Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les événements de trafic vésiculaire dans la voie endocytaire des cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du trafic vésiculaire, telles que la façon dont la mutation ou les changements dans l’expression des protéines affectent les taux et l’efficacité des événements de trafic. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier directement le trafic endocytaire et les cellules vivantes en mesurant l’intensité des protéines cargo marquées par fluorescence.

Après avoir préparé les solutions et les milieux conformément au protocole de texte, inoculez deux à trois colonies de cellules de levure dans cinq millilitres de milieu YNB, manquant de nutriments supplémentaires pour maintenir la sélection des plasmides. Cultivez les cultures à 30 degrés Celsius en secouant pendant 16 à 24 heures. Environ trois heures avant l’imagerie, mesurez la DO 600 de chaque culture de nuit.

Ensuite, préparez des dilutions de cinq millilitres à une DO 600 de 0,35 à 0,4 dans un milieu YNB, manquant de nutriments supplémentaires pour l’entretien du plasmide et cultivez à 30 degrés Celsius en secouant pendant trois heures. Pendant l’incubation, pré-équilibrez la chambre environnementale du microscope ou la platine chauffée à 30 degrés Celsius. Après avoir préparé un pot en verre à huit puits traité en boîte et une lame de chambre pour l’imagerie selon le protocole de texte, ajoutez 200 microlitres de milieu YNB manquant de nutriments supplémentaires pour la sélection du plasma dans chaque puits.

Lorsque les cultures sont prêtes, transférez un millilitre dans un tube de microfrigo et granulez les cellules à 8 000 tr/min pendant deux minutes. Retirez ensuite 975 microlitres de surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans le surnageant restant.

Ensuite, déposez 2,5 microlitres de suspension cellulaire au centre de chaque puits de la plaque à huit puits. Pipetez de haut en bas pour disperser les cellules et laissez-les se stabiliser pendant cinq à 10 minutes. Placez la lame de chambre sur un microscope à fluorescence inversée équilibré à 30 degrés Celsius.

Ensuite, utilisez un éclairage à champ vif pour localiser un champ de cellules. Ajoutez 50 microlitres de milieu YNB préchauffé contenant 100 microgrammes par millilitre de méthionine aux 200 microlitres de milieu dans le puits pour obtenir une concentration finale de méthionine de 20 microgrammes par millilitre. Laissez les cellules s’équilibrer pendant deux minutes avant de commencer l’imagerie.

Ensuite, immédiatement avant l’imagerie, ajustez le microscope sur le plan focal souhaité. Acquérez la GFP dans des images en fond clair ou DIC à des intervalles de 5 minutes pendant 45 à 60 minutes. Utilisation de paramètres d’acquisition identiques pour toutes les images d’une série chronologique.

Pour plus de détails, reportez-vous au protocole texte. Quantifiez l’intensité de fluorescence de cellules individuelles à chaque point temporel et exprimez les valeurs en pourcentage de l’intensité initiale de la première image. Après avoir exporté les images selon le protocole texte de l’image j, ouvrez les fichiers dans le menu Fichier à l’aide de l’option Ouvrir.

Utilisez l’image de fluorescence pour la quantification et l’image en fond clair ou DIC comme référence pour identifier l’emplacement des cellules. Excluez les cellules mortes présentes qui apparaissent plus foncées que les cellules vivantes lorsqu’elles sont observées par DIC et s’autofluorescencent sous le canal GFP. Pour les images avec un arrière-plan inégal dans le menu Processus, choisissez l’algorithme de soustraction d’arrière-plan et choisissez le paramètre par défaut.

Une fois les images acquises, il est important d’effectuer une soustraction d’arrière-plan avant de procéder à la procédure de quantification. Cette étape est particulièrement importante car le signal de fond pourrait autrement masquer ou atténuer les différences entre les échantillons. À l’aide de l’outil de sélection à main levée, tracez le contour d’une cellule en vous assurant d’inclure la cellule entière, mais aussi peu de surface que possible à l’extérieur de la cellule.

Ensuite, dans le menu Analyser, utilisez la fonction de définition des mesures pour mesurer la surface, la densité intégrée et la valeur de gris moyenne. Ouvrez le Gestionnaire de ROI en cliquant sur Analyser, puis sur Outils. Dans la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur le bouton Ajouter pour saisir la région en surbrillance en tant que nouveau retour sur investissement.

