Sporulation efficace de Saccharomyces cerevisiae Dans un 96 Multiwell Format

L’objectif global de ce protocole est de sporuler efficacement les levures bourgeonnantes dans un format à 96 puits. Bien que de nombreux criblages à grande échelle aient été réalisés sur les levures bourgeonnantes, les études à haut débit portant sur la méiose et la sporulation ont été limitées. La technique décrite dans cette vidéo présente l’avantage de sporuler la levure de manière efficace et rentable dans un format à 96 puits compatible avec le criblage à haut débit.

J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode parce que je voulais utiliser une banque de plasmides de deux microns en mosaïque afin de dépister les suppresseurs de copie élevés d’un mutant qui ne pouvait pas former de spores réfractaires. Initialement, mes efficacités de sporulation étaient médiocres dans le format à 96 puits. J’ai découvert que cela était dû à une aération inadéquate.

Commencez cette procédure en décongelant la souche de levure SK1 sur une plaque d’extrait de levure, de peptone, de glycérol ou de YPG. À l’aide d’un bâtonnet stérile, grattez une petite quantité de cellules du flacon de congélation contenant le stock de glycérol et étalez-le sur une plaque de YPG. Faites pousser la levure pendant 12 à 16 heures à 30 degrés Celsius.

Ensuite, striez la levure de la plaque YPG sur une plaque d’extrait de levure peptone dextrose, ou YPD, pour les colones simples. Faites pousser la levure sur la plaque YPD pendant 24 à 48 heures à 30 degrés Celsius. Après 24 à 48 heures de croissance sur un milieu solide YPD, commencer une culture YPD de 25 millilitres en utilisant une seule colonie de la plaque YPD.

Cultivez cette culture pendant la nuit dans un incubateur à 30 degrés Celsius à 220 tr/min jusqu’à ce que les cellules atteignent une OD600 de 4,0 à 7,0. Le lendemain, utilisez une quantité appropriée de cellules de la culture YPD pour commencer une culture de 125 millilitres dans de l’acétate de peptone d’extrait de levure, ou YPA, avec une OD600 de 0,1. Cultivez la culture dans un incubateur à 30 degrés Celsius à 220 tr/min jusqu’à ce que l’OD600 soit compris entre 1,3 et 1,5.

Transférez la culture dans des tubes à centrifuger et faites-la tourner à 1800X G dans une centrifugeuse de table pendant cinq minutes pour granuler les cellules. Lavez les cellules une fois avec un volume de 0,5 volume d’eau désionisée autoclave stérile. Tournez à nouveau et jetez l’eau.

Remettre les cellules en suspension dans un volume X de milieu de sporulation. Pour préparer des cellules de différents génotypes, des cellules provenant de stocks congelés décongelés dans une plaque multipuits de 96 sont d’abord transférées sur un milieu solide YPG. Allumez à la flamme un grenouille à 96 broches, puis refroidissez-le momentanément sur une assiette de milieu solide avant de le toucher aux colonies de levures.

Faites pousser la levure pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Le lendemain, transférez les cellules du milieu solide YPG sur le YPD ou un milieu solide sélectif, selon le génotype de la souche. YPD est utilisé dans cette démonstration.

Cultivez la levure à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies se forment pour chaque souche. Aliquote 1,2 millilitres de milieu liquide YPD dans chaque puits d’une plaque de puits de 96 profondeur. Transférez les cellules du milieu solide dans le milieu liquide.

Couvrez la plaque avec un couvercle en plastique à partir d’une plaque de Pétri rectangulaire et maintenez le couvercle en place à l’aide d’un morceau de ruban adhésif pour restreindre au minimum la circulation de l’air. Cultivez les cellules pendant la nuit dans un agitateur à 30 degrés Celsius à 220 tr/min. Le lendemain, centrifuger à 1800X G pendant cinq minutes.

Videz le média et ajoutez 500 microlitres de YPA dans chaque puits. Et remettre en suspension les cellules granulées. Couvrez la plaque avec un couvercle en plastique maintenu en place par du ruban adhésif.

