Name: Isolement et activation de murins Lymphocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Apprenez à purifier des lymphocytes murins avec des microbilles magnétiques anti-CD43 pour étudier leurs fonctions immunologiques in vitro et in vivo. Cette méthode permet d'analyser rapidement les capacités fonctionnelles des cellules avec un minimum de stress.

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L&#39;étude est soutenue par le Ministère de l&#39;Education, Singapour (ACRF Tier1-RG40 / 13 et Tier2-MOE2013-T2-2-038). Le manuscrit a été édité par Amy Sullivan de Obrizus Communications.

Toutes les souris sont élevées et maintenues dans des conditions exemptes d&#39;organismes pathogènes spécifiques et tous les protocoles de souris sont menées en conformité avec les directives du Comité soin et l&#39;utilisation des animaux institutionnels. 1. Préparation des tampons et réactifs <ol><li> Préparer toutes les Roswell Park Memorial Institute (RPMI) moyenne (10% de sérum inactivé par la chaleur de fœtus bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, de la pénicilline (100 UI / ml) / streptomycine (100 ug / ml), 55 uM de 2-mercaptoéthanol ). </li><li> Préparer 20x solution saline équilibrée (BSS) Stock 1 et 2 Stock, séparément. <ol><li> Préparer 20x BSS stock 1 (111 mM dextrose, phosphate de potassium 8,8 mM, 26,7 mM phosphate disodique dans 1 litre d&#39;eau stérile) et ajouter 40 ml 0,5% Phénol Red 20x BSS stock 1 avant ajustement de volume final. Filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um avant de les stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer 20x BSS stock 2 (25,8 mM de chlorure de calcium dihydraté, 107 mM de chlorure de potassium, ch 2,73 M de sodiumLoride, 19,6 mM de chlorure de magnésium hexahydraté, 16,6 mM de sulfate de magnésium dans 1 litre d&#39;eau stérile). Filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um avant de les stocker à 4 ° C. </li><li> Pour préparer 1x BSS pour une utilisation expérimentale, diluer 50 ml BSS stock 1 et 50 ml BSS stock 2, séparément, dans 400 ml d&#39;eau stérile chacun. Combiner les deux solutions diluées, ajuster le pH à 7, et ajouter 20 ml de FBS (2%). Top à 1 L avec de l&#39;eau stérile et filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um. REMARQUE: Les solutions de stock BSS doivent être préparés séparément, car le mélange des stocks BSS concentrées directement pourrait entraîner des précipitations. </li></ol></li><li> Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer <ol><li> Pour préparer le tampon de lyse RBC, mélanger 9 parties de chlorure stock ammonium (155 mM de chlorure d&#39;ammonium dans l&#39;eau stérile) à 1 partie disponible Tris-base (130 mM de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane dans l&#39;eau stérile, pH 7,65) avant utilisation. NOTE: Magasin de solutions mères stériles de chlorure d&#39;ammonium et Tris-base à 4 ° C. Préparer la lyse buffer frais pour assurer une lyse efficace des globules rouges. </li></ol></li></ol> 2. Génération de Lymphocytes Suspension de Spleen ou les ganglions lymphatiques NOTE: Il est important de préparer tous les réactifs et le matériel requis pour l&#39;expérience avant l&#39;euthanasie de la souris et de générer des suspensions de cellules isolées de lymphocytes le plus tôt possible pour maintenir les viabilités cellulaires élevées. <ol><li> Euthanasier souris expérimentales par dislocation cervicale ou CO 2 asphyxie. NOTE: A partir de cette étape en avant, toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées de manière aseptique. </li><li> Trempez la totalité de la souris dans 70% d&#39;éthanol avant de faire des incisions. Retirer la rate et les ganglions lymphatiques aseptique 8, et les placer dans 15 ml tubes séparés contenant 5 ml glacée RPMI / FBS (RPMI avec 2% de FBS) ou BSS / FBS (de l&#39; étape 