Name: Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Apprenez les enregistrements patch-clamp subcellulaires des dendrites de neurones dopaminergiques pour étudier les canaux ioniques. Cette technique permet d'analyser la fonction neuronale avec une haute résistance de scellement.

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Je remercie le Dr Vincent Seutin pour son soutien constant, Christelle Gillissen et Laurent Massotte pour une excellente assistance technique, les Drs Jean Defourny et Sandra Ormenese pour des conseils avec le microscope confocal, le Dr Jacques Destiné pour le don du second amplificateur Axopatch 200B, le GIGA-Imagerie plate-forme pour le partage du microscope confocal et le logiciel Imaris et le Dr Stephen Freeman pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du FRS - FNRS belges (U.N002.13 et T.N0015.13) et publié avec le soutien de la Fondation Universitaire de Belgique (Publié with the concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

L&#39;auteur déclare qu&#39;il n&#39;a pas d&#39; intérêts financiers concurrents.

Ce rapport décrit un protocole étape par étape pour mettre en œuvre deux enregistrements de cellules entières somatodendritiques et enregistrements dendritiques locaux. Il est utile pour déterminer l&#39;influence des canaux ioniques ( par exemple, I h) sur le décours temporel des potentiels post - synaptiques et la cartographie de la répartition du canal ionique (I h) le long du domaine somato des neurones dopaminergiques de la substance noire, respectivement. Résultant des mesures électrophysiologiques sont combinés pour poster histochimie hoc pour récupérer la morphologie des cellules. La procédure a été utilisée pour étudier les neurones dopaminergiques situés dans la substantia nigra, mais peut être généralisé pour les neurones voisins nigrales GABA, aire tegmentale ventrale neurones DA ou d&#39;autres neurones du mésencéphale. Toutes les étapes peuvent également être suivies pour examiner d&#39; autres canaux ioniques exprimés dans les dendrites des neurones de la substance noire , sans modifications importantes. Visualisation post hoc est particulièrement pertinente pour les neurones avec axone portantdendrites, tels que les neurones de la substance noire 25,26, hippocampiques interneurones oriens-alveus 21 ou certains neurones pyramidaux CA1 67. Fait intéressant, les neurones partageant cette caractéristique semble être plus fréquente qu&#39;on ne le pensait généralement 67. L&#39;analyse morphologique révèle aussi la position précise des électrodes et axone. La détection de ce dernier peut être optimisée par le marquage des protéines exprimées dans le segment initial de l&#39; axone (canaux voltage-gated Na + ou ankyrine G) en utilisant l&#39; immunohistochimie 68,69. La fiabilité des données recueillies avec des enregistrements dendritiques et l&#39;étiquetage neuronale ultérieure dépend toujours de la qualité de coupe. par conséquent, l&#39;effort maximum a besoin d&#39;être appliqué à préserver la viabilité des cellules dans le tissu. Ceci est réalisé avec une manipulation douce des animaux sains, des outils et des réactifs de haute qualité, une oxygénation suffisante des températures de tissus et de glace-froid tout au long de la préparation de tranches. des conditions d&#39;enregistrement stables reposent sur la sélection des neurones sains. Dans le mode de cellule entière, la résistance série doit initialement être aussi faible que possible et maintenue constante pendant toute l&#39;expérience. La stabilité des enregistrements dépend en outre des manipulateurs de haute qualité dépourvus de dérive et les vibrations. Ces perturbations peuvent être réduites par l&#39;optimisation de la stabilité de la pipette: vérifier la connexion au porte-pipette et headstage, en contrôlant que les câbles sont micromanipulateur mou, évitant ainsi des changements soudains de température ou de mouvement de la scène et le contrôle du mécanisme du manipulateur. Pour deux enregistrements, méthylsulfate 13,15,21 a été inclus dans la solution intracellulaire, mais gluconate 9,14,25 peut aussi être employé. Cependant, l&#39;anion principal peut modifier le potentiel de membrane et 70,71 des courants dépendant de la tension 72. Solution intracellulaire peut être complétée avec de l&#39;ATP, GTP et de préserver la phosphocréatine physiologiques fonctions des neurones. En outre, l&#39; ajout d&#39; un colorant fluorescent dans la solution de pipette (par exemple, Alexa 594 , ou sulforhodamine 101 41) pour visualiser les dendrites lors d&#39; un enregistrement somatique peut être utile , par exemple , de placer une application de pression (figure 7 dans la réf. 41) ou une stimulation électrique pipette. La solution de la pipette pour l&#39; enregistrement cellule attachée contient une concentration élevée en K + et sans Na + pour enregistrer un grand I h. Il convient de noter le rapport Na + / K + de concentration influe sur l&#39;amplitude de courant 10, le potentiel d&#39;inversion du courant 11 et de l&#39;ouverture de porte de 73 I h. Alternativement, I h peuvent également être enregistrées à l&#39; aide à l&#39; extérieur-outs 10. Dans cette configuration d&#39;enregistrement cependant, le milieu intracellulaire dans la proximité des canaux peut être perturbée. Par conséquent, les différences de l&#39;activation dépendant de la tension de I &lt;sub&gt; h est observée lorsque les courants de comparaison obtenus en utilisant des correctifs attachés aux