Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les événements de trafic vésiculaire dans la voie endocytaire de cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du trafic vésiculaire, telles que l'influence des mutations ou des modifications de l'expression protéique sur les taux et l'efficacité des événements de trafic. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre la quantification directe du trafic endocytaire dans des cellules vivantes, en mesurant l'intensité de protéines cargo marquées fluorescentes.

Après avoir préparé les solutions et les milieux selon le protocole décrit dans le texte, inoculer deux à trois colonies de cellules de levure dans cinq millilitres de milieu YNB, dépourvu de nutriments supplémentaires nécessaires au maintien de la sélection du plasmide. Faire croître les cultures à 30 degrés Celsius avec agitation pendant 16 à 24 heures. Environ trois heures avant l'acquisition des images, mesurer l'OD 600 de chaque culture d'ensemencement nocturne.

Préparez ensuite des dilutions de cinq millilitres à une DO 600 de 0,35 à 0,4 dans du milieu YNB, dépourvu de nutriments supplémentaires pour le maintien du plasmide, et incubez à 30 degrés Celsius sous agitation pendant trois heures. Pendant l'incubation, pré-équilibrez la chambre environnementale du microscope ou le plateau chauffant à 30 degrés Celsius. Après avoir préparé une lame à huit puits en verre traitée et une lame à chambre pour l'imagerie selon le protocole décrit dans le texte, ajoutez 200 microlitres de milieu YNB dépourvu de nutriments supplémentaires pour la sélection du plasma dans chaque puits.

Lorsque les cultures sont prêtes, transférez un millilitre dans un tube microfuge et faites tomber les cellules en pellet à 8 000 tr/min pendant deux minutes. Ensuite, retirez 975 microlitres du surnageant. Resuspendez le pellet cellulaire dans le surnageant restant.

Ensuite, déposez 2,5 microlitres de la suspension cellulaire au centre de chaque puits de la plaque à huit puits. Aspirez et expulsez plusieurs fois pour disperser les cellules et laissez les cellules se déposer pendant cinq à dix minutes. Placez la lamelle-chambre sur un microscope à fluorescence inversé équilibré à 30 degrés Celsius.

Ensuite, utilisez l'éclairage en champ clair pour localiser un champ de cellules. Ajoutez 50 microlitres de milieu YNB préalablement réchauffé contenant 100 microgrammes par millilitre de méthionine aux 200 microlitres de milieu présents dans le puits, afin d'obtenir une concentration finale de méthionine de 20 microgrammes par millilitre. Laissez les cellules s'équilibrer pendant deux minutes avant de commencer l'acquisition d'images.

Ensuite, juste avant l'acquisition d'images, régler le microscope sur le plan focal souhaité. Acquérir les images GFP en champ clair ou en contraste de phase (DIC) par intervalles de 5 minutes pendant 45 à 60 minutes. Utiliser des paramètres d'acquisition identiques pour toutes les images d'une même série temporelle.

Consulter le protocole écrit pour plus de détails. Quantifier l'intensité de fluorescence des cellules individuelles à chaque point temporel et exprimer les valeurs en pourcentage de l'intensité initiale de la première image. Après avoir exporté les images conformément au protocole écrit dans ImageJ, ouvrir les fichiers dans le menu Fichier à l'aide de l'option Ouvrir.

Utilisez l'image de fluorescence pour la quantification et l'image en champ clair ou en contraste de phase comme référence afin d'identifier l'emplacement des cellules. Excluez les cellules mortes présentes, qui apparaissent plus sombres que les cellules vivantes en contraste de phase et présentent une autofluorescence dans le canal GFP. Pour les images présentant un fond inégal, choisissez dans le menu Process l'algorithme de soustraction du fond et sélectionnez le paramètre par défaut.

Une fois les images acquises, il est important d'effectuer une soustraction du fond avant de procéder à la quantification. Cette étape est particulièrement importante car le signal de fond pourrait autrement masquer ou atténuer les différences entre les échantillons. À l’aide de l’outil de sélection manuelle, délimitez une cellule en vous assurant d’inclure toute la cellule tout en minimisant au maximum la zone située à l’extérieur de celle-ci.

Ensuite, dans le menu Analyze, utilisez la fonction set measurements pour mesurer la surface, la densité intégrée et la valeur moyenne de gris. Ouvrez le gestionnaire de ROI en cliquant sur Analyze, puis sur Tools. Dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, cliquez sur le bouton Add pour entrer la région surlignée comme un nouveau ROI.