1.2.3). NOTE: Depuis BSS empêche efficacement la lyse RBC, utilisez RPMI pour la préparation de la suspension de cellules spléniques et passer à BSS AFTElyse r RBC. </li><li> Pour générer une suspension de cellules isolées à partir de ganglions lymphatiques spléniques ou, placer l&#39;organe (s) entre deux morceaux de stériles 100 um cellule crépine maille dans une boîte de Pétri contenant 2 ml glacé RPMI / FBS ou BSS / FBS. En utilisant le piston d&#39;une seringue de 1 ml, écrasez l&#39;organe (s) jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait été déchiré en morceaux très fins. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et laver le filtre cellulaire en filet avec de la glace à froid RPMI / FBS ou BSS / FBS. Recueillir la suspension cellulaire restante, ajouter dans le même tube de 15 ml, et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. NOTE: Re-suspendre les cellules granulées en tapotant le tube avec les doigts avant d&#39;ajouter RBC tampon de lyse ou moyenne dans les étapes suivantes. </li><li> Préparer la température ambiante tampon de lyse (RT) RBC pendant la centrifugation de la suspension cellulaire (voir l&#39;étape 1.3.). Après la granulation des cellules et élimination du surnageant, remettre en suspension les cellules avec 1 ml de tampon de lyse RBC pour 10 8 cellules. Incubate la réaction de lyse à température ambiante pendant 3-4 min. </li><li> Arrêtez lyse RBC avec 14 ml glacée BSS / FBS et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. </li></ol> 3. Purification de B et cellules T <ol><li> La purification des cellules B <ol><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Re-suspendre jusqu&#39;à 10 8 cellules spléniques dans 300 ul BSS / FBS et ajouter 50 ul anti-CD43 microbilles magnétiques 9,10. Pour éliminer les cellules mortes, ajouter 30 pi de billes magnétiques Annexin V. Faire incuber la suspension de cellules dans un réfrigérateur C à 4 ° C pendant 30 min. </li></ol></li><li> Purification des cellules T <ol><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Remettre en suspension jusqu&#39;à 10 8 cellules non-T , l&#39; anticorps de déplétion des cellules cocktail (anticorps biotinylés contre CD19, B220, Gr-1, le TCR γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 et CD4 ou CD8 en fonction de la population cellulaire cible être purifié), dilué à 1: 200 dans 200 ul de BSS / FBS 4,5. Faire incuber la suspension de cellules dans un4 ° C réfrigérateur pendant 15 min. </li><li> Après incubation, ajouter 10 ml BSS / FBS pour laver les cellules et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 165 ul BSS / FBS avec 30 ul microbilles de streptavidine et 15 pi de billes magnétiques Annexin V. Faire incuber la suspension de cellules dans un réfrigérateur C à 4 ° C pendant 30 min. REMARQUE: Pour assurer même l&#39;étiquetage avec les microbilles magnétiques, incuber les cellules avec des microbilles pendant 15 min, puis mélanger doucement la suspension cellulaire en tapotant le tube de 15 ml et incuber encore 15 minutes lors de l&#39;étape 3.1.1. ou 3.2.2. </li></ol></li><li> Préparation de la colonne de séparation pour cellulaire Purification <ol><li> Préparer une colonne de séparation utilisé pendant l&#39;étiquetage de microbilles des cellules (étape 3.1.1. Ou 3.2.2.). Préchauffer BSS (sans FBS) à température ambiante et utiliser 2 ml pour laver et équilibrer la colonne aseptique. Après équilibration avec BSS, lavé la colonne ne doit pas être autorisé à sécher. NOTE: Nous utilisons les LS cOLONNE au lieu de la colonne de LD recommandée en raison de sa réutilisation (voir étape 3.4.). </li><li> Après marquage avec les billes magnétiques, ajouter 14 ml BSS / FBS pour laver les cellules et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1-3 ml RT BSS. </li><li> Fixer une aiguille 21 G stérile à la pointe de la colonne