Name: Un capteur à base de polyaniline dacides nucléiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez la détection sans marquage des acides nucléiques par polyaniline. Cette méthode économique et sensible distingue les différences d'un seul nucléotide sans manipulation enzymatique, offrant des applications prometteuses en diagnostic.

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1. traitables PANI Synthèse <ol><li> Dissoudre l&#39;aniline (1 ml, 11 mmol) complètement dans 60 ml de chloroforme dans 250 ml de ballon à fond rond. Agiter à 600 rpm pendant 5 min et laisser refroidir à 0-5 ° C avec de la glace. Cela prend habituellement 15 à 20 minutes (figure 2A). </li><li> Ajouter dodécylbenzène sulfonate de sodium (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) à la solution d&#39;aniline dans un ballon à fond rond, sous agitation à 600 tours par minute. </li><li> Dissoudre le persulfate d&#39;ammonium (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) dans 20 ml d&#39;eau et ajouter tout cela goutte à goutte sur 30 min pour éviter la surchauffe de la réaction. </li><li> Effectuer la réaction à 0-5 ° C pendant 24 heures, et lui permettre d&#39;atteindre la température ambiante pendant 24 h. </li><li> Observer le mélange réactionnel d&#39; abord tourner blanc laiteux après 15 min, puis brun foncé au bout de 2 h, et enfin au vert foncé après 24 h (figure 2B-F). </li><li> Filtrer la solution PANI-NaDBS avec un entonnoir de Büchner. Mélanger avec 80 ml de chloroforme et 120 ml d&#39;eau en tanta séparation entonnoir (figure 2G). </li><li> Incuber la solution pendant 24 heures à la température ambiante et recueillir le PANI vert foncé de l&#39;entonnoir de séparation, ne laissant pas réagi NaDBS et APS dans le surnageant aqueux. </li></ol> 2. PANI-sonde de mélange et Irradiation UV <ol><li> Diluer solution PANI 10x avec du chloroforme-eau (1: 3 v / v) et mélanger 200 pi de PANI dilué avec 6,4 pmol d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN de la sonde par doux balancement pendant 15 min dans un tube de microcentrifugation. </li><li> Irradier la solution de PANI-ADN avec 1 200 pJ / cm 2 d&#39;un agent de réticulation UV pendant 2 min. Il est essentiel que l&#39;exposition aux UV est limitée au montant indiqué. Une exposition prolongée aux UV compromet le changement de fluorescence dans PANI, probablement due à une reticulation covalente de PANI et l&#39;ADN. </li><li> complexes à pellets par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 minutes et laver avec du tampon phosphate salin (PBS). Pellet à nouveau, et remettre en suspension dans du PBS. </li></ol> 3. Hybridization de PANI-sonde <ol><li> Ajouter 8 ul de 100 uM d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN complémentaire ou cibler des acides nucléiques à 200 ul de complexes PANI-sonde. </li><li> Effectuer l&#39;hybridation en basculant mélange de solution pendant 15 min à 40 ° C. </li><li> Pellet les complexes de PANI par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 min. Laver avec du PBS et re-suspension dans l&#39;eau. </li></ol> 4. Emission Steady Mesure État Fluorescence <ol><li> Ajouter PANI de différents traitements dans une microplaque à 96 puits et mesurer la fluorescence d&#39;émission dans la gamme 270-850 nm par excitation à 250 nm. Un pic d&#39;émission pour PANI devrait être observée autour de 500 nm. </li></ol> 5. Fluorescence Microscopy Mesure de hybridée Duplex <ol><li> Baisse manteau PANI sur une lamelle de verre borosilicate et sec à 40 ° C pendant 48 heures. </li><li> Ajouter la sonde (8 pi de 100 uM) sur un film PANI séché et irradier avec une lumière UV (1200 pJ / cm 2 </sup&gt;) pendant 2 min. </li><li> Lavez le film PANI-sonde avec du PBS et sèche à 40 ° C pendant 48 heures. </li><li> Effectuer l&#39;hybridation pour 15 minutes en ajoutant des acides nucléiques cibles. Cela pourrait être un échantillon biologique ou d&#39;un oligonucléotide cible de commande (8 ul de 100 uM). Suivi avec un lavage PBS. </li><li> Obtenir les images fluorescentes à 40X, avec un filtre à long passe de 500 nm. </li></ol>

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<li>Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemically+fabricated+polyaniline+nanowire-modified+electrode+for+voltammetric+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eletrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization.</a> Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).</li>
</ol>

Les travaux ont été soutenus par le Collège des sciences et de la technologie de l’Université du Mississippi du Sud, le Collège des sciences et de la technologie du Mississippi et le programme INBRE du Mississippi (numéro de prix P204M103476 de l’Institut national des sciences médicales générales).

