Un capteur à base de polyaniline d'acides nucléiques

L’objectif global de cette procédure est de synthétiser de la polyaniline dispersée dans l’eau qui pourrait être utilisée pour détecter les acides nucléiques sans marquage. Cette technique est une méthode rentable pour détecter les acides nucléiques. Les laboratoires qui l’adoptent le trouveront facile, robuste et sensible.

Le principal avantage de la technique est qu’elle est sans marquage et qu’elle peut être utilisée pour détecter directement les ARN et les ADN sans avoir besoin de manipulation enzymatique. Cette technique a un potentiel pour de nouvelles technologies de diagnostic et, comme elle n’utilise pas d’étiquette, elle peut être utilisée pour traiter des échantillons de patients avec peu de manipulation. Une démonstration visuelle aidera à démystifier le capteur.

Cette plate-forme comprend la science et la biologie des polymères, qui semblent très exotiques mais sont en fait extraordinairement faciles à mettre en œuvre. Dissoudre complètement l’aniline dans 60 ml de chloroforme dans une fiole à fond rond de 250 ml. Après avoir agité à 600 tr/min pendant cinq minutes, laissez refroidir à zéro à cinq degrés Celsius avec de la glace.

Cela prend généralement 15 à 20 minutes. Ensuite, ajoutez du dodécylbenzènesulfonate de sodium à la solution d’aniline dans une fiole à fond rond en agitant à 600 tr/min. Dissoudre le persulfate d’ammonium dans 20 ml d’eau et l’ajouter goutte à goutte pendant 30 minutes pour éviter de surchauffer la réaction.

Effectuez la réaction à zéro à cinq degrés Celsius pendant 24 heures. Observez le mélange réactionnel devenir d’abord blanc laiteux après 15 minutes, puis brun foncé après deux heures et enfin vert foncé après 24 heures. Ensuite, laissez-le atteindre la température ambiante pendant encore 24 heures.

Filtrez la solution de dodécylbenzènesulfonate de sodium PANI à l’aide d’un entonnoir de Buchner. Mélangez le filtrat avec 80 ml de chloroforme et 120 ml d’eau dans un entonnoir de séparation. Incuber la solution pendant 24 heures à température ambiante, puis recueillir le PANI vert foncé de l’entonnoir de séparation, en laissant le dodécylbenzènesulfonate de sodium et l’APS n’ayant pas réagi dans le surnageant aqueux.

Diluer la solution PANI 10 X avec de l’eau chloroforme, puis mélanger 200 microlitres de PANI dilué avec 6,4 micromoles d’oligonucléotides d’ADN de sonde en le balançant doucement pendant 15 minutes dans un tube à microfuges. Irradiez la solution d’ADN PANI avec 1200 microjoules par centimètre carré d’UV dans un réticulant pendant deux minutes. Il est essentiel que l’exposition aux UV soit limitée à la quantité indiquée.

Une exposition prolongée aux UV compromet le changement de fluorescence du PANI, probablement en raison d’une fuite croisée covalente du PANI et de l’ADN. Complexes de granulés par centrifugation à 17 000 x g pendant six minutes et lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Après avoir granulé une deuxième fois, remettre en suspension dans PBS.

Ajoutez huit microlitres d’oligonucléotides d’ADN complémentaires de 100 micromolers ou d’acides nucléiques cibles à 200 microlitres de complexes de sondes PANI. Effectuez l’hybridation en secouant le mélange de solution pendant 15 minutes à 40 degrés Celsius. Après avoir granulé les complexes PANI par centrifugation à 17 000 x g pendant six minutes, laver avec du PBS et remettre en suspension dans l’eau.

Ajoutez des PANI de différents traitements dans une microplaque de 96 puits et mesurez la fluorescence d’émission dans la gamme de 270 à 850 nanomètres par excitation à 250 nanomètres. Un pic d’émission pour PANI devrait être observé autour de 500 nanomètres. Pour effectuer une mesure par microscopie à fluorescence du duplex hyberdisé, appliquez une couche de dépôt PANI sur une lamelle en verre borosilicaté et séchez-la à 40 degrés Celsius pendant 48 heures.

Ajoutez huit microlitres de sonde de 100 micromolers sur un film PANI séché, puis irradiez-le avec de la lumière UV pendant deux minutes. Après le rayonnement, lavez le film de la sonde PANI avec du PBS et séchez-le à 40 degrés Celsius pendant 48 heures. Effectuez l’hybridation pendant 15 minutes en ajoutant des acides nucléiques cibles.

Il peut s’agir d’un échantillon biologique ou d’un oligonucléotide cible contrôlé. Poursuivez avec un lavage PBS. Obtenez les images fluorescentes à un grossissement de 40 x avec un filtre passe-long de 500 nanomètres.

On voit ici l’interaction électrostatique des sondes PANI et ADN renforcée par l’irradiation UV. L’hybridation de l’acide nucléique cible déclenche la formation duplex, modifiant la confirmation structurelle, ce qui entraîne la dissociation de la cible de la sonde de la surface PANI. Cette figure montre le changement de fluorescence PANI en l’absence ou la présence de la sonde, à la fois en solution et en milieu de revêtement solide.

L’augmentation de la fluorescence est due au flux d’électrons de l’ADN chargé négativement, augmentant la densité électronique du polymère. Lors de l’hybridation d’oligonucléotides cibles complémentaires, les sondes se détachent, conduisant à la restauration de la fluorescence du basilic. À l’inverse, l’hybridation avec des oligonucléotides cibles uniques non appariés n’aboutit pas à cette restauration de la fluorescence du basilic.

La principale nouveauté de cette technique est qu’elle utilise des UV doux pour une interaction exacte, ce qui l’aide en fait à distinguer les interactions non spécifiques et lumineuses. Une fois maîtrisée, cette technique pouvait prendre jusqu’à deux heures sans compter le temps des sens et le temps de séchage des revêtements. En essayant cette procédure, il est important de se rappeler que l’ADN se dissout dans l’eau et que le thé acide modifie en fait la propriété électronique du PANI.

Après avoir regardé cette vidéo, les téléspectateurs devraient avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser la polyaniline dispersée dans l’eau et d’utiliser ses propriétés fluorescentes pour détecter les acides nucléiques. Ils seront capables d’immobiliser les ADN des sondes et d’effectuer des hybridations pour détecter des cibles. En travaillant avec le monomère, il est important de se rappeler que cette synthèse est dangereuse et doit être effectuée dans une cagoule avec des équipements de protection comme des lunettes de sécurité, des gants et des blouses de laboratoire.