afin de réduire le débit au cours du processus de purification. Charger la suspension cellulaire sur la colonne équilibrée et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées. REMARQUE: Évitez d&#39;introduire des bulles dans la colonne pendant le chargement. </li><li> Laver la colonne une fois avec 1 ml de BSS / FBS et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées. Recharger la colonne avec de l&#39;écoulement à travers encore une fois. Recueillir l&#39;écoulement à travers le deuxième après le chargement dans le même tube de 15 ml. </li><li> Laver la colonne 3 fois avec 1 ml de BSS / FBS et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées. Par la suite, ajouter 5 ml BSS / FBS à the colonne, et avec un piston, rincer les cellules marquées magnétiquement hors de la colonne dans un nouveau tube de 15 ml. </li><li> Vérifier la pureté des cellules recueillies par cytométrie de flux en utilisant des anticorps qui se lient à des antigènes de surface de B ou des lymphocytes T purifiés 4,5. </li></ol></li><li> Réutiliser la colonne de séparation NOTE: La colonne LS peut être réutilisé jusqu&#39;à 4 fois sans affecter l&#39;efficacité de purification. <ol><li> Laver la colonne 3 fois avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS) et 3 fois avec 5 ml d&#39;eau distillée à partir du haut à l&#39;aide du piston. </li><li> Laver la colonne avec 5 ml 70% d&#39;éthanol et sécher la colonne extensive en utilisant une prise d&#39;air pour éviter l&#39;accumulation de rouille dans la colonne. </li><li> Pour préparer une colonne LS utilisé pour une expérience de purification séparée, laver la colonne de bas en haut avec 5 ml 70% d&#39;éthanol en utilisant l&#39;adaptateur de seringue. Ensuite, laver la colonne de bas en haut à deux reprises avec 5 ml de PBS stérile, puis 5 ml de PBS, une fois dans la partie supérieure de la colonne. Ajouter 2ml RT BSS pour équilibrer la colonne, puis procéder au chargement de la colonne avec des cellules marquées. </li></ol></li></ol> 4. CFSE Étiquetage et Stimulation REMARQUE: Les cellules purifiées peuvent être soumises à divers essais in vitro et in vivo , des essais fonctionnels. Ici, nous utilisons des cellules T purifiées afin de déterminer la capacité des véhicules blindés 5 de stimulation des lymphocytes T. <ol><li> solution de pré-marquage chaud (0,1% de FBS dans du PBS) à 37 ° C avant chargement CFSE. REMARQUE: L&#39;utilisation d&#39;un faible pourcentage de FBS dans du PBS réduit la mort cellulaire pendant le chargement CFSE et minimise la perte de cellules lors de la centrifugation. Cependant, trop de FBS peuvent interférer avec CFSE chargement. </li><li> Laver les cellules purifiées deux fois avec une solution d&#39;étiquetage, puis remis en suspension à 2 x 10 7 cellules / ml dans une solution d&#39;étiquetage préchauffé dans un tube de 15 ml. </li><li> Préparer 10 solution de CFSE uM (dilution 1: 500 de 5 mM CFSE solution mère) dans une solution d&#39;étiquetage préchauffé. solution CFSE devraitêtre fraîchement préparé chaque fois pour réaliser l&#39;étiquetage optimal. </li><li> Pour charger les cellules avec CFSE, ajouter la suspension cellulaire 1 partie à 1 partie 10 solution uM de CFSE dans un tube de 15 ml et incuber dans l&#39;obscurité pendant 10 min à 37 ° C. Une concentration finale de 5 pM de CFSE est utilisé pour marquer 1 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Inverser le tube toutes les 2 min pour assurer un mélange homogène de cellules CFSE pendant le chargement. </li><li> Pour arrêter la réaction, ajouter plusieurs volumes de milieu RPMI complet glacée et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Après avoir réussi à CFSE chargement, le culot cellulaire apparaît jaunâtre. </li><li> Wash CFSE cellules chargé une fois de plus avec un milieu RPMI complet glacée et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C