Répétez le tracé du contour et la prise de mesures pour les cellules restantes sur l'image, en excluant les cellules mortes ou celles qui touchent le bord de l'image. Enregistrez les régions d'intérêt (ROIs) sélectionnées sous forme de fichier zip en cliquant sur le bouton mesurer, ce qui affichera les valeurs mesurées dans une nouvelle fenêtre. Cliquez ensuite sur le bouton « plus » et exportez toutes les mesures vers un tableur ou un logiciel d'analyse statistique.

Inoculer deux à trois colonies de cellules de levure et 0,5 millilitre de milieu YNB, ne contenant pas de nutriments supplémentaires nécessaires au maintien de la sélection du plasmide. Faire croître les cellules sur un rouleau tournant à 30 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Ajouter un millilitre de milieu YNB dépourvu de nutriments supplémentaires pour le maintien du plasmide et poursuivre la culture pendant trois heures supplémentaires.

Ensuite, transférez un millilitre de cellules dans chacun de deux tubes ronds de cinq millilitres. Ajoutez ensuite 0,25 millilitre de milieu YNB Met dans le premier tube et 0,25 millilitre de milieu YNB contenant 100 microgrammes par millilitre de méthionine dans le second tube, afin d'obtenir une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre. Pour un grand nombre d'échantillons, décalez l'ajout de méthionine afin de laisser suffisamment de temps pour l'analyse des faits.

Notre cytomètre en flux peut mesurer jusqu'à 40 échantillons par cycle. Nous ajoutons la méthionine par lots. Huit échantillons toutes les cinq minutes.

Cela garantit que tous les échantillons sont mesurés entre 45 et 50 minutes après l'ajout de méthionine. Incuber les cellules pendant 45 minutes. Ensuite, analyser les cellules par cytométrie en flux, en sélectionnant la diffusion directe ou FS comme mesure de la taille cellulaire, et en traçant l'intensité de fluorescence issue d'un filtre FITC comme mesure de l'internalisation du cargo.

Pendant l'incubation de 45 minutes, utilisez les boutons coulissants pour ajuster la tension des canaux FS et FITC afin d'optimiser la détection en fonction de la gamme de taille et de l'intensité de fluorescence des cellules de levure utilisées. Mesurez la FS et l'intensité de fluorescence pour 10 000 cellules provenant de chaque condition. En utilisant le débit élevé, générez un graphique de dispersion de la FS en fonction de l'intensité de fluorescence en cliquant sur « ajouter un graphique ».

Ensuite, sélectionnez FITC pour l'axe des abscisses et FS pour l'axe des ordonnées, puis représentez graphiquement 1000 points. À l'aide de la fonction de sélection et de la condition témoin Met de type sauvage, définissez une limite verticale de manière à ce qu'environ 5 % des cellules les plus brillantes se situent à droite de cette limite. Utilisez ce réglage de sélection pour toutes les autres conditions de l'expérience.

Comme illustré ici, une imagerie en prise de vue différée des cellules a été réalisée à des intervalles de cinq minutes en l'absence ou en présence de méthionine afin de suivre l'internalisation de Mup1 marqué par GFP ou fluorine et les variations de fluorescence. Comme prévu, le signal fluorescent de Mup1 marqué par GFP ou fluorine est resté localisé à la membrane plasmique en l'absence de méthionine. En revanche, chez les cellules observées en présence de méthionine, on a noté une diminution progressive du signal fluorescent à la surface cellulaire, en accord avec l'internalisation du cargo.

Cependant, la cinétique de perte de fluorescence en présence de méthionine était retardée dans les cellules Mup1 GFP par rapport aux cellules pHlourin Mup1. Ces diagrammes de dispersion comparent l'intensité de fluorescence de cellules de type sauvage ou de quatre cellules delta ENTH1 en présence ou en absence de méthionine, après application d'une porte verticale. 4 % des cellules Met de type sauvage se trouvaient du côté droit de la porte, correspondant aux cellules les plus brillantes de la population, tandis que 65 % des cellules de type sauvage non traitées étaient comprises dans la porte.

En revanche, les quatre cellules delta ENTH1 n'ont montré aucune différence dans la répartition des cellules brillantes par rapport aux cellules faibles, ce qui est compatible avec un défaut d'endocytose. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'échelonner les temps de démarrage lorsqu'on effectue des expériences simultanées, afin que les données finales puissent être recueillies après une durée de traitement identique pour tous les échantillons.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, telles que les criblages génétiques floraux, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quels nouveaux facteurs contribuent au trafic vésiculaire. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du trafic vésiculaire d'explorer des aspects liés à l'attrition des endosomes ainsi qu'une voie nouvellement découverte, indépendante de la clathrine et acide, chez la levure en bourgeonnement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser des cargaisons de type florent pour quantifier les événements endocytiques dans des cellules vivantes.