporuler efficacement des cellules de levure en culture liquide selon un format 96 puits. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en six jours, si elle est effectuée correctement. Cette méthode peut être utilisée pour cribler différents souches mutantes, plasmides ou inhibiteurs de petites molécules afin d'évaluer leur effet sur la méiose et la sporulation.Après son développement, cette technique a été utilisée pour étudier la régulation du cycle cellulaire méiotique et la manière dont la cytocinèse et la méiose sont couplées lors de la sporulation chez Saccharomyces cerevisiae.

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