Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la façon dont les canaux ioniques voltage-dépendants individuels contribuent aux fonctions d’un neurone spécifique. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle permet de cartographier la fonction des canaux ioniques au niveau subcellulaire dans les neurones. Commencez cette procédure en plaçant le cerveau sur une boîte de Pétri de 9 centimètres avec le fond recouvert d’une couche de SiliGuard.

Ensuite, entourez le cerveau de saccharose-ACSF glacé. Pour préparer des coupes coronales, faites deux incisions pour enlever le cervelet et la partie rostrale du cerveau. Appliquez ensuite de la colle cyanoacrylate sur le plateau d’échantillon et collez le bloc cérébral sur le plateau de sorte que la partie rostrale fasse face à l’étape de tranchage.

Par la suite, appliquez quelques gouttes de saccharose-ACSF sur le cerveau et immergez lentement le plateau dans la chambre de coupe. Ensuite, ajustez la lame de rasoir à un angle de 15 degrés par rapport au plan horizontal. Coupez des tranches de cerveau coronaire d’environ 500 micromètres dans la direction nasale avant d’atteindre la substance noire.

Ajustez ensuite l’épaisseur pour découper des tranches de 300 micromètres contenant la région d’intérêt. Séparez les tranches du bloc de tissu à l’aide d’une aiguille de profusion très fine fixée à une seringue parallèle au bord de la lame du rasoir. Ensuite, transférez les tranches dans la chambre de réserve à 34 degrés Celsius pendant une heure.

Dans cette procédure, transférez une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement. Ancrez la tranche au fond de la chambre d’enregistrement à l’aide d’un anneau en platine et assurez-vous que la tranche est de bonne qualité avec une surface lisse et uniforme. Sélectionnez ensuite un neurone avec une dendrite s’étendant sur une longue distance dans le même plan, et assurez-vous que la dendrite d’intérêt peut être suivie jusqu’à un soma bien défini.

Ensuite, remplissez la pipette patch avec une solution d’électrode. Pour patcher la dendrite en mode attaché à une cellule, identifiez et concentrez-vous sur une partie de la dendrite. Appliquez une pression positive sur la pipette et abaissez-la à l’aide du micromanipulateur.

Positionnez ensuite la pipette près de la membrane et ajustez la pression afin de créer une petite fossette. Par la suite, relâchez la pression sur la pointe de la pipette et patchez la dendrite, tout en contrôlant la résistance de la pipette. Essayez d’obtenir une résistance d’étanchéité supérieure à un gigaohm, au mieux entre trois et dix gigaohms, pour les enregistrements attachés à des cellules.

Ensuite, rétractez la pipette loin de la membrane, de quelques micromètres, pour éviter la déformation de la dendrite. Les courants d’action observés ici représentent les potentiels d’action spontanés des neurones nimals. Pour supprimer les courants d’action, appliquez des inhibiteurs des canaux calciques et sodiques sur l’ACSF.

Appliquez ensuite un pas de tension de 90 millivolts, à partir d’un potentiel de maintien de zéro millivolts, pour évoquer le courant cationique activé par l’hyperpolarisation. À la fin de l’enregistrement, rompez le patch pour obtenir le mode cellule entière. Après cela, retirez lentement et doucement la pipette dendritique de la membrane neuronale pour obtenir un patch de l’extérieur vers l’extérieur.

Pour enregistrer à partir du soma correspondant en mode cellule entière, localisez le soma correspondant à la dendrite. Abaissez une pipette avec une résistance comprise entre cinq et dix mégaohms avec une solution intracellulaire à base de potassium sur le corps cellulaire. Appliquez ensuite une brève pression négative sur la pointe de la pipette pour rompre la membrane afin d’obtenir le mode à cellules entières.

Vérifiez l’identité du neurone en mode pince de courant en appliquant de longs pas de courant hyper et dépolarisants, et laissez la biocytine de la pipette diffuser le long des dendrites. Au bout de 10 minutes, retirez la pipette pour obtenir un patch de l’extérieur vers l’extérieur. Utilisez une séquence de courts mouvements latéraux ascendants pour favoriser la bonne fermeture de la membrane cellulaire, une fois que la pipette est au-dessus de la tranche, pour sortir complètement de la chambre d’enregistrement.

Conservez la tranche dans la chambre d’enregistrement pendant 15 minutes supplémentaires dans l’ACSF standard pour permettre l’équilibre de la biocytine et du neurone enregistré. Ensuite, transférez doucement la tranche dans une bouteille en verre ambré de 25 millilitres contenant de l’ACSF standard pour l’histologie. Dans cette procédure, localisez grossièrement le neurone marqué en fluorescence dans la tranche avec épifluorescence.

Examinez brièvement l’arborescence dendritique des neurones et localisez l’axone et la bulle axonale à l’aide d’un objectif 10X. Ensuite, passez au microscope confocal et sélectionnez la diode laser de 488 nanomètres pour exciter le neurone marqué. Suivez l’extension de l’axone et des dendrites dans l’axe Z, et enregistrez des images successives afin d’obtenir un empilement Z pour l’ensemble de la cellule.

Ajustez la résolution de l’axe Z et collectez les images confocales de la cellule à un grossissement faible et à un grossissement élevé. À la fin, ouvrez le fichier image du neurone avec un logiciel d’imagerie. Comparez l’image de projection Z avec une image IR-DGC à l’œil nu pour localiser la position précise de la pipette patch pendant l’enregistrement électrophysiologique.

Voici l’image IR-DGC d’un neurone dopaminergique et d’une pipette sur la dendrite proximale. La trace de courant montre la capacité des courants de fuite EN en réponse à une commande de tension de cinq millivolts, en configuration attachée à une cellule, avec une résistance d’étanchéité de cinq gigaohms. Le pas de tension hyperpolarisante, à partir d’un potentiel de membrane de zéro millivolts, induisait un courant cationique activé par l’hyperpolarisation qui s’activait lentement.

La trace de courant a été inversée et équipée d’une seule fonction exponentielle, ce qui donne une constante de temps de 632 millisecondes. Voici les réponses en tension de l’ensemble de la cellule enregistrée soma à des impulsions de courant hyper et dépolarisantes d’une seconde en présence de bloqueurs de courant de sodium et de calcium voltage-dépendants pour éliminer les potentiels d’action pendant l’enregistrement attaché à la cellule. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée, si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’obtenir des tissus sains et des conditions d’enregistrement stables. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme l’immunohistochimie, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identité du neurone enregistré. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurophysiologie pour explorer la fonction, les propriétés et le rôle des canaux ioniques voltage-dépendants dans les cellules excitables.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer et d’examiner la distribution des courants circulant dans les canaux ioniques voltage-dépendants dans les dendrites.