Un capteur à base PANI-des acides nucléiques nécessite la solubilisation du polymère dans l&#39;eau afin d&#39;interagir avec l&#39;ADN et l&#39;ARN. La dispersion de PANI dans l&#39; eau est effectuée en utilisant des agents tensioactifs, formant des micelles comme indiqué précédemment 8. Outre les NaDBS utilisées ici d&#39; autres tensio - actifs anioniques tels que l&#39; ester dodécylique d&#39;acide 4-sulfophtalique, les tensioactifs non ioniques tels que l&#39; éthoxylate de nonylphénol, ou des agents t...

Les polymères conjugués offrent de nombreuses options pour les capteurs moléculaires. Cela inclut les réponses de fluorescence, électroniques et colorimétriques1. De nombreux efforts ont été déployés pour incorporer des polymères conjugués dans les capteurs d’acide nucléique. Cependant, la plupart des systèmes nécessitent une détection secondaire, ce qui limite les options de détection2. Récemment, nous avons signalé une plate-forme de capteurs à base de polymère conjugué construite sur de la polyaniline (PANI) qui exploite les propriétés de ce polymère, créant ainsi un système sans marquage3. Le PANI est un polymère électro-actif largement conjugué avec des propriétés telles que la fluorescence et la résistance qui conviennent à la mesure des systèmes biologiques4. Les excitons à l’intérieur de la structure ne sont pas localisés, ce qui entraîne la mobilité de la charge positive entre les sous-unités monomères. Cela fournit un échafaudage flexible de charges positives qui peuvent interagir avec le squelette chargé négativement de l’ADN5,6. Il est important de noter que l’ADN attaché électrostatiquement est orienté de telle sorte que les bases azotées peuvent participer à l’appariement des bases. L’association avec l’ADN modifie les propriétés électroniques du PANI, un effet qui peut être renforcé par l’irradiation UV (Figure 1)3. Grâce à ce système, des oligonucléotides complémentaires aux acides nucléiques cibles peuvent être immobilisés sur les PANI. De nombreuses études ont démontré qu’à l’hybridation, les oligonucléotides adsorbés électrostatiquement se dissocient des PANI ou d’autres matrices cationiques en raison des changements de conformation causés par le passage à une structure d’ADN double brin3,5,7.
Dans un système de capteurs où la fixation de la sonde module les propriétés des polymères conjugués, les événements d’hybridation peuvent être transduits sans marquage ni modification enzymatique des sondes ou des acides nucléiques cibles. Les polymères conjugués offrent une grande flexibilité dans les méthodes de détection, dont la fluorescence. Grâce à la surveillance de la fluorescence PANI, des concentrations d’acides nucléiques cibles aussi faibles que 10-11 M (10 pM) peuvent être détectées3. La détection est rapide, se produisant dans les 15 minutes suivant l’hybridation, et spécifique lorsqu’un seul décalage dans une molécule cible peut être différencié3. 
La fabrication des capteurs PANI est simple. Il est possible de générer des PANI de haut poids moléculaire qui sont bien dispersés dans l’eau à l’aide de procédures de synthèse standard impliquant un monomère d’aniline, un tensioactif et l’ajout contrôlé d’un oxydant. Le rendement peut être très élevé et l’oxydant n’ayant pas réagi éliminé par lavage à l’eau, ce qui garantit l’absence de croissance supplémentaire de PANI. L’association PANI-sonde se produit spontanément lors du mélange, et la formation complexe est renforcée par une légère exposition aux UV. L’hybridation peut être effectuée immédiatement, et les changements de fluorescence PANI peuvent être analysés après une courte incubation. La simplicité de cette technologie la rend très accessible à de nombreux laboratoires.

