Caractérisation phénotypique des macrophages du Rat Kidney par cytométrie de flux
18 octobre 2016
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour phénotypiques et l'analyse quantitative des macrophages résidents de reins de rats par cytométrie de flux. Les cellules colorées ainsi obtenues peuvent également être utilisées pour d'autres applications, y compris le tri cellulaire, l'analyse de l'expression des gènes ou des études fonctionnelles, augmentant ainsi les informations obtenues dans le modèle expérimental.
L’objectif global de cette procédure est de quantifier et de caractériser les macrophages résidents des reins de rat par cytométrie en flux. Cette méthode peut avoir une réponse clé question dans la fluidité telle que quelle est la contribution de chaque macraphage de type dans les lésions rénales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet le cathétérisme rénal de différents marqueurs protéiques. Ainsi, la démonstration de la procédure sera Elena Olivares, étudiante A.P.A.S.D. de l’Université Complutense et Melania Guerrero, étudiante A.P.A.S.D. de Pour la perfusion et l’extraction rénales, commencez par pincer un petit pli de peau pour confirmer que le rat a atteint le niveau approprié de sédation. Et couvrez les yeux avec une pommade vétérinaire. Placez l’animal sur une table d’opération en position couchée. Et trempez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, faites une incision centrale à travers la peau abdominale et le péritoine du pubis à la cage thoracique pour exposer les cavités pleurale et abdominale. Utilisez le système de perfusion pour injecter une solution saline à 0,9 % dans l’aorte abdominale afin de rincer les reins. Couper l’aorte au niveau de l’abdomen pour aider à libérer le sang. Lorsque tout le sang a été retiré des reins, sectionnez le hile rénal. Appuyez ensuite sur le bord de chaque rein pour décapsuler soigneusement les organes. Et transférez les reins extraits dans des H.B.S.S.To frais générez une suspension de cellules rénales uniques, utilisez des ciseaux pour couper la moitié d’un rein en petits fragments. Transférez les morceaux de tissu dans un tube de 1,5 ml et ajoutez 1 ml de collagénase fraîchement préparée dans le tube pour une incubation de 30 minutes à 37
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Aperçu
Cet article décrit un protocole détaillé d'analyse phénotypique et quantitative des macrophages résidents provenant de reins de rat par cytométrie en flux. Les cellules marquées obtenues peuvent être utilisées pour diverses applications, enrichissant ainsi les données recueillies dans le modèle expérimental.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les macrophages jouent un rôle crucial dans la santé et les maladies rénales.
- La cytométrie en flux permet une analyse détaillée des populations cellulaires.
- Comprendre le comportement des macrophages peut guider les stratégies thérapeutiques.
- Les modèles chez le rat sont couramment utilisés pour l'étude des fonctions rénales.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour l'isolement et l'analyse des macrophages rénaux.
- Faciliter des recherches ultérieures sur les fonctions des macrophages dans les contextes rénaux.
- Fournir une ressource aux chercheurs dans des domaines connexes.
Méthodes utilisées
- Cytométrie en flux pour l'analyse cellulaire.
- Techniques de coloration pour l'identification des macrophages.
- Protocoles de tri cellulaire et d'analyse de l'expression génique.
- Études fonctionnelles pour évaluer l'activité des macrophages.
Résultats principaux
- Isolation réussie des macrophages résidents à partir des reins de rat.
- Caractérisation détaillée des phénotypes des macrophages.
- Applications potentielles dans les études d'expression génique et fonctionnelles.
- Compréhension améliorée du rôle des macrophages dans la santé rénale.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour l'analyse des macrophages.
- Les résultats peuvent orienter les futures études sur les maladies rénales.
