Name: Sporulation efficace de Saccharomyces cerevisiae Dans un 96 Multiwell Format (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Apprenez la sporulation efficace de Saccharomyces cerevisiae en format 96 puits pour le criblage à haut débit. Cette méthode optimise l'aération pour améliorer les rendements de sporulation en génétique.

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Ce travail a été soutenu par une subvention Joseph P. Healey de l&#39;Université du Massachusetts à Boston (LSH) et R15 GM86805 du NIH (LSH). SMP est supporté en partie par une Sanofi-Genzyme Fellowship à l&#39;Université du Massachusetts à Boston.

1. Préparation de sporulation Remarque:. Les milieux décrits dans ce protocole sont réalisés en utilisant des recettes et des méthodes standard 13,17 Le tableau 1 donne la formulation pour 1 L des différents médias utilisés dans ce protocole. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> bactopeptone </td><td style="width: 50px;"> Extrait de levure </td><td style="width: 50px;"> gélose Bacto </td><td style="width: 60px;"> Dextrose </td><td style="width: 70px;"> L&#39;acétate de potassium </td><td style="width: 60px;"> Glycérol </td><td style="width: 60px;"> ddH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> plaques GPJ </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml </td><td> 970 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> des boîtes de YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> liquide YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> liquide YPA </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> médias sporulation </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Formulations des médias Les montants sont donnés pour 1 L de médias. Spécificités sur les médiasles ingrédients peuvent être trouvés dans la table des matières. <ol><li> Si toutes les cellules sporulantes sera le même Génotype, suivez cette procédure: <ol><li> la souche de levure Thaw à utiliser sur un (YPGlycerol) plaque GPJ. Cultivez levure pour 12-16 heures à 30 ° C. Fait important, les cellules SK1 sont également prêts à sporuler, donc les souches SK1 ne doivent pas être laissés trop longtemps sur des plaques de GPJ, ou ils peuvent sporuler sur la plaque. Remarque: Une souche fraîchement décongelé cultivée sur YPG est préféré, que l&#39;utilisation du glycérol comme source de carbone nécessite la phosphorylation oxydative, et sélectionne ainsi les cellules qui ont l&#39;ADN mitochondrial fonctionnel. les cellules SK1 ont tendance à perdre de l&#39;ADN mitochondrial fonctionnel et devenir petites. L&#39;ADN mitochondrial fonctionnelle est nécessaire pour la sporulation. </li><li> Streak levure à partir de la plaque de GPJ sur un YPD (YPDextrose) plaque pour des colonies isolées. Cultiver la levure sur la plaque YPD 24-28 h à 30 ° C. </li><li> Après environ 36-48 h de la croissance sur YPD milieux solides, démarrer une culture YPD 25 ml en utilisant une seule coloniede la plaque YPD. Cultivez cette culture jusqu&#39;à ce que les cellules sont sur ​​DO 600 = 4,0 à 7,0. Effectuez cette étape à 30 ° C pendant la nuit dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute. </li><li> De la culture YPD, utiliser une quantité appropriée de cellules pour démarrer 1000 ml de YPA (YPAcetate) culture qui est DO 600 = 0,1 pour chaque besoin plaque à 96 puits dans la section 2. Cultiver la levure dans un incubateur agitateur à 30 ° C (agitation à 220 rpm) jusqu&#39;à ce que la DO600 de la culture est compris entre 1,3 et 1,5. Note: inoculer 100 ml de culture LPJ pour chaque plaque multipuits 96 à cribler dans la section 2. Par exemple, si le dépistage quatre 96 plaques multipuits, 400 ml de culture LPJ seront nécessaires. A partir de 10% du volume supplémentaire dans la culture LPJ est nécessaire pour protéger contre la perte de volume par évaporation. En règle générale, il faudra compter entre 12-16 h pour les cellules pour atteindre la DO appropriée 600; la durée peut varier en fonction du génotype de la souche de levure. LPJ est le média de présporulation. préculturedans de l&#39; acétate aide induire l&#39; expression des gènes (comme IME1) nécessaire pour efficace et synchrone sporulation 6. </li><li> Spin à 1.800 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min pour sédimenter les cellules cultivées dans LPJ. Laver les cellules 1x avec 0,5 volume d&#39;eau désionisée autoclavée stérile. Spin à nouveau, et jeter laver. Resuspendre les cellules dans les médias 1x volume de sporulation. Continuer à la section 2. </li></ol></li><li> Si l&#39; utilisation de cellules pour sporulation qui sont des génotypes différents, (c. -à- transformées avec des plasmides différents ou contenant différentes mutations, généralement obtenues et stockées sous forme de stocks congelés), des cellules de tableau des différents génotypes dans un format 96 multipuits. Ensuite, suivez cette procédure: <ol><li> Utilisez un 96 broches frogger stérile pour transférer des cellules à partir de stocks congelés décongelés dans 96 plaque (s) multipuits sur YPG milieux solides. Cultiver la levure pendant la nuit à 30 ° C. </li><li> Utilisation