cellules et à l&#39; extérieur-outs 10. Gonflement des neurones est parfois rencontré pendant l&#39; enregistrement patch-clamp, et résulte souvent de causes distinctes telles que la faible qualité de l&#39;eau, fort déséquilibre de l&#39;osmolarité ou le pH entre les solutions 39 ou des erreurs intra- et extracellulaire dans la composition des solutions. La qualité des enregistrements électrophysiologiques a une incidence directe sur la qualité de la morphologie des neurones récupérés. Pipette à haute résistance somatiques sont utilisés pour les enregistrements doubles (6 - 10 MQ, comme dans les références 6,11.) Et pour les enregistrements somatiques isolés après des enregistrements attachés aux cellules afin de minimiser la dilution du milieu intracellulaire 14. L&#39;enregistrement somatique de cellules entières après l&#39;enregistrement cellule attachée est donc maintenu court (&lt;10 min). Outside-out patches à la fois du somatiques et dendritiques pipettes sont essentiels pour la bonne fermeture de la cell membrane et la récupération subséquente de la morphologie cellulaire. En plus de la structure de la cellule, le contenu neurochimique peut être déterminé pour les neurones enregistrés 59,74. Par exemple, la protéine tyrosine hydroxylase intracellulaire peut être immunomarquées pour l&#39; identification univoque des neurones dopaminergiques 13. Neurones dopaminergiques sont principalement concentrés dans le SN pars compacta, avec une densité beaucoup plus faible présente dans le SN pars reticulata, où ils sont mélangés avec un plus grand nombre de neurones GABA 75. Tandis que le corps cellulaire des neurones dopaminergiques est souvent supérieure à celle des neurones GABA, l&#39;identification visuelle de ces cellules avec l&#39;IR-vidéomicroscopie est incertain et partiellement entravé par l&#39;opacité des pars compacta. Afin de contourner ces limitations, la pré-sélection des neurones dopaminergiques peut être facilitée par l&#39;utilisation de souris transgéniques exprimant un marqueur fluorescent dans une population spécifique de neurones (TH 65 ou DAT pour les neurones dopaminergiques, GADpour les neurones GABA) et l&#39;éclairage du épifluorescence. En variante, un colorant fluorescent peut être inclus dans la solution de l&#39;électrode somatique pour faciliter la visualisation des dendrites. Augmentation de la résolution de la cellule fluorescente est amené par Nipkow disque rotatif confocal 14,22,30 ou microscopie à deux photons 7 combinée à l&#39; IR-DGC 6. Plusieurs avantages sont liés à DGC par rapport à une CIVD. Tout d&#39; abord, sous forme de prismes DIC ne sont pas nécessaires, l&#39;image IR-DGC peut être recouverte d&#39;une 49,52,53,76 d&#39;image de fluorescence. Deuxièmement, DGC peut être combiné avec photostimulation et optogénétique 77. Un inconvénient de la préparation de tranche est la préservation de l&#39;intégrité des neurones. DA neurones étendent leurs dendrites dans les trois plans de l&#39; espace 78,79 et donc troncature du compartiment dendritique ne peuvent pas être complètement évités en tranches 80. Le choix de l&#39;orientation des tranches (coronale, horizontal ou parasagittal) est un compromis. L&#39;origine de l&#39;innervation et la conception expérimentale doit être considérée pour sélectionner la bonne orientation des tranches. rapiéçage dendritique directe est la technique utilisée pour cartographier la répartition des canaux ioniques fonctionnels dans les différents compartiments de cellules. En outre, cette technique permet de déterminer la variabilité des propriétés fonctionnelles des canaux 20. En complément de l&#39;emplacement et de la densité des canaux ioniques peuvent être déterminés par immunohistochimie à la lumière et microscopie électronique à des niveaux 17,23. Cette approche offre également la possibilité de déterminer la densité de canal dans les petites structures de calibre qui sont inaccessibles aux pipettes de patch. Cependant , ces canaux peuvent être dans un état fonctionnel distinct 24 ou même inactifs par rapport à ceux enregistrés en utilisant des techniques de patch-clamp. Les deux techniques sont donc nécessaires pour obtenir une image complète de l&#39;emplacement et les propriétés decanaux ioniques dans une région cellulaire spécifique 17. Avec le développement des colorants sensibles à la tension, l&#39; imagerie de tension a été utilisée pour examiner la propagation des PA et des EPSP dans les neurones à plusieurs endroits 81. Comme une alternative à deux enregistrements de patch-clamp, cette approche peut même être mis en œuvre pour dendrites minces qui ne sont pas accessibles aux pipettes de patch, mais nécessitent un étalonnage précis du signal et la moyenne. Alors que les neurones dopaminergiques dans le SN et l&#39;aire tegmentale ventrale sont largement étudiés par l&#39;intermédiaire des enregistrements somatiques dans le contexte physiologique et physiopathologique, les propriétés fonctionnelles de leurs dendrites reste largement inconnue dans les deux conditions. Patcher de dendrites a été mis en place pour les neurones dopaminergiques de la substance noire par plusieurs groupes avec succès 13,25,26 et reste la méthode de choix pour disséquer les propriétés excitables de ces structures subcellulaires fines 8. les enregistrements fournissent une nouvelle dendritique Opportunité de scruter l&#39;efficacité et la plasticité de la transmission synaptique et la plasticité de l&#39; excitabilité dendritique 82,83.