<table><tbody><tr><td>Aniline&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A7401-500°</td><td>ACS, liquide, réfrigéré</td></tr><tr><td>Peroxydisulfate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A682-500° A682-500 ;</td><td>ACS, cristallin</td></tr><tr><td>Dodécylbenzène sulfonate de sodium</td><td>Pfaltz & Bauer&nbsp ;</td><td>D56340&nbsp ;</td><td>95 % solide</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>MCX 10601&nbsp ;</td><td>liquide</td></tr><tr><td>amorces d’ADN</td><td>opéron MWG</td><td>n/a</td><td>séquence d’ADN personnalisée ~20&nbsp ; </td></tr><tr><td>microplaque bps&nbsp ;</td><td>USA Scientific&nbsp ;</td><td>1402-9800&nbsp ;</td><td>96 pu, le polypropylène car il ne réagit pas au chloroforme</td></tr><tr><td>Film adhésif pour microplaques</td><td>USA Scientific&nbsp ;</td><td>2920-0000&nbsp ;</td><td>Réduit la contamination de puits à puits, le déversement d’échantillons et l’évaporation</td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12-544-D&nbsp ;</td><td>Revêtement PANI sur verre de protection irradié aux UV</td></tr><tr><td>réticulant UV&nbsp ;</td><td>UVP&nbsp ;</td><td>HL-2000°</td><td>Énergie : X100 &mu ; J/cm2 ; Temps : 2 min</td></tr><tr><td>Four d’hybridation VWR</td><td></td><td>01014705 T</td><td>Température : 400&nbsp ; &#176 ; C; avec balancement pendant 15 min</td></tr><tr><td>Appareil en verre&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fiole à trois cols à fond rond pour la réaction ; entonnoir de goutte, bouchons, condenseur, entonnoir de séparation</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td>Leica IMC S80</td><td>Grossissement 20X ; Pseudo couleur 536 nm ; Exposition 86 ms ; Gain 1,0x ; Lecteurs de microplaques Gamma 1.6</td></tr><tr><td></td><td>Dispositifs moléculaires&nbsp ;</td><td>Référence 89429-536</td><td></td></tr></tbody></table>

un capteur à base de polyaniline d&#39;acides nucléiques

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

La détection des acides nucléiques est au centre des technologies de diagnostic utilisées en recherche et en clinique. Les approches standard utilisées dans ces technologies reposent sur la modification enzymatique qui peut introduire des biais et des artefacts. Un élément essentiel des plates-formes de détection de prochaine génération sera la détection moléculaire directe, évitant ainsi le besoin d’amplification ou de marquages. Les nanomatériaux avancés peuvent fournir les modalités chimiques appropriées pour réaliser des capteurs sans marquage. Les polymères conjugués sont idéaux pour la détection biologique, possédant des propriétés compatibles avec les biomolécules et présentant une grande sensibilité aux changements environnementaux localisés. Dans cet article, une méthode de détection des acides nucléiques est présentée à l’aide du polymère électroconducteur polyaniline. De simples oligonucléotides « sondes » d’ADN complémentaires aux acides nucléiques cibles sont fixés électrostatiquement au polymère, créant ainsi un système de capteurs capable de différencier les différences de nucléotides uniques dans les molécules cibles. En dehors de la nature spécifique et impartiale de cette technologie, elle est très rentable.

Figure 2A capture la configuration de réaction au début du processus de polymérisation, à savoir, avant l&#39; addition APS. La formation de micelles est l&#39;étape initiale dans la réaction de synthèse processus PANI se produit à l&#39;interface micellaire. La figure 2B montre une solution laiteuse après 5 min. 30 minutes après l&#39; APS est ajouté la réaction se transforme en une couleur légèrement brune. Figure 2C représent...

Les acides nucléiques sont des analytes courants pour l’évaluation des systèmes biologiques ; cependant, le biais de manipulation enzymatique peut être préoccupant. Ici, une méthode est décrite pour la détection sans marquage des acides nucléiques à l’aide de la polyaniline. Cette technologie de capteur sensible et rentable permet de distinguer les différences de nucléotides entre les molécules.

Un capteur à base de polyaniline d&#39;acides nucléiques

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser du polyaniline dispersé dans l'eau, pouvant être utilisé pour la détection d'acides nucléiques sans marquage. Cette technique constitue une méthode économique pour la détection d'acides nucléiques. Les laboratoires qui l'adopteront la trouveront facile, robuste et sensible.Le principal avantage de la technique est qu'elle est sans étiquetage et peut être utilisée pour détecter directement les ARN et les ADN sans nécessiter de manipulation enzymatique. Cette technique présente un potentiel pour de nouvelles technologies diagnostiques et, puisqu'elle n'utilise pas d'étiquette, elle peut être employée pour traiter des échantillons de patients avec une manipulation minimale. Une démonstration visuelle aidera à démystifier le capteur.Cette plateforme regroupe la science des polymères et la biologie, qui peuvent sembler très exotiques mais sont en réalité extrêmement faciles à mettre en œuvre. Dissoudre complètement l'aniline dans 60 ml de chloroforme dans un ballon à fond rond de 250 ml. Après avoir agité à 600 tr/min pendant cinq minutes, refroidir à une température comprise entre 0 et 5 degrés Celsius à l’aide de glace.Cela pren

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La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

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