d&#39;un 96 broches frogger stérile, transférer les cellules de YPG milieux solides sur YPD milieux solides ou sélectiveun milieu solide ( par exemple, un milieu minimal synthétique dépourvu des acides aminés, si les cellules contiennent des plasmides qui nécessitent une sélection). Cultiver la levure à 30 ° C jusqu&#39;à ce que les colonies sont formées pour chaque souche, typiquement 1 jour sur YPD et 2 jours si des milieux sélectifs est nécessaire. </li><li> Aliquoter 1,2 ml de milieu liquide YPD ou des milieux liquides sélectifs dans chaque puits d&#39;une plaque multipuits 96 profondeur de 2 ml. Transfert des cellules à partir de supports solides dans des milieux liquides en utilisant un frogger, couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban, et de croître pendant une nuit dans 30 ° C shaker, agitation à 220 rpm. Remarque: Pour minimiser la contamination, des plaques de couverture en utilisant les couvercles en plastique à partir d&#39;une boîte de Pétri rectangulaire. Tenir les paupières en place au moyen d&#39;un morceau de ruban adhésif, de sorte que la circulation de l&#39;air est très peu limité. </li><li> plaques centrifuger à 1800 xg pendant 5 min, en utilisant un seau centrifuge oscillant avec des adaptateurs pour accueillir plaques à 96 puits. Décanter médias de cellules; ajouter 500 ul LPJ à chaque puits et resuspendre cellules sédimentées dans la LPJ. Couvertureavec couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. </li><li> Cultiver les cellules pendant 15 heures à 30 ° C dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute. Continuer à la section 2. </li></ol></li></ol> 2. Les cellules sporulantes dans un 96 Multiwell Format <ol><li> Ajouter un ou l&#39;autre de 3 mm perle de verre solide stérile ou un stériles 5 mm x 2 mm barre d&#39;agitation magnétique dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits avec 1,3 ml de puits. (Voir résultats représentatifs ci - dessous pour une discussion sur l&#39; opportunité d&#39;utiliser un cordon ou d&#39; une barre d&#39;agitation.) </li><li> Si toutes les cellules à cribler sont du même génotype, aller à 2.2.1. Si les cellules à cribler sont de différents génotypes, aller à 2.2.2. <ol><li> Prenez des cellules de l&#39;étape 1.1.5 et aliquote de 500 pi de cellules plus les médias dans chaque puits de la plaque multipuits 96. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3. </li><li> les cellules de spin qui sont LPJ de 1.2.4 à 1800 g pendant 5 min, en utilisant une centrifugeuse à godet oscillant avec des adaptateurs pour recevoir des plaques à 96 puits. verser def support de cellules. Ajouter 500 ul de milieu de sporulation dans chaque puits et les remettre en suspension les cellules sédimentées dans le milieu de sporulation. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3. </li></ol></li><li> Si vous utilisez une perle de verre, placer les échantillons dans un incubateur sous agitation à 30 ° C et agiter à 220 rpm pour la sporulation. Si vous utilisez une barre d&#39;agitation magnétique, placer les échantillons sur une plaque d&#39;agitation à l&#39;intérieur d&#39;un 30 ° C incubateur pour sporulation. Remarque: La vitesse d&#39;agitation exacte pour les barres d&#39;agitation magnétique est pas très important, aussi longtemps que toutes les barres se déplacent énergiquement et la culture est aéré. </li><li> Pour surveiller la progression à travers la sporulation, prélever des échantillons de la culture sporulée pour la visualisation, Ajouter 6 ul de cellules à partir des cultures sporulées à 24 pi de milieu de sporulation dans une plaque à 96 puits lamelle couvre-objet (1: 5 de dilution). Laisser les cellules se contenter de 5 minutes avant d&#39;examiner les cellules en utilisant un microscope inversé. Remarque: Dans les cellules SK1 de type sauvage, les spores matures compacts formeront par 36 heures après le transfert aux médias de sporulation. La progression à travers la sporulation peut être contrôlée par microscopie en utilisant des marqueurs fluorescents, comme un marqueur nucléaire (c. -à -HTB2 mCherry 18) pour examiner la méiose ou un marqueur de la membrane ProSpore (c. -à- G20 19) pour examiner la morphogenèse des spores. En variante, la formation de spores réfringents peut être vu à l&#39;aide de DIC Nomarski microscopie à partir d&#39;environ 12 heures après le transfert au milieu de sporulation. </li></ol>

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<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
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<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous présentons ici un protocole de sporulation SK1 levure dans un format de 96 multipuits. Aération est la clé pour la sporulation efficace, ce qui nécessite l&#39;utilisation soit d&#39;un barreau d&#39;agitation ou une perle de verre dans chaque puits. Lorsque les cellules sont sporulés dans une plaque multipuits 96 dans un incubateur à agitation sans soit une perle ou une barre d&#39;agitation, les cellules ne sporulation pas efficacement. Seule une petite augmentation de l&#39;efficacité de la sporulation est obser...