Les neurones reçoivent des informations synaptique principalement sur leurs dendrites. Excitateurs synaptiques et des signaux inhibiteurs répartis sur leur site de production au site d&#39;intégration, où les potentiels d&#39;action (PA) sont évoqués en tant que signal de sortie. Sur leur chemin, les potentiels synaptiques sont influencées à la fois par la structure de dendrites et l&#39;interaction entre les propriétés des membranes passives et actives. La combinaison de ces paramètres très variables élargit la puissance de calcul des neurones 1,2. Cependant, le faible diamètre des dendrites entrave mais l&#39;étude de leurs propriétés électriques. Le développement continu de la technique patch-clamp 3, l&#39;optique 4 et le perfectionnement des méthodes de préparation de tranches 5 au cours des dernières décennies ont permis à des enregistrements de très mince (0,7 à 3 pm Ø) dendrites 6,7. Ces méthodes ont été, et sont encore largement utilisés pour examiner l&#39;excitabilité des dendrites dans une variété oneurones f 8. Enregistrements dendritiques directs sont essentiels pour déterminer la distribution 9-19 et les différences dans les propriétés fonctionnelles 20-22 des canaux ioniques dans des compartiments neuronaux distincts. Ces données sont le complément nécessaire des distributions de canaux ioniques détectés par immunohistochimie combinée à la lumière et microscopie électronique 23,24. Enregistrements doubles somatodendritiques ont été mis en œuvre pour explorer la propagation des potentiels d&#39;action 9,13-15,21,22,25-27 et la propagation des potentiels synaptiques 13,16,18 le long du domaine somato de neurones, obtenir des modèles passifs détaillés de câble 28- 30 et enquêter sur la résolution temporelle de l&#39; intégration neuronale 31. Le substantia nigra (SN) est une région située dans le mésencéphale impliqué dans plusieurs fonctions telles que le contrôle du mouvement, le codage de la récompense et les comportements habituels. La diminution de la dopamine en raison de la spécifiquela perte de dopaminergiques (DA) dans les neurones du SN est associée à des troubles moteurs observés chez les patients atteints de la maladie de Parkinson 32. Le circuit nigrale se compose de deux principaux types de cellules: les neurones dopaminergiques et GABAergiques. Fait intéressant, ces neurones présentent plusieurs caractéristiques qui les distinguent des autres neurones. L&#39;axone d&#39;une proportion importante de neurones dopaminergiques et certains neurones GABA provient d&#39;un site dendritique indiquant que l&#39;arbre dendritique est hétérogène (axones et dendrites portant axonales dépourvue) 25,26,33. La morphologie de ces neurones contraste donc avec l&#39;organisation typique des neurones dans lesquels le transfert d&#39;information suit la loi de polarisation dynamique émise par Cajal: à partir de dendrites, de soma et enfin à AXON 34. Les neurones dopaminergiques sont également connus pour libérer de la dopamine à partir de leurs dendrites 35, génèrent une activité d&#39;éclatement 36 et 37 plasticité du récepteur NMDA. La dissectiontion de ces phénomènes est insaisissable sans enregistrements directs à partir du site où ils sont initiés. Afin de mieux comprendre la relation entre l&#39;emplacement précis et les propriétés fonctionnelles des canaux ioniques et leur rôle dans le transfert de l&#39;excitabilité et de l&#39;information dendritique dans les neurones de la substance noire, les enregistrements dendritiques directs sont la méthode de choix. Ce rapport décrit une procédure détaillée qui peut être utilisé pour obtenir des enregistrements de patch-clamp simple et double de dendrites des neurones de la substance noire et le biocytin étiquetage correspondant post hoc. Les principes de base pour patcher le somatique et la membrane dendritique sont très similaires. Pratiquement cependant, les enregistrements à partir de sites dendritiques nécessitent une optimisation spécifique par rapport aux enregistrements somatiques. enregistrements dendritiques succès reposent sur la qualité des tranches, l&#39;ajustement optimal de l&#39;optique, l&#39;approche douce de la pipette de patch et de la stabilité des enregistrements.

