Name: Un capteur à base de polyaniline dacides nucléiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez la détection sans marquage des acides nucléiques par polyaniline. Cette méthode économique et sensible distingue les différences d'un seul nucléotide sans manipulation enzymatique, offrant des applications prometteuses en diagnostic.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

1. traitables PANI Synthèse <ol><li> Dissoudre l&#39;aniline (1 ml, 11 mmol) complètement dans 60 ml de chloroforme dans 250 ml de ballon à fond rond. Agiter à 600 rpm pendant 5 min et laisser refroidir à 0-5 ° C avec de la glace. Cela prend habituellement 15 à 20 minutes (figure 2A). </li><li> Ajouter dodécylbenzène sulfonate de sodium (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) à la solution d&#39;aniline dans un ballon à fond rond, sous agitation à 600 tours par minute. </li><li> Dissoudre le persulfate d&#39;ammonium (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) dans 20 ml d&#39;eau et ajouter tout cela goutte à goutte sur 30 min pour éviter la surchauffe de la réaction. </li><li> Effectuer la réaction à 0-5 ° C pendant 24 heures, et lui permettre d&#39;atteindre la température ambiante pendant 24 h. </li><li> Observer le mélange réactionnel d&#39; abord tourner blanc laiteux après 15 min, puis brun foncé au bout de 2 h, et enfin au vert foncé après 24 h (figure 2B-F). </li><li> Filtrer la solution PANI-NaDBS avec un entonnoir de Büchner. Mélanger avec 80 ml de chloroforme et 120 ml d&#39;eau en tanta séparation entonnoir (figure 2G). </li><li> Incuber la solution pendant 24 heures à la température ambiante et recueillir le PANI vert foncé de l&#39;entonnoir de séparation, ne laissant pas réagi NaDBS et APS dans le surnageant aqueux. </li></ol> 2. PANI-sonde de mélange et Irradiation UV <ol><li> Diluer solution PANI 10x avec du chloroforme-eau (1: 3 v / v) et mélanger 200 pi de PANI dilué avec 6,4 pmol d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN de la sonde par doux balancement pendant 15 min dans un tube de microcentrifugation. </li><li> Irradier la solution de PANI-ADN avec 1 200 pJ / cm 2 d&#39;un agent de réticulation UV pendant 2 min. Il est essentiel que l&#39;exposition aux UV est limitée au montant indiqué. Une exposition prolongée aux UV compromet le changement de fluorescence dans PANI, probablement due à une reticulation covalente de PANI et l&#39;ADN. </li><li> complexes à pellets par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 minutes et laver avec du tampon phosphate salin (PBS). Pellet à nouveau, et remettre en suspension dans du PBS. </li></ol> 3. Hybridization de PANI-sonde <ol><li> Ajouter 8 ul de 100 uM d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN complémentaire ou cibler des acides nucléiques à 200 ul de complexes PANI-sonde. </li><li> Effectuer l&#39;hybridation en basculant mélange de solution pendant 15 min à 40 ° C. </li><li> Pellet les complexes de PANI par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 min. Laver avec du PBS et re-suspension dans l&#39;eau. </li></ol> 4. Emission Steady Mesure État Fluorescence <ol><li> Ajouter PANI de différents traitements dans une microplaque à 96 puits et mesurer la fluorescence d&#39;émission dans la gamme 270-850 nm par excitation à 250 nm. Un pic d&#39;émission pour PANI devrait être observée autour de 500 nm. </li></ol> 5. Fluorescence Microscopy Mesure de hybridée Duplex <ol><li> Baisse manteau PANI sur une lamelle de verre borosilicate et sec à 40 ° C pendant 48 heures. </li><li> Ajouter la sonde (8 pi de 100 uM) sur un film PANI séché et irradier avec une lumière UV (1200 pJ / cm 2 </sup&gt;) pendant 2 min. </li><li> Lavez le film PANI-sonde avec du PBS et sèche à 40 ° C pendant 48 heures. </li><li> Effectuer l&#39;hybridation pour 15 minutes en ajoutant des acides nucléiques cibles. Cela pourrait être un échantillon biologique ou d&#39;un oligonucléotide cible de commande (8 ul de 100 uM). Suivi avec un lavage PBS. </li><li> Obtenir les images fluorescentes à 40X, avec un filtre à long passe de 500 nm. </li></ol>

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<li>Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+DNA+Biosensor+Based+on+Conducting+Polyaniline+nanotube+Array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array.</a> Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).</li>
<li>Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemically+fabricated+polyaniline+nanowire-modified+electrode+for+voltammetric+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eletrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization.</a> Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).</li>
</ol>

Les travaux ont été soutenus par le Collège des sciences et de la technologie de l’Université du Mississippi du Sud, le Collège des sciences et de la technologie du Mississippi et le programme INBRE du Mississippi (numéro de prix P204M103476 de l’Institut national des sciences médicales générales).