avant d&#39; utiliser pour la culture in vitro ou in vivo la stimulation. </li></ol> 5. stimulation in vitro <ol><li> Préparer une solution 2x stock de stimuli (2x stimuli stock solution) immédiatement avant l&#39;utilisation de telle sorte que 100 pl de 2x solution stimuli de stock peut être ajouté à 100 pi de cellules à un volume final de 200 pi par puits dans une plaque à 96 puits. </li><li> Si une plaque revêtue de stimuli (IgM ou CD40 pour des cellules B ou CD3 et CD28 pour les lymphocytes T) est nécessaire, on dilue les stimuli dans du PBS et de pré-enduire la plaque de culture à 4 ° C jusqu&#39;au lendemain. En variante, la plaque de culture peut être revêtu à 37 ° C pendant 1 heure, le jour de l&#39;expérience. Laver la plaque revêtue à deux reprises avec du PBS (Ne pas laisser sécher la plaque à tout moment). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Pour les cellules B </td><td></td></tr><tr><td> Stimuli </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> F (ab &#39;) 2 de chèvre anti-IgM de souris </td><td> 0,6 à 2,4 pg / ml </td></tr><tr><td> Anti-souris CD40 mAb </td><td> 0,5 à 2 pg / ml </td></tr><tr><td> recombinantsouris IL-4 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> lipopolysaccharide </td><td rowspan="2"> 0,1 à 10 pg / ml </td></tr><tr><td> (LPS) de E. coli sérotype 055: B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Pour les lymphocytes T </td><td></td></tr><tr><td> Stimuli </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (coated plate) </td><td> 2 à 10 pg / ml </td></tr><tr><td> (50 ul / puits pour le revêtement) </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 (coated plate) </td><td> 2 pg / ml </td></tr><tr><td> IL-2 recombinante </td><td> 40 U / ml </td></tr><tr><td> PDBu (ester de phorbol) </td><td> 5-50 ng / ml </td></tr><tr><td> A23187 (Calcium ionophore) </td><td> 250 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Concentration de stimuli utilisés pour stimuler les lymphocytes en culture in vitro.<ol start="3"><li> Pour les cellules B CFSE marqués, re-suspension à 3 x 10 6 cellules / ml dans un milieu RPMI complet et de la culture en triple exemplaire , avec 3 x 10 5 cellules / puits dans 96 puits de plaques à fond plat pour 72 h. </li><li> Pour les cellules T CFSE marqués, re-suspension à 0,5-3 x 10 6 cellules / ml dans un milieu RPMI complet et culture en triple avec 0,5-3 x 10 5 cellules / puits dans 96 puits de plaques à fond rond pour 48 ou 72 heures . </li></ol> 6. La stimulation in vivo <ol><li> Pour la stimulation in vivo, le transfert de manière adoptive 4 x 10 6 cellules T marquées au CFSE par souris ( par voie intraveineuse (iv) dans 200 ul de PBS) dans chaque souris receveuse MHC assorti. NOTE: Dans ce protocole, les cellules T CFSE-marquées peuvent être transférées en utilisant adoptivement veine de la queue ou par injection rétro-orbital, car ces cellules seront à la maison lymphoïdes organes tels que les ganglions lymphatiques et la rate. </li><li> Récuser les souris receveuses un jour plus tard avec l&#39;antigène. REMARQUE:Dans cet exemple, on utilise l&#39;ovalbumine (protéine OVA, 50 ug / souris) comme antigène en raison spécifiques de l&#39;OVA, le récepteur des cellules T (TCR) des cellules T -transgenic ont été transférés de manière adoptive chez des souris receveuses. Préparer la protéine OVA dans du PBS stérile et injecter 100 pi de OVA protéine / PBS ou le contrôle PBS, par injection sous - cutanée (si), dans chaque souris receveuse 5. </li><li> La récolte et de générer des suspensions individuelles de cellules à partir des organes lymphoïdes (ganglions lymphatiques et la rate) des souris receveuses 3 jours après l&#39;immunisation avec la protéine OVA ou du PBS. ganglions lymphatiques séparés dans proximales des ganglions lymphatiques (PLN), qui comprend