<table><tbody><tr><td>Eau bidistillée</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Résistivité >14 M&Omega ; cm, idéale 18,2 M&Omega ; cm à 25&nbsp ; &deg ; C, filtré (0,22 & micro ; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Bougies microfiltres</td><td>Robu</td><td>Porosité 3, 6 mm ou 13 mm de diamètre</td><td></td></tr><tr><td>Trancheuse à tissus avec vibrosonde</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Paramètres de coupe : vitesse 0,07, amplitude 1,40</td></tr><tr><td>Trancheuse à tissus</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>Paramètres de coupe : vitesse 4, fréquence 7</td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Outils de dissection</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre de réserve</td><td></td><td></td><td>Beckers</td></tr><tr><td>en PP</td> sur mesure <td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &micro ; m</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate&nbsp ;</td><td>UHU"</td><td>Sekunden Kleber"</td>colle <td>liquide</td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement&nbsp ;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice mini chambre</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipette horizontal</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm d.a./1 mm d.i. caporités en verre, extrémités polies au feu, lavées</td></tr><tr><td>Cire dentaire</td><td>Colt&egrave ; Plateau orthodontique ne/Whaledent</td><td></td><td>Bandes de cire Grille</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>platine</td><td>pour ancrer les tranches dans la chambre d’enregistrement, fabriquée sur mesure avec un disque de platine</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>pour polir au feu les pointes de pipette</td></tr><tr><td>Sulfate de méthyle de potassium</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Sondes moléculaires</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manomètre</td><td>GREISINGER électronique</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs & Manipulateurs Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>La source d’imagerie</td><td>Caméra DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condenseur</td><td>Zeiss</td><td></td> à <td>grande ouverture numérique Condenseur fonctionnant à l’huile</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X Grossissement, longue distance, grande ouverture numérique 1.0 immersion dans l’eau objectif</td></tr><tr><td>Quadruple changeur</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td>entre la caméra et le microscope</td></tr><tr><td>Moniteur vidéo noir et blanc</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16 pouces, 850 lignes TV,</td></tr><tr><td>flacons d’échantillons analogiques, verre ambré, avec capuchon</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>pour transférer les tranches de la configuration à la salle d’histologie</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analyse des données électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>voir FICHE DE DONNÉES DE SÉCURITÉ et Directive sur les substances dangereuses (UE) avant utilisation</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire bien</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>pour la coloration des coupes fixes</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>voir FICHE DE DONNÉES DE SÉCURITÉ et Directive sur les substances dangereuses (UE) avant utilisation</td></tr><tr><td>souris anti-TH monoclonal primaire</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>concentration de travail : 1/1 000</td></tr><tr><td>chèvre anticorps secondaire anti-souris - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>concentration de travail : 1/500</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires anti-effacement ProLong Diamond</td><td>- Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>plugin pour ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstruction de neurones remplis de biocytine</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>Reconstruction de neurones remplis de biocytine</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analyse de données électrophysiologiques</td></tr></tbody></table>