Un capteur à base PANI-des acides nucléiques nécessite la solubilisation du polymère dans l&#39;eau afin d&#39;interagir avec l&#39;ADN et l&#39;ARN. La dispersion de PANI dans l&#39; eau est effectuée en utilisant des agents tensioactifs, formant des micelles comme indiqué précédemment 8. Outre les NaDBS utilisées ici d&#39; autres tensio - actifs anioniques tels que l&#39; ester dodécylique d&#39;acide 4-sulfophtalique, les tensioactifs non ioniques tels que l&#39; éthoxylate de nonylphénol, ou des agents t...

Les polymères conjugués offrent de nombreuses options pour les capteurs moléculaires. Cela inclut les réponses de fluorescence, électroniques et colorimétriques1. De nombreux efforts ont été déployés pour incorporer des polymères conjugués dans les capteurs d’acide nucléique. Cependant, la plupart des systèmes nécessitent une détection secondaire, ce qui limite les options de détection2. Récemment, nous avons signalé une plate-forme de capteurs à base de polymère conjugué construite sur de la polyaniline (PANI) qui exploite les propriétés de ce polymère, créant ainsi un système sans marquage3. Le PANI est un polymère électro-actif largement conjugué avec des propriétés telles que la fluorescence et la résistance qui conviennent à la mesure des systèmes biologiques4. Les excitons à l’intérieur de la structure ne sont pas localisés, ce qui entraîne la mobilité de la charge positive entre les sous-unités monomères. Cela fournit un échafaudage flexible de charges positives qui peuvent interagir avec le squelette chargé négativement de l’ADN5,6. Il est important de noter que l’ADN attaché électrostatiquement est orienté de telle sorte que les bases azotées peuvent participer à l’appariement des bases. L’association avec l’ADN modifie les propriétés électroniques du PANI, un effet qui peut être renforcé par l’irradiation UV (Figure 1)3. Grâce à ce système, des oligonucléotides complémentaires aux acides nucléiques cibles peuvent être immobilisés sur les PANI. De nombreuses études ont démontré qu’à l’hybridation, les oligonucléotides adsorbés électrostatiquement se dissocient des PANI ou d’autres matrices cationiques en raison des changements de conformation causés par le passage à une structure d’ADN double brin3,5,7.
Dans un système de capteurs où la fixation de la sonde module les propriétés des polymères conjugués, les événements d’hybridation peuvent être transduits sans marquage ni modification enzymatique des sondes ou des acides nucléiques cibles. Les polymères conjugués offrent une grande flexibilité dans les méthodes de détection, dont la fluorescence. Grâce à la surveillance de la fluorescence PANI, des concentrations d’acides nucléiques cibles aussi faibles que 10-11 M (10 pM) peuvent être détectées3. La détection est rapide, se produisant dans les 15 minutes suivant l’hybridation, et spécifique lorsqu’un seul décalage dans une molécule cible peut être différencié3. 
La fabrication des capteurs PANI est simple. Il est possible de générer des PANI de haut poids moléculaire qui sont bien dispersés dans l’eau à l’aide de procédures de synthèse standard impliquant un monomère d’aniline, un tensioactif et l’ajout contrôlé d’un oxydant. Le rendement peut être très élevé et l’oxydant n’ayant pas réagi éliminé par lavage à l’eau, ce qui garantit l’absence de croissance supplémentaire de PANI. L’association PANI-sonde se produit spontanément lors du mélange, et la formation complexe est renforcée par une légère exposition aux UV. L’hybridation peut être effectuée immédiatement, et les changements de fluorescence PANI peuvent être analysés après une courte incubation. La simplicité de cette technologie la rend très accessible à de nombreux laboratoires.