Répétez le plan et la prise de mesure pour les cellules restantes de l’image, à l’exclusion des cellules mortes ou des cellules qui touchent le bord de l’image. Enregistrez les retours sur investissement sélectionnés sous forme de fichier zip en cliquant sur le bouton de mesure qui affichera les valeurs mesurées dans une nouvelle fenêtre. Cliquez ensuite sur le bouton Plus et exportez toutes les mesures vers un tableur ou un logiciel d’analyse statistique.

Inoculer deux à trois colonies de cellules de levure et 0,5 millilitre de milieu YNB, manquant de nutriments supplémentaires pour maintenir la sélection des plasmides. Faites pousser des cellules sur un tambour à rouleaux à 30 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Ajoutez un millilitre de milieu YNB manquant de nutriments supplémentaires pour l’entretien des plasmides et cultivez pendant trois heures supplémentaires.

Ensuite, transférez un millilitre de cellules dans chacun des deux tubes à fond rond de cinq millilitres. Ajoutez ensuite 0,25 millilitre de milieu YNB Met dans le premier tube et 0,25 millilitre de milieu YNB contenant 100 microgrammes par millilitre de méthionine dans le deuxième tube pour une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre. Pour un grand nombre d’échantillons, échelonnez l’ajout de méthionine pour tenir compte du temps nécessaire à l’analyse des faits.

Notre cytomètre en flux peut mesurer jusqu’à 40 échantillons par passage. Nous ajoutons de la méthionine par lots. Huit échantillons toutes les cinq minutes.

Cela garantit que tous les échantillons sont mesurés entre 45 et 50 minutes après l’ajout de méthionine. Incuber les cellules pendant 45 minutes. Ensuite, analysez les cellules par cytométrie en flux, en sélectionnant la diffusion directe ou FS comme mesure de la taille de la cellule et cartographiez l’intensité d’une fluorescence fluide à partir d’un filtre FITC comme mesure de l’internalisation de la cargaison.

Pendant l’incubation de 45 minutes, utilisez les boutons coulissants pour ajuster la tension des canaux FS et FITC afin d’optimiser la détection en fonction de la gamme de tailles et de l’intensité de fluorescence des cellules de levure utilisées. Mesurez le FS et l’intensité de fluorescence pour 10 000 cellules de chaque condition. À l’aide du paramètre de débit élevé, générez un nuage de points de la FS en fonction de l’intensité de la fluorescence en cliquant sur Ajouter un graphique.

Sélectionnez ensuite FITC pour l’axe des x et FS pour l’axe des y et représentez 1000 points sur le graphique. À l’aide de la fonction de porte et de la condition Met de type sauvage, attribuez une porte verticale de sorte qu’environ 5 % des cellules les plus brillantes tombent à droite de la porte. Utilisez ce gate pour toutes les autres conditions de l’expérience.

Comme le montre ici, l’imagerie en accéléré des cellules a été réalisée à des intervalles de cinq minutes en l’absence ou en présence de méthionine pour surveiller l’internalisation de Mup1 marquée à la GFP ou au fluor et les changements de fluorescence. Comme prévu, la GFP et le fluor, Mup1, marqués au fluor, sont restés au niveau de la membrane plasmique en l’absence de méthionine. En revanche, les cellules imagées en présence de méthionine ont montré une déplétion progressive du signal fluorescent de la surface cellulaire compatible avec l’internalisation de la cargaison.

Cependant, la cinétique de fluorescence perdue en présence de méthionine était retardée dans les cellules GFP Mup1 par rapport aux cellules Mup1 pHlouurine. Ces diagrammes de dispersion comparent l’intensité de fluorescence de cellules de type sauvage ou de quatre cellules delta ENTH1 en présence ou en l’absence de méthionine après l’application d’une porte verticale. 4 % des cellules Met de type sauvage étaient contenues sur le côté droit de la porte correspondant aux cellules les plus brillantes de la population, tandis que 65 % des cellules de type sauvage non traitées étaient contenues dans la porte.

En revanche, les quatre cellules delta ENTH1 n’ont montré aucune différence dans la distribution des cellules brillantes par rapport aux cellules sombres, ce qui correspond à un défaut d’endocytose. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’échelonner les heures de début des expériences simultanées, afin que les données finales puissent être collectées après le même temps de traitement pour tous les échantillons.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que des criblages génétiques floraux, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les nouveaux facteurs qui contribuent au trafic vésiculaire. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du trafic vésiculaire pour explorer les aspects de l’attrition de l’endosome ainsi qu’une voie indépendante et acide de la clathrine récemment découverte chez la levure bourgeonnante. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les cargaisons de type Florent pour quantifier les événements endocytaires dans les cellules vivantes.