subcellulaires recordings patch-clamp du domaine somato de nigrales dopamine neurones

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Les dendrites des neurones dopaminergiques reçoivent et transmettent entrée synaptique, le soutien potentiel d&#39;action back-propagation et la libération de neurotransmetteurs. La compréhension de ces fonctions fondamentales fera la lumière sur le transfert de l&#39;information dans ces neurones. patch-clamp enregistrements dendritiques offrent la possibilité d&#39;examiner directement les propriétés électriques des dendrites et des canaux voltage-dépendants sous-jacents ion. Cependant, ces structures fines ne sont pas facilement accessibles aux pipettes de patch en raison de leur petit diamètre. Ce rapport décrit une procédure étape par étape pour recueillir des enregistrements stables et fiables des dendrites des neurones dopaminergiques dans des tranches aiguës. Mesures électrophysiologiques sont combinées avec la récupération post hoc de la morphologie cellulaire. Des expériences réussies reposent sur l&#39;amélioration de la préparation des tranches, des solutions et des pipettes, le réglage adéquat de l&#39;optique et de la stabilité de la pipette en contact avec la structure enregistrée. principes standard de somatique enregistrement patch-clamp sont appliqués à dendrites, mais avec une approche plus douce de la pipette. Ces techniques polyvalentes peuvent être mises en œuvre pour répondre à diverses questions concernant les propriétés excitables de dendrites.