Faites pousser les cellules pendant 15 heures dans un incubateur à 30 degrés Celsius à 220 tr/min. Pour assurer une aération adéquate pour une sporulation efficace, ajoutez dans chaque puits d’une plaque de 96 puits soit une perle de verre solide stérile de trois millimètres, soit une barre d’agitation magnétique stérile de cinq millimètres sur deux millimètres. Si toutes les cellules sont du même génotype, aliquat 500 microlitres de cellules plus du milieu dans chaque puits de la plaque à 96 plusieurs puits.

Couvrez la plaque avec un couvercle en plastique maintenu en place par du ruban adhésif. Si les cellules sont de génotypes différents, faites tourner les cellules qui sont dans YPA à 1800X G pendant cinq minutes et versez le milieu. Ajouter 500 microlitres de milieu de sporulation dans chaque puits.

Et remettre en suspension les cellules granulées dans le milieu de sporulation. Couvrez la plaque avec un couvercle en plastique maintenu en place par du ruban adhésif. Si vous utilisez des billes de verre, placez les échantillons dans un incubateur à agitation à 30 degrés Celsius et secouez à 220 tr/min pour la sporulation.

Si vous utilisez des barres d’agitation magnétiques, placez les échantillons sur une plaque d’agitation à l’intérieur d’un incubateur à 30 degrés Celsius pour la sporulation. La vitesse d’agitation exacte des barres magnétiques n’est pas très importante, tant que toutes les barres se déplacent énergiquement et que la culture est aérée. 36 heures plus tard, récupérer les échantillons pour suivre la progression par sporulation.

Prélever six microlitres de cellules de chaque culture sporulante et les ajouter à 24 microlitres de milieu de sporulation dans une plaque de lamelle de 96 puits. Laissez les cellules reposer pendant cinq minutes avant de les examiner à l’aide d’un microscope inversé. Une sporulation représentative de deux souches différentes est mise en évidence dans ces images de cellules visualisées à l’aide d’un objectif 63X sur un microscope inversé.

Des tétrades réfractiles, indiquées par les pointes de flèches, peuvent être observées dans la culture de type sauvage. Mais pas dans la culture contenant les cellules de suppression smk1 déficientes en sporulation. Des comparaisons ont été faites entre l’efficacité de la sporulation des cellules sporulées dans des plaques multipuits et celle des cellules sporulées à l’aide de plus grands volumes dans des flacons.

L’utilisation de plaques multipuits n’a pas atteint le rendement élevé couramment observé lors de l’utilisation du protocole plus typique de sporulation dans des flacons. La sporulation dans des plaques multipuits avec une aération appropriée peut atteindre des efficacités de sporulation suffisantes supérieures à 50 %, les meilleurs résultats étant obtenus à l’aide d’une barre d’agitation de cinq millimètres. Cependant, compte tenu du coût élevé des petites barres d’agitation, les efficacités obtenues à l’aide de billes de verre sont comparables.

Bien que les barres d’agitation de cinq millimètres et de sept millimètres s’insèrent dans le puits d’une plaque de 96 multipuits, l’utilisation d’une barre d’agitation de sept millimètres a entraîné une faible efficacité de la sporulation. La barre d’agitation de sept millimètres dans un puits a tendance à interagir avec une barre d’agitation dans un puits adjacent. Empêcher les barres de s’agiter correctement et fournir une aération adéquate à la culture.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sporuler efficacement des cellules de levure en culture liquide au format 96 puits. Une fois maîtrisé, ce processus peut être complété en six jours, s’il est fait correctement. Cette procédure peut être utilisée pour cribler différentes souches mutantes, plasmides ou inhibiteurs de petites molécules pour leur effet sur la méiose et la sporulation.

Après son développement, cette technique a été utilisée pour étudier la régulation du cycle cellulaire méiotique et comment la cytokinèse et la méiose sont couplées dans la sporulation chez Saccharomyces cerevisiae.