<table><tbody><tr><td>Aniline&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A7401-500°</td><td>ACS, liquide, réfrigéré</td></tr><tr><td>Peroxydisulfate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A682-500° A682-500 ;</td><td>ACS, cristallin</td></tr><tr><td>Dodécylbenzène sulfonate de sodium</td><td>Pfaltz & Bauer&nbsp ;</td><td>D56340&nbsp ;</td><td>95 % solide</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>MCX 10601&nbsp ;</td><td>liquide</td></tr><tr><td>amorces d’ADN</td><td>opéron MWG</td><td>n/a</td><td>séquence d’ADN personnalisée ~20&nbsp ; </td></tr><tr><td>microplaque bps&nbsp ;</td><td>USA Scientific&nbsp ;</td><td>1402-9800&nbsp ;</td><td>96 pu, le polypropylène car il ne réagit pas au chloroforme</td></tr><tr><td>Film adhésif pour microplaques</td><td>USA Scientific&nbsp ;</td><td>2920-0000&nbsp ;</td><td>Réduit la contamination de puits à puits, le déversement d’échantillons et l’évaporation</td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12-544-D&nbsp ;</td><td>Revêtement PANI sur verre de protection irradié aux UV</td></tr><tr><td>réticulant UV&nbsp ;</td><td>UVP&nbsp ;</td><td>HL-2000°</td><td>Énergie : X100 &mu ; J/cm2 ; Temps : 2 min</td></tr><tr><td>Four d’hybridation VWR</td><td></td><td>01014705 T</td><td>Température : 400&nbsp ; &#176 ; C; avec balancement pendant 15 min</td></tr><tr><td>Appareil en verre&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fiole à trois cols à fond rond pour la réaction ; entonnoir de goutte, bouchons, condenseur, entonnoir de séparation</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td>Leica IMC S80</td><td>Grossissement 20X ; Pseudo couleur 536 nm ; Exposition 86 ms ; Gain 1,0x ; Lecteurs de microplaques Gamma 1.6</td></tr><tr><td></td><td>Dispositifs moléculaires&nbsp ;</td><td>Référence 89429-536</td><td></td></tr></tbody></table>

un capteur à base de polyaniline d&#39;acides nucléiques

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

La détection des acides nucléiques est au centre des technologies de diagnostic utilisées en recherche et en clinique. Les approches standard utilisées dans ces technologies reposent sur la modification enzymatique qui peut introduire des biais et des artefacts. Un élément essentiel des plates-formes de détection de prochaine génération sera la détection moléculaire directe, évitant ainsi le besoin d’amplification ou de marquages. Les nanomatériaux avancés peuvent fournir les modalités chimiques appropriées pour réaliser des capteurs sans marquage. Les polymères conjugués sont idéaux pour la détection biologique, possédant des propriétés compatibles avec les biomolécules et présentant une grande sensibilité aux changements environnementaux localisés. Dans cet article, une méthode de détection des acides nucléiques est présentée à l’aide du polymère électroconducteur polyaniline. De simples oligonucléotides « sondes » d’ADN complémentaires aux acides nucléiques cibles sont fixés électrostatiquement au polymère, créant ainsi un système de capteurs capable de différencier les différences de nucléotides uniques dans les molécules cibles. En dehors de la nature spécifique et impartiale de cette technologie, elle est très rentable.

Figure 2A capture la configuration de réaction au début du processus de polymérisation, à savoir, avant l&#39; addition APS. La formation de micelles est l&#39;étape initiale dans la réaction de synthèse processus PANI se produit à l&#39;interface micellaire. La figure 2B montre une solution laiteuse après 5 min. 30 minutes après l&#39; APS est ajouté la réaction se transforme en une couleur légèrement brune. Figure 2C représent...

Les acides nucléiques sont des analytes courants pour l’évaluation des systèmes biologiques ; cependant, le biais de manipulation enzymatique peut être préoccupant. Ici, une méthode est décrite pour la détection sans marquage des acides nucléiques à l’aide de la polyaniline. Cette technologie de capteur sensible et rentable permet de distinguer les différences de nucléotides entre les molécules.