Les enregistrements de patch-clamp subcellulaires offrent la possibilité d’étudier les propriétés fonctionnelles des dendrites. Cependant, ces structures fines ne sont pas facilement accessibles en raison de leur petit diamètre. Le protocole décrit ici vise à faciliter la collecte d’enregistrements stables et fiables à partir des dendrites des neurones dopaminergiques en tranches in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, comme la manière dont les canaux ioniques voltage-dépendants individuels contribuent aux fonctions d’un neurone spécifique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de cartographier la fonction des canaux ioniques au niveau sous-cellulaire dans les neurones. Commencez cette procédure en plaçant le cerveau sur une boîte de Pétri de 9 centimètres dont le fond est recouvert d’une couche de SiliGuard.Ensuite, entourez le cerveau avec du milieu ACSF glucosé glacé. Pour préparer des tranches coronales, effectuez deux coupes afin d’enlever le cervelet et la partie rostrale du cerveau. Appliquez ensuite de la colle cyanoacrylate sur le plateau d'échantillonnage, puis fixez le bloc cérébral sur le plateau de manière à ce que la partie rostrale soit orientée vers le dispositif de découpe.Ensuite, appliquez quelques gouttes de ACSF au saccharose sur le cerveau et immergez lentement le plateau dans la chambre de découpe. Ajustez ensuite le rasoir à un angle de 15 degrés par rapport au plan horizontal. Découpez des tranches coronales du cerveau d'environ 500 micromètres dans le sens nasal avant d'atteindre la substance noire.Ensuite, ajustez l'épaisseur pour découper des tranches de 300 micromètres contenant la région d'intérêt. Séparez les tranches du bloc tissulaire à l’aide d’une très fine aiguille de perfusion fixée à une seringue, parallèlement au bord du rasoir. Puis, transférez les tranches dans la chambre de réserve à 34 degrés Celsius pendant une heure.Dans cette procédure, transférez une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement. Fixez la tranche au fond de la chambre d’enregistrement à l’aide d’un anneau en platine, et assurez-vous que la tranche est de bonne qualité, avec une surface lisse et uniforme. Ensuite, sélectionnez un neurone dont un dendrite s’étend sur une longue distance dans le même plan, et vérifiez que le dendrite d’intérêt peut être suivi jusqu’à un soma bien défini.Ensuite, remplir la pipette de patch avec la solution pour électrode. Pour réaliser le patch sur le dendrite en mode cellule attachée, identifier et focaliser sur une portion du dendrite. Appliquer une pression positive sur la pipette, puis l'abaisser à l'aide du micromanipulateur.Ensuite, positionnez la pipette près de la membrane et ajustez la pression afin de créer un petit affaissement. Puis, relâchez progressivement la pression au niveau de l'extrémité de la pipette et effectuez le patch du dendrite, tout en contrôlant la résistance de la pipette. Essayez d'obtenir une résistance d'étanchéité supérieure à un gigaohm, idéalement comprise entre trois et dix gigaohms, pour les enregistrements en configuration cellule-attachée.Ensuite, retirez la pipette de la membrane de quelques micromètres afin d'éviter toute déformation de la dendrite. Les courants d'action observés ici représentent les potentiels d'action spontanés des neurones de la substance noire. Pour supprimer les courants d'action, ajoutez des bloqueurs des canaux calciques et sodiques au ACSF.Appliquez ensuite un palier de tension de 90 millivolts, à partir d'un potentiel de maintien de zéro millivolt, afin d'induire le courant cationique activé par hyperpolarisation. À la fin de l'enregistrement, rompez le patch pour obtenir le mode cellule entière. Après cela, retirez lentement et délicatement la micropipette dendritique de la membrane neuronale pour obtenir un patch en configuration « outside-out ».Pour enregistrer à partir du soma correspondant en mode tout-cellule, localisez le soma correspondant à la dendrite. Abaissez une pipette ayant une résistance comprise entre cinq et dix mégohms, contenant une solution intracellulaire à base de potassium, jusqu'au corps cellulaire. Appliquez ensuite une brève pression négative à l'extrémité de la pipette pour rompre la membrane et ainsi obtenir le mode tout-cellule.Vérifiez l'identité du neurone en mode courant-clamp en appliquant de longs paliers de courant hyperpolarisants et dépolarisants, et laissez la biocytine provenant de la pipette diffuser le long des dendrites. Après 10 minutes, retirez la pipette pour obtenir un patch en configuration outside-out. Utilisez une série de courts déplacements latéraux vers le haut afin de favoriser la fermeture adéquate de la membrane cellulaire, une fois la pipette au-dessus de la tranche, pour sortir complètement de la chambre d’enregistrement.Conserver la coupe dans la chambre d’enregistrement pendant 15 minutes supplémentaires dans du ACSF standard afin de permettre l’équilibration de la biocytine et du neurone enregistré. Ensuite, transférer délicatement la coupe dans un flacon en verre brun de 25 millilitres contenant du ACSF standard pour l’histologie. Dans cette procédure, localiser approximativement le neurone marqué de façon fluorescente dans la coupe à l’aide de la fluorescence épiscopique.Examinez brièvement l'arborisation dendritique des neurones et localisez l'axone et le bourgeon axonal à l'aide d'un objectif 10X. Ensuite, passez au microscope confocal et sélectionnez la diode laser de 488 nanomètres pour exciter le neurone marqué. Suivez l'extension de l'axone et des dendrites selon l'axe Z et enregistrez des images successives afin d'obtenir une pile Z pour l'ensemble de la cellule.Réglez la résolution de l'axe Z et acquérez les images confocales de la cellule à faible et à forte augmentation. À la fin, ouvrez le fichier image du neurone à l'aide d'un logiciel d'imagerie. Comparez visuellement l'image de projection Z avec une image IR-DGC afin de localiser la position précise de la pipette de patch pendant l'enregistrement électrophysiologique.On voit ici l'image IR-DGC d'un neurone à dopamine et d'une pipette positionnée sur la dendrite proximale. Le tracé du courant montre la capacité des courants de fuite EN en réponse à une commande de tension de cinq millivolts, en configuration cellule-attachée, avec une résistance de scellement de cinq gigaohms. Un saut de tension hyperpolarisant, à partir d'un potentiel membranaire de zéro millivolt, a induit un courant cationique activé par hyperpolarisation à activation lente.Le tracé du courant a été inversé et ajusté à l’aide d’une fonction exponentielle unique, donnant une constante de temps de 632 millisecondes. Voici les réponses en tension du soma enregistré en configuration tout-cellule à des impulsions de courant hyperpolarisantes et dépolarisantes d’une seconde, en présence d’inhibiteurs des courants sodique et calcique dépendants de la tension, afin d’éliminer les potentiels d’action durant l’enregistrement en configuration cellule-attachée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée, à condition d’être effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'obtenir un tissu sain et des conditions d'enregistrement stables. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'immunohistochimie, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'identification du neurone enregistré. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la neurophysiologie d'explorer la fonction des propriétés ainsi que le rôle des canaux ioniques activés par le voltage dans les cellules excitables.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment enregistrer et examiner la répartition des courants traversant les canaux ioniques activés par le voltage dans les dendrites.