axillaire, brachial et les ganglions lymphatiques cervicaux superficiels) et distales des ganglions lymphatiques (DLN), qui comprend mésentérique, poplitée, inguinale, lombaire, et les ganglions lymphatiques caudales. cellules Stain utilisant les anticorps FACS appropriés pour vérifier T la prolifération cellulaire. NOTE: Dans cette expérience, la cellule de suivi de CFSE, CFSE marqué les cellules T provenant de souris témoins PBS injecté établir une fluorescence de base pour les non-diViding cellules. Divisions cellulaires de prolifération, cellules CFSE marqués stimulés par un antigène sont visualisés par la mesure des pics de fluorescence 12,13. Avec le contrôle PBS, le nombre de divisions cellulaires de prolifération, les cellules T CFSE marquées peut être déterminée 12,13. </li><li> Analyser les données de prolifération de cellules CFSE marqué en comparant le nombre de divisions cellulaires ou des pics entre les échantillons (figures 1 et 2). REMARQUE: par exemple, CFSE marqué, des cellules T spécifiques de l&#39; OVA par transfert adoptif dans des souris receveuses recevant l&#39;antigène OVA feront l&#39; objet d&#39;une prolifération active par rapport aux souris témoins PBS injecté 5,12. En outre, il est remarquable de souligner qu&#39;il existe de nombreuses façons d&#39;analyser les données de prolifération des cellules CFSE, comme démontré par Hawkins et ses collègues 14. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, nous démontrons une procédure pour la purification de lymphocytes provenant d&#39;organes lymphoïdes. purification cellulaire utilisant bille magnétique tri est une méthode simple et rapide qui donne des cellules cibles viables et hautement purifiés. Étapes critiques dans le Protocole La viabilité cellulaire et le rendement des cellules Le maintien de la viabilité des cellules de la l...

Les lymphocytes matures existent généralement à l’état de repos s’il n’y a pas d’infection ou d’inflammation préexistante chez l’individu. Par conséquent, il est important de conserver l’état naïf des lymphocytes pendant le processus d’isolement avant d’effectuer des tests fonctionnels in vitro ou in vivo. La clé pour garantir des résultats cohérents et reproductibles est de limiter toute manipulation inutile des cellules. 
Le tri magnétique des cellules utilise des anticorps et des microbilles pour marquer les cellules afin d’enrichir la population cellulaire d’intérêt. Avec cette approche, il existe deux stratégies de purification : l’enrichissement positif et l’épuisement négatif. L’enrichissement positif enrichit la population cellulaire d’intérêt à l’aide d’un anticorps qui se lie aux cellules cibles. La déplétion négative, en revanche, appauvrit les cellules non cibles, laissant la population cellulaire d’intérêt. Dans notre laboratoire, nous préférons l’appauvrissement négatif à l’enrichissement positif, car la liaison des anticorps aux cellules cibles pourrait potentiellement modifier les caractéristiques et le comportement des cellules. En fait, de nombreux marqueurs de surface cellulaire établis adaptés à l’isolement d’une population cellulaire particulière sont également des récepteurs fonctionnels. 
Le tri magnétique des cellules produit non seulement des populations très pures de cellules cibles viables, mais il prend également moins de temps et évite le stress cellulaire induit par le flux à haute pression utilisé dans le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). En marquant les populations cellulaires indésirables et en les appauvrissant à l’aide d’une colonne de séparation magnétique, nous sommes en mesure d’effectuer une isolation cellulaire rapide sans compromettre la viabilité de la population cellulaire cible. Dans ce protocole, nous démontrons l’utilisation de stratégies de déplétion négative pour purifier les lymphocytes B ou lymphocytes T naïfs.