- La recherche peut être étendue à d'autres applications au-delà de la cytométrie en flux.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La caractérisation phénotypique précise des sous-populations de macrophages dans les modèles de maladies rénales est essentielle pour réduire les risques liés à la validation des cibles dans les pathologies rénales induites par l'inflammation. Ce protocole de cytométrie en flux permet de distinguer quantitativement les phénotypes de macrophages pro-inflammatoires (M1) et immunorégulateurs (M2) dans les reins de rat, offrant ainsi des informations mécanistiques sur la fibrose et la modulation immunitaire. En fournissant une méthode fiable pour évaluer la contribution des macrophages aux lésions rénales, cette approche renforce la confiance prédictive dans le choix préclinique des cibles et l'analyse des voies biologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant les rapports M1/M2 des macrophages dans les modèles de lésion rénale.
- Valeur opérationnelle : Utilise un double marquage par cytométrie en flux (gating) CD45/CD68 combiné à la coloration des marqueurs d'expression membranaire CD86/CD163 pour définir les phénotypes des macrophages avec une grande spécificité.
- Valeur prédictive : Facilite la détection précoce des cibles thérapeutiques en reliant les états de polarisation des macrophages aux voies de fibrose et d'immunorégulation.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des résultats normalisés et quantitatifs par cytométrie en flux pour la fréquence des macrophages et l’expression des marqueurs.
- Reproductibilité : Présente une faible mortalité cellulaire et une intégrité préservée, permettant des lectures phénotypiques cohérentes d’une expérience à l’autre.
- Utilité en aval : Les macrophages isolés restent viables pour le tri cellulaire, ainsi que pour l’analyse de l’ARNm et des protéines, facilitant des analyses multi-omiques complémentaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Directement applicable aux modèles de maladies rénales inflammatoires où les phénotypes des macrophages contribuent à la pathogenèse.
- Continuité translationnelle : Les données phénotypiques obtenues à partir des macrophages triés peuvent orienter la découverte de biomarqueurs et la validation fonctionnelle dans les études précliniques.
- Décisions ajustées au risque : Permet une évaluation objective des effets de composés immunomodulateurs sur la polarisation des macrophages.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible jusqu'à l'évaluation préclinique, en fournissant des lectures immunologiques qui éclairent l'optimisation des candidats-médicaments et les études sur le mécanisme d'action dans les modèles de maladies rénales.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses sur les voies induites par les macrophages dans les lésions rénales grâce à la quantification phénotypique.
- Triage : Fournit des données quantitatives reproductibles sur les macrophages, adaptées à la validation d'essais et aux campagnes de criblage de composés.
- Analytique : Fournit des lectures multiparamétriques par cytométrie en flux (CD45+/CD68+/CD86+ pour M1 ; CD45+/CD68+/CD163+ pour M2) permettant l'analyse comparative entre groupes.
- Recherche translationnelle : Relie le phénotypage des macrophages à des essais fonctionnels ultérieurs et au profilage de l'expression génique dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole standardisé d'immunophénotypage applicable à plusieurs modèles de maladies rénales et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les lésions rénales médiées par les macrophages en permettant une discrimination phénotypique précise.
- Valeur opérationnelle : Permet une isolation et une coloration standardisées des macrophages, peu variables, compatibles avec les plateformes de cytométrie en flux.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en reliant la modulation de la cible à des changements mesurables de la polarisation des macrophages.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des candidats immunomodulateurs selon la modulation du phénotype des macrophages dans les modèles précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en compensation en cytométrie en flux, en stratégie de tri et en validation des marqueurs des macrophages.
- Dépend de l'accès à un équipement pour la digestion par collagenase et à une infrastructure de traitement cellulaire stérile.
- Exige une standardisation des panels d'anticorps et des contrôles de fluorescence entre les sites pour une quantification reproductible des macrophages M1/M2.
- L'adaptation à d'autres tissus peut nécessiter une optimisation des enzymes de dissociation et des panels de marqueurs.
- Limitée par la disponibilité de marqueurs spécifiques des macrophages chez le rat (CD86, CD163), comparée aux répertoires plus étendus chez la souris.