La sporulation chez la levure en herbe a été étudié pour donner un aperçu de nombreux aspects de la biologie, y compris le contrôle de la ségrégation des chromosomes lors de la méiose 1, les mécanismes de recombinaison génétique 2, le contrôle du développement par la cellule de signalisation 3, contrôle nutritionnel du développement 4, la transcription régulation du développement 5, et l&#39;examen de la formation de spores 6. La formation de spores comprend un événement de division cellulaire nouvelle impliquant la formation de nouveaux compartiments à l&#39; intérieur de la membrane de la cellule mère , suivie par le dépôt d&#39;une paroi protectrice 6 spores. Ces études qui examinent les cellules sporulantes profitent souvent de la souche de levure sporulation rapidement SK1, qui peut subir le processus de sporulation dans environ 24 heures de façon relativement efficace 7,8. Bien que l&#39; optimisation des conditions de sporulation de la levure bourgeonnante ont été décrits 13/09, ces expériencess examiné sporulation sur des supports solides ou dans les grandes cultures liquides à grande échelle où sporulation est effectuée en utilisant des tubes de culture ou flacons. Nous décrivons ici un procédé pour la sporulation de la levure dans un format de plaque multipuits 96. Nous constatons que, pour ce procédé, l&#39;aération est essentielle pour la sporulation synchrone et efficace, et ont mis au point des techniques pour assurer une sporulation suffisante d&#39;un format multi-puits de faible volume. Sporuler dans un format de plaque multipuits 96 permet de cellules devant être criblés en utilisant des techniques à haut débit et des réactifs optimisés pour un format de plaque multipuits, un tel criblage pour des suppresseurs de copies élevé en utilisant une bibliothèque de tuiles 14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1,3 ml DeepWell Plates ThermoScientific</td><td></td><td>260251</td><td>Utilisé pour la sporulation</td></tr><tr><td>Nunc 2,0 ml Plaques DeepWell</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Utilisé pour la croissance par présporulation, étape 1.2.3</td></tr><tr><td>Bille de verre de 3 mm</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Utilisé pour la sporulation</td></tr><tr><td>Barre d’agitation de 5 mm x 2 mm, paquet de 12</td><td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Utilisée pour la sporulation</td></tr><tr><td>96 bien frogger</td><td>V& P Scientific</td><td>VP407</td><td>nécessaire pour l’étape 1.2</td></tr><tr><td>copieur de bibliothèque</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381</td><td>nécessaire pour l’étape 1.2 ; à utiliser avec la</td></tr><tr><td>boîte de Pétri rectangulaire</td> frogger <td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>nécessaire pour l’étape 1.2</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD</td><td>212750</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>nécessaire pour les milieux</td></tr><tr><td>Plaque inférieure en verre noir à 96 puits</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>nécessaire pour l’étape 2.4</td></tr></tbody></table>

sporulation efficace de<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; dans un 96 multiwell format

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Pendant les périodes de stress nutritionnel, Saccharomyces cerevisiae subit une gamétogenèse, connue sous le nom de sporulation. Les cellules de levure diploïdes qui sont privées d’azote et de carbone initieront le processus de sporulation. Le processus de sporulation comprend une méiose suivie de la formation de spores, où les noyaux haploïdes sont emballés dans des spores résistantes à l’environnement. Nous avons développé des méthodes pour la sporulation efficace de levures bourgeonnantes dans 96 plaques multipuits, afin d’augmenter le débit de criblage des cellules de levure pour les phénotypes de sporulation. Ces méthodes sont compatibles avec le criblage avec des plasmides contenant des levures nécessitant une sélection nutritionnelle, lorsque des milieux minimaux appropriés sont utilisés, ou avec le criblage de levures avec des altérations génomiques, lorsqu’un régime de présporulation riche est utilisé. Nous constatons que pour cette méthode, l’aération pendant la sporulation est essentielle à la formation des spores, et nous avons mis au point des techniques pour assurer une aération suffisante qui sont compatibles avec le format de plaques multipuits 96. Bien que ces méthodes n’atteignent pas le niveau typique de sporulation de ~80 % qui peut être atteint dans des expériences basées sur des flacons de grand volume, ces méthodes permettront d’atteindre de manière fiable un niveau de sporulation d’environ 50 à 60 % dans des plaques multipuits de petit volume.