<table><tbody><tr><td><Matériaux>forts</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (sans L-Glutamine)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de Bovin</td><td></td><td></td><td>Fœtal Chaleur inactivée&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles magnétiques anti-CD43</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>Bien mélanger avant utilisation</td></tr><tr><td>Microbilles de streptavidine</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>Bien mélanger avant utilisation</td></tr><tr><td>Perles magnétiques anti-annexine V</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>Bien mélanger avant utilisation</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture stérile à fond en U à 96 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture stérile à fond en F à 96 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; maille de passoire à cellules m</td><td>Pour stériliser à l’aide de rayons UV utilisation préalable</td>0,2 &mu ;<td></td><td></td></tr><tr><td> m&nbsp ; unités de filtration jetables stériles</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Peut être remplacé par n’importe quel appareil de filtration stérile</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV en abrégé ; alternative à CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY en abrégé ; alternative à CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR en abrégé ; alternative à CFSE</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Dye eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 en abrégé ; alternative à CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, alternative à CFSE</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Rouge phénolique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Peut être utilisé à partir d’autres sources</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl Sulfoxyde</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>(5-(et 6-) carboxyfluorescéine diacétate succinimidylique ester (CFSE)</td><td>Sondes moléculaires</td><td>C-1157</td><td>Reconstituer dans DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (Ionophore calcique)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>><Société </td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Anticorps et protéine recombinante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b biotine (clone m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>Cocktail de déplétion des lymphocytes T</td></tr><tr><td>CD11c biotine (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>T depletion cocktail</td></tr><tr><td>Gr-1 biotine (clone RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>Cocktail d’appauvrissement des lymphocytes T</td></tr><tr><td>Ter119 biotine (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>Cocktail d’appauvrissement des lymphocytes T</td></tr><tr><td>TCR-&gamma ; et delta ; biotine (clone GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>Cocktail d’appauvrissement des lymphocytes T</td></tr><tr><td>CD19 (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>Cocktail d’appauvrissement des lymphocytes T</td></tr><tr><td>B220 (clone RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>Cocktail d’appauvrissement des lymphocytes</td></tr><tr><td>T CD49b (clone DX5)</td><td>Biotine Biotine</td><td>108904</td><td>T</td></tr><tr><td>CD4 (clone GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td>Cocktail d’appauvrissement des lymphocytes</td></tr><tr><td>T CD8 biotine (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>Cocktail d’appauvrissement des lymphocytes T</td></tr><tr><td>F(ab')2 IgM anti-souris de chèvre (revêtue d’une plaque)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp ;</td><td>115-006-075</td><td>50 et micro ; l/puits pour revêtement (96 puits)</td></tr><tr><td>Anti-souris CD40 mAb (revêtement sur plaque)</td><td>Pharmingen&nbsp ;</td><td>553722</td><td>50 et micro ; l/puits pour revêtement (96 puits)</td></tr><tr><td>IL-4 ProSpec recombinant</td><td>&nbsp ;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS d’E. coli Sérotype 055 :B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (clone clone OKT3) (revêtement sur plaque)</td><td>eBioscience&nbsp ;</td><td>16-0037-85</td><td>50 et micro ; l/puits pour revêtement (96 puits)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (clone clone 37.51) (revêtement sur plaque)</td><td>eBioscience&nbsp ;</td><td>16-0281-85</td><td>50 & micro ; l/puits pour enrobage (96 puits)</td></tr><tr><td>Recombinant IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>Albumine du blanc d’œuf de poule, Ovalbumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et activation de murins lymphocytes

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Classe cellules B et T, avec leurs répertoires antigènes-récepteurs extrêmement divers, ont la capacité de développer des réponses immunitaires spécifiques contre presque tous les agents pathogènesenvahisseurs 1,2. Naturellement, de telles capacités complexes sont contrôlées par un grand nombre de molécules impliquées dans divers processus cellulaires pour assurerdes réponses immunitaires opportunes et régulées dans l’espace3. Ici, nous décrivons des procédures expérimentales qui permettent d’isoler rapidement des lymphocytes murins hautement purifiés à l’aide de la technologie de tri cellulaire magnétique. Les lymphocytes purifiés qui en résultent peuvent ensuite être soumis à divers tests fonctionnels in vitro ou in vivo, tels que la détermination de la capacité de signalisation des lymphocytes lors de la stimulation par immunoblotting4 et l’étude des capacités prolifératives par incorporation de 3H-thymidine ou marquage5-7 de l’ester succinimidylique de diacétate de carboxyfluorescéine (CFSE). En plus de comparer les capacités fonctionnelles des lymphocytes de contrôle et des lymphocytes génétiquement modifiés, nous pouvons également déterminer la capacité de stimulation des lymphocytes T des cellules présentatrices d’antigènes (APC) in vivo, comme le montrent nos résultats représentatifs en utilisant des cellules T OT-I transplantées marquées au CFSE.