Un capteur à base de polyaniline d&#39;acides nucléiques

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser du polyaniline dispersé dans l'eau, pouvant être utilisé pour la détection d'acides nucléiques sans marquage. Cette technique constitue une méthode économique pour la détection d'acides nucléiques. Les laboratoires qui l'adopteront la trouveront facile, robuste et sensible.Le principal avantage de la technique est qu'elle est sans étiquetage et peut être utilisée pour détecter directement les ARN et les ADN sans nécessiter de manipulation enzymatique. Cette technique présente un potentiel pour de nouvelles technologies diagnostiques et, puisqu'elle n'utilise pas d'étiquette, elle peut être employée pour traiter des échantillons de patients avec une manipulation minimale. Une démonstration visuelle aidera à démystifier le capteur.Cette plateforme regroupe la science des polymères et la biologie, qui peuvent sembler très exotiques mais sont en réalité extrêmement faciles à mettre en œuvre. Dissoudre complètement l'aniline dans 60 ml de chloroforme dans un ballon à fond rond de 250 ml. Après avoir agité à 600 tr/min pendant cinq minutes, refroidir à une température comprise entre 0 et 5 degrés Celsius à l’aide de glace.Cela prend généralement de 15 à 20 minutes. Ensuite, ajouter du dodécylbenzènesulfonate de sodium à la solution d'aniline dans un ballon à fond rond sous agitation à 600 tr/min. Dissoudre le persulfate d'ammonium dans 20 ml d'eau et l'ajouter goutte à goutte pendant 30 minutes afin d'éviter une surchauffe de la réaction.Réaliser la réaction à zéro à cinq degrés Celsius pendant 24 heures. Observer que le mélange réactionnel devient initialement laiteux-blanc après 15 minutes, puis brun foncé après deux heures, et enfin vert foncé après 24 heures. Puis laisser atteindre la température ambiante pendant 24 heures supplémentaires.Filtrer la solution de dodécylbenzènesulfonate de sodium de PANI à l’aide d’un entonnoir de Büchner. Mélanger le filtrat avec 80 ml de chloroforme et 120 ml d’eau dans une ampoule à décanter. Incuber la solution pendant 24 heures à température ambiante, puis récupérer la PANI de couleur vert foncé depuis l’ampoule à décanter, en laissant le dodécylbenzènesulfonate de sodium et l’APS non réagis dans la phase aqueuse surnageante.Diluer la solution de PANI 10 fois avec de l’eau chloroforme, puis mélanger 200 microlitres de PANI dilué avec 6,4 micromoles d’oligonucléotides d’ADN de sonde en agitant doucement pendant 15 minutes dans un tube de microcentrifugeuse. Exposer la solution d’ADN-PANI à 1200 microjoules par centimètre carré d’UV dans un appareil d’hybridation croisée pendant deux minutes. Il est essentiel que l’exposition aux UV soit limitée à la quantité indiquée.Une exposition prolongée aux UV compromet le changement de fluorescence dans le PANI, probablement en raison d'une réticulation covalente entre le PANI et l'ADN. Former des complexes en pelotant par centrifugation à 17 000 x g pendant six minutes, puis laver avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Après une deuxième centrifugation, resuspendre dans du PBS.Ajouter huit microlitres d'oligonucléotides d'ADN complémentaire ou d'acides nucléiques cibles à une concentration de 100 micromolaire à 200 microlitres de complexes de sondes PANI. Réaliser l'hybridation en agitant doucement le mélange pendant 15 minutes à 40 degrés Celsius. Après avoir centrifugé les complexes PANI à 17 000 x g pendant six minutes pour former un culot, les laver avec du PBS et les resuspendre dans de l'eau.Ajouter le PANI provenant de différents traitements dans une plaque microplate à 96 puits et mesurer la fluorescence d'émission dans la gamme de 270 à 850 nanomètres par excitation à 250 nanomètres. Un pic d'émission pour le PANI doit être observé vers 500 nanomètres. Pour effectuer la mesure en microscopie de fluorescence du duplex hybridé, déposer une couche de PANI sur un coverslip en verre borosilicaté et sécher à 40 degrés Celsius pendant 48 heures.Ajouter huit microlitres de sonde à 100 micromolaire sur un film de PANI sec, puis irradier avec une lumière UV pendant deux minutes. Après l'irradiation, laver le film de sonde de PANI avec du PBS et sécher à 40 degrés Celsius pendant 48 heures. Réaliser l'hybridation pendant 15 minutes en ajoutant les acides nucléiques cibles.Cela peut être un échantillon biologique ou un oligonucléotide cible contrôlé. Rincer par un lavage au PBS. Acquérir les images fluorescentes avec un objectif de 40 x et un filtre passe-long de 500 nanomètres.On observe ici l'interaction électrostatique entre le PANI et les sondes d'ADN, renforcée par une irradiation UV. L'hybridation de l'acide nucléique cible déclenche la formation d'un duplex, modifiant la conformation structurale, ce qui entraîne la dissociation de la sonde cible de la surface du PANI. Cette figure illustre la variation de la fluorescence du PANI en l'absence ou en présence de la sonde, dans un milieu en solution ainsi que sous forme de revêtement solide.L'augmentation de la fluorescence est due au flux d'électrons en provenance de l'ADN chargé négativement, ce qui accroît la densité électronique du polymère. Lors de l'hybridation avec des oligonucléotides cibles complémentaires, les sondes se détachent, entraînant la restauration de la fluorescence de base. En revanche, l'hybridation avec des oligonucléotides cibles présentant une seule erreur d'appariement ne conduit pas à cette restauration de la fluorescence de base.La principale nouveauté de cette technique réside dans l'utilisation d'UV doux pour une interaction précise, ce qui permet effectivement de distinguer les interactions non spécifiques et faibles. Une fois maîtrisée, cette technique peut prendre jusqu'à deux heures, hors temps d'incubation et temps de séchage des revêtements. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler que l'ADN se dissout dans l'eau et que le thé acide modifie effectivement les propriétés électroniques du PANI.Après avoir visionné cette vidéo, les spectateurs devraient bien comprendre comment synthétiser la polyaniline dispersée dans l'eau et utiliser ses propriétés fluorescentes pour détecter les acides nucléiques. Ils seront capables d'immobiliser des ADN sondes et de réaliser l'hybridation afin de détecter les cibles. Lors de la manipulation du monomère, il est important de se rappeler que cette synthèse est dangereuse et doit être effectuée sous hotte avec des équipements de protection tels que des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire.