<html> Pour évaluer ce protocole, l&#39; efficacité de sporulation obtenus à partir de cellules sporulantes dans des plaques multipuits (comme décrit ci - dessus) ont été comparées à des cellules sporulées en utilisant des volumes plus importants dans des flacons (tableau 2). L&#39;utilisation de plaques multipuits n&#39;a pas atteint le rendement élevé vu quand sporulation dans des flacons, où ~ 80% d&#39;efficacité peut être régulièrement vu. Sporulation dans des plaque...

Ici, la sporulation de Saccharomyces cerevisiae est réalisée dans un format multipuits 96.

Sporulation efficace de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Dans un 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

L'objectif général de ce protocole est de réaliser efficacement la sporulation de levures bourgeonnantes dans un format 96 puits. Bien que de nombreux criblages à grande échelle aient été menés sur la levure bourgeonnante, les études à haut débit portant sur la méiose et la sporulation ont été limitées. La technique décrite dans cette vidéo présente l'avantage de permettre une sporulation efficace des levures de manière économique, dans un format 96 puits compatible avec le criblage à haut débit.J'ai eu l'idée de cette méthode parce que je souhaitais utiliser une banque de plasmides en mosaïque de deux microns afin de rechercher des suppresseurs à haut nombre de copies d'un mutant incapable de former des spores réfractiles. Initialement, mes rendements de sporulation étaient faibles en format 96 puits. J'ai constaté que cela était dû à une aération insuffisante.Commencez cette procédure en décongelant la souche de levure SK1 sur une plaque de YPG (extrait de levure, peptone, glycérol). À l’aide d’un bâtonnet stérile, prélève une petite quantité de cellules à partir du flacon congelé contenant la souche en glycérol et étale-la sur une plaque de YPG. Incubez la levure pendant 12 à 16

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Nous avons développé complètes, impartiales échelle du génome écrans à comprendre gène-médicament et les interactions gènes-environnement. Méthodes de dépistage de ces collections de mutants sont présentées.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

La méthode de Green Monster permet l'assemblage rapide de suppressions multiples marqués d'un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente verte. Cette méthode est basée sur la conduite des souches de levures par des cycles répétés de l'assortiment sexuelle des suppressions et basée sur la fluorescence d'enrichissement de cellules portant des délétions plus.

Le processus de monstre vert pour la génération de souches de levure portant la délétion de gènes multiples

Nous présentons un protocole détaillé pour construire et cribler des banques de mutants pour des campagnes d’évolution dirigée chez Saccharomyces cerevisiae.

Réalisé Evolution Méthode<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Library Création et dépistage

Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer le métabolisme respiratoire et fermentatif en ajustant la croissance exponentielle des Saccharomyces cerevisiae à l’équation de croissance exponentielle. Calcul des paramètres cinétiques permet le dépistage des influences de substances/composés sur la fermentation ou la respiration mitochondriale.

Saccharomyces cerevisiae Cinétique de croissance exponentielle en Culture pour analyser le métabolisme respiratoire et fermentatif

Ici, nous présentons l'imagerie à cellules vivantes qui est une méthode de microscopie non toxique qui permet aux chercheurs d'étudier le comportement des protéines et la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes de levure de fission pendant la mitose et la méiose.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Nous présentons un protocole pour la préparation de lamelles d’échantillons biologiques congelés par micro-usinage par faisceau d’ions cryo-focalisé pour des études structurelles à haute résolution de macromolécules in situ avec cryo-tomographie électronique. Le protocole présenté fournit des lignes directrices pour la préparation de lamelles de haute qualité avec une reproductibilité élevée pour la caractérisation structurelle des macromolécules à l’intérieur des Saccharomyces cerevisiae.

Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

Le test ACT1-CUP1, un test de croissance du cuivre, fournit une lecture rapide de l’épissage de l’ARN messager précurseur (pré-ARNm) et de l’impact des facteurs d’épissage mutant sur la fonction splicéosomale. Cette étude fournit un protocole et met en évidence la personnalisation possible pour répondre à la question d’épissage d’intérêt.

Les tests ACT1-CUP1 déterminent les sensibilités spécifiques au substrat des mutants splicéosomaux chez la levure bourgeonnante

Apprenez la sporulation efficace de Saccharomyces cerevisiae en format 96 puits pour le criblage à haut débit. Cette méthode optimise l'aération pour améliorer les rendements de sporulation en génétique.

Sporulation efficace de

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