la purification magnétique des cellules de lymphocytes permet de purifier une population de cellules cibles dans un temps relativement court laps de temps. En utilisant notre protocole d&#39;épuisement, nous avons été en mesure d&#39;augmenter le pourcentage de cellules T CD8 (OT-I dans la recombinaison activant le gène-1 (RAG-1) souris ayant un déficit) de 72,8% (avant purification) à 94,2% (après purification; La figure 1A) 4,5. Ces lymphocytes purifiés peuv...

Les lymphocytes sont les principaux acteurs des réponses immunitaires adaptatives. Ici, nous présentons un protocole de purification des lymphocytes pour déterminer les fonctions physiologiques des molécules souhaitées dans l’activation des lymphocytes in vitro et in vivo. Les procédures expérimentales décrites conviennent pour comparer les capacités fonctionnelles entre les lymphocytes témoins et les lymphocytes génétiquement modifiés.

Isolement et activation de murins Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

L'objectif général de cette expérience est d'étudier les capacités fonctionnelles des lymphocytes murins purifiés à l'aide de divers tests fonctionnels in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'immunologie et de la biologie moléculaire, par exemple en étudiant la fonction d'une protéine d'intérêt dans des lymphocytes déficients pour un gène donné.Le principal avantage de cette technique réside dans la capacité de purifier rapidement des lymphocytes avec une manipulation minimale et un stress environnemental réduit. Pour purifier les cellules B, resuspendez jusqu'à 1 × 10⁸ cellules spléniques totales lysées des globules rouges dans 300 µL de solution saline équilibrée (BSS) supplémentée en FBS. Ajoutez ensuite 50 µL de microbilles magnétiques anti-CD43.Pour éliminer les cellules mortes, ajouter 30 microlitres de billes magnétiques Annexine V pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Agiter doucement la suspension cellulaire toutes les 15 minutes afin d'assurer une marquage uniforme des cellules. À la fin de l'incubation, laver les cellules marquées avec 14 millilitres de BSS supplémenté en FBS.Après la centrifugation, retirez le surnageant, secouez délicatement le tube et remettez en suspension le culot dans un à trois millilitres de BSS à température ambiante supplémenté en FBS. Pendant la centrifugation, placez une colonne de séparation sur un support magnétique et fixez une aiguille stérile de calibre 21 à l'extrémité de la colonne afin de réduire le débit. Équilibrez la colonne avec deux millilitres de BSS à température ambiante.Après avoir re-suspendu le culot dans un à trois millilitres de BSS à température ambiante, placer le tube de collecte sous l'aiguille, puis charger les cellules marquées B sur la colonne équilibrée. Recueillir l'écoulement dans un tube conique de 15 millilitres. Rincer ensuite la colonne avec un millilitre de BSS frais supplémenté en FBS.En combinant l'éluat de lavage avec les cellules cibles collectées, rechargez la colonne avec l'aluet contenant les cellules cibles, en récupérant l'écoulement dans le même tube de 15 millilitres. Lavez ensuite la colonne trois fois avec un millilitre de BSS supplémenté en FBS, en continuant à combiner les lavages avec la suspension de cellules cibles. Après le troisième lavage, retirez la colonne de l'aimant et chargez-la avec cinq millilitres de BSS supplémenté en FBS.Utiliser le piston de la colonne pour éjecter les cellules non ciblées marquées magnétiquement dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, vérifier la pureté des cellules séparées par cytométrie en flux. Pour réutiliser une colonne de séparation, après élimination des cellules marquées par les billes magnétiques, laver la colonne trois fois depuis le haut avec cinq millilitres de PBS par lavage, puis