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Méthodologie synthétique pour asymétrique Ferrocene dérivés Systems Bio-conjugués via solide méthodologie à base de résine de phase

Nous décrivons les étapes clés de la biodétection à l’aide de transistors à effet de champ en nanofils de polysilicium, y compris la préparation du dispositif et l’immobilisation et la confirmation d’une sonde moléculaire d’ADN à la surface du nanofil, ainsi que les conditions de détection de l’ADN.

Préparation de la Silicon Nanowire à effet de champ Transistor pour chimiques et les biocapteurs Applications

Nous présentons un protocole pour l’ingénierie de la phase corona de nanotubes de carbone fluorescents à paroi unique (SWNT) dans le proche infrarouge en utilisant des polymères amphiphiles et de l’ADN pour développer des capteurs pour des cibles moléculaires sans éléments de reconnaissance connus.

Reconnaissance moléculaire Ingénierie avec Polymères Bio-mimétiques sur simple Walled Carbon Nanotubes

Dans ce travail, nous présentons une nouvelle méthode pour étudier les interactions de protéine-protéine à l’aide d’un biocapteur conductimétrique basé sur la technologie de β-lactamase hybride. Cette méthode repose sur la libération de protons par hydrolyse des β-lactames.

L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

Un protocole pour le développement d’un Biocapteur électrochimique d’ADN comportant une électrode de carbone acide-stabilisé, or de nanoparticules modifiés, sérigraphié de polylactique pour détecter les Vibrio parahaemolyticus est présenté.

Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Ce protocole décrit la fabrication d’une cassette de petite, prêt à l’emploi qui peut être appliquée pour la détection visuelle de plusieurs acides nucléiques lors d’un test unique, qui est facile à utiliser. Dans cette approche, une gamme capillaire a été utilisée pour multiplexe et très efficace de détection des cibles de l’OGM.

Détection visuelle de plusieurs acides nucléiques dans une gamme capillaire

Nous rapportons ici le protocole pour la fabrication d’un capteur de pH micro graphène Nafion-enduit, polyaniline fonctionnalisés, électrochimiquement réduit l’oxyde chemiresistive. Ce capteur de pH micro axée sur la chemiresistor, à l’état solide peut détecter des changements de pH en temps réel au cours d’un processus de fermentation de Lactococcus lactis .

Fabrication d’un enduit Nafion, réduit le graphène oxyde/Polyaniline Chemiresistive capteur de pH de moniteur en temps réel au cours de la Fermentation microbienne

Ici, nous décrivons un protocole pour créer des nanostructures inorganiques discrètes et précises sur des substrats utilisant des formes d'origami d'ADN comme modèles de guidage. La méthode est démontrée par la création d'antennes en forme de noeud papillon en or plasmonique sur un substrat transparent (saphir).

ADN Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

Découvrez la détection sans marquage des acides nucléiques par polyaniline. Cette méthode économique et sensible distingue les différences d'un seul nucléotide sans manipulation enzymatique, offrant des applications prometteuses en diagnostic.

Un capteur à base de polyaniline d'acides nucléiques

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