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Dans cette vidéo, nous démontrons comment appliquer une conductance dans un neurone dopaminergique enregistrés dans la configuration cellule entière dans les tranches de cerveau de rat. Cette technique est appelée le collier dynamique.

Application d&#39;une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

La technique de mesure ampérométrique la libération de dopamine à partir d'une seule cellule en détectant le courant oxydatif produit par oxydation spontanée dopamine. Pince simultanée de la tension et de la méthodologie ampérométrie révéler la relation mécanique entre l'ensemble «activité» du transporteur de la dopamine et le rôle régulateur de l'activité sur le transport inverse de la dopamine.

Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

Cette vidéo montre une technique d’enregistrement par patch-clamp à partir de la surface de la membrane dendritique. Cela permet d’examiner directement les propriétés électriques des dendrites et des canaux ioniques voltage-dépendants sous-jacents dans les neurones dopaminergiques.

Enregistrements patch-clamp de la dendrite d’un neurone dopaminergique dans une tranche de cerveau

Cette vidéo montre la procédure d’exécution d’enregistrements électrophysiologiques dans les neurones de la substance gélatinosa (SG) de coupes de moelle épinière, en utilisant des techniques de patch-clamp de cellules entières pour analyser les modèles de décharge des neurones. Cette méthode permet d’étudier les réponses neuronales aux stimuli dans les neurones SG de la moelle épinière.

Enregistrement par patch clamp de cellules entières dans un neurone de la substance gélatinosa d’une coupe de moelle épinière

Cette vidéo démontre l'examen de l'excitabilité sensorielle des neurones dans les ganglions de la racine dorsale à l'aide de la technique du patch clamp pour mesurer la rhéobase et le potentiel membranaire, en analysant les réponses des neurones aux injections de courant incrémentielles.

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Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Ce manuscrit décrit comment préparer des ganglions de la racine dorsale intacts pour les enregistrements par patch clamp. Cette préparation maintient le microenvironnement des neurones et des cellules gliales satellites, évitant ainsi les changements phénotypiques et fonctionnels observés à l’aide de neurones DRG dissociés.

Patch Clamp Recordings sur Intact ganglions rachidiens de rats adultes

Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

Ce protocole décrit les étapes critiques et les précautions nécessaires afin d’effectuer seule cellule transcription réverse multiplex PCR après patch clamp. Cette technique est une méthode simple et efficace pour analyser le profil d’expression d’un ensemble prédéterminé de gènes d’une cellule unique, caractérisé par des enregistrements de patch clamp.

Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

Les méthodes présentées ici fournissent des instructions détaillées pour la dissection, la dissociation, la culture et l’enregistrement patch-clamp à partir de neurones ganglionnaires vestibulaires et ganglionnaires spiralés de l’oreille interne.

Isolement et culture de somates ganglionnaires vestibulaires et spiralés de rongeurs nouveau-nés pour les enregistrements Patch-Clamp

Apprenez les enregistrements patch-clamp subcellulaires des dendrites de neurones dopaminergiques pour étudier les canaux ioniques. Cette technique permet d'analyser la fonction neuronale avec une haute résistance de scellement.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

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