trois fois avec cinq millilitres d’eau distillée par lavage.Ensuite, lavez la colonne avec cinq millilitres d'éthanol à 70 pour cent de la même manière et utilisez un filet d'air pour sécher complètement la colonne avant le stockage. Pour réutiliser la colonne dans une nouvelle expérience de purification, relavez la colonne de bas en haut avec cinq millilitres d'éthanol à 70 pour cent, suivis de deux lavages de cinq millilitres de PBS. Puis chargez le haut de la colonne avec cinq millilitres de PBS pour un dernier lavage.Et équilibrer la colonne avec deux millilitres de BSS à température ambiante. La colonne peut ensuite être chargée avec la population cellulaire expérimentale. Pour marquer les cellules B purifiées avec du CFSE, laver les cellules deux fois avec une solution de marquage fraîchement préparée dans un tube conique de 15 millilitres.Resuspendre le second culot à une concentration de deux fois dix puissance sept cellules par millilitre dans une solution de marquage fraîche à 37 degrés Celsius. À chaque fois, centrifuger les échantillons, éliminer le surnageant et secouer brièvement les tubes. Ensuite, marquer les cellules selon un rapport d'une part de suspension cellulaire pour une part de solution fraîchement préparée de CFSE à 10 micromolaire, à l'abri de la lumière pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.Retourner le tube toutes les deux minutes pour assurer une répartition uniforme du colorant. Il faut veiller à ce que le culot cellulaire soit complètement resuspendu dans la solution de marquage. Des agrégats cellulaires peuvent affecter l'homogénéité du marquage au CFSE.À la fin de l'incubation, ajouter du milieu RPMI pour bloquer le CFSE et laver les cellules deux fois dans plusieurs volumes de milieu RPMI complet glacé. Si les cellules ont été correctement marquées, le culot sera de couleur jaune. Ensuite, laver deux fois une plaque de 96 puits à fond plat, revêtue du stimulus approprié, dans du PBS.Pour les cellules B marquées au CFSE, resuspendre à raison de trois fois dix puissance six cellules B par millilitre dans du milieu RPMI complet et ensemencer 100 microlitres de cellules B par puits dans la plaque revêtue, en triplets, pendant 72 heures. Par cette méthode d'épuisement, la pureté des cellules T OT1-CD8 isolées par billes peut être augmentée de 72,8 % à 94,2 %. Les cellules peuvent ensuite être marquées au CFSE comme vient d'être démontré et transférées adoptivement dans des animaux receveurs afin d'analyser leur prolifération in vivo.En outre, le marquage par l'anticorps anti-CD45.1 peut être utilisé pour confirmer davantage l'identité des cellules exprimant le CFSE comme étant les lymphocytes T CD8 OT1 donneurs, positifs pour CD45.1, transférés de façon adoptive, dans les organes lymphoïdes des souris receveuses. Alternativement, les lymphocytes T purifiés peuvent être stimulés in vitro et leur prolifération peut être évaluée par l'incorporation de thymidine tritiée. Une augmentation significative de la pureté des lymphocytes B spléniques est également obtenue par cette méthode.Faciliter des opportunités similaires pour l'analyse fonctionnelle en aval des lymphocytes B purifiés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de maintenir votre suspension de CI sur glace en tout temps, sauf pendant la purification et le marquage au CFSE.Les lymphocytes purifiés peuvent également être utilisés dans d'autres tests fonctionnels, tels que le immunoblot, afin d'évaluer la capacité de signalisation terminale des lymphocytes modifiés génétiquement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez mieux comprendre comment purifier les cellules B et T, ainsi que la manière d'utiliser ces cellules pour divers tests fonctionnels in vitro et in vivo.

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