Utilisation de l'électrophorèse capillaire à Quantifier acides organiques à partir de tissus végétaux: Un cas de test d'examen

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les concentrations d'acides organiques présents dans les tissus végétaux. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions en biochimie et en physiologie végétales, telles que l'impact des stimuli environnementaux sur la croissance racinaire, le développement des cultures, ou la qualité des aliments et des boissons. Les principaux avantages de cette méthode sont que la préparation des échantillons est minimale, qu'elle permet un traitement à haut débit, et que l'électrophorèse capillaire est plus économique que la spectrométrie de masse.

Bien que cette méthode soit utilisée pour élucider les réponses physiologiques des plantes, elle peut également être appliquée à la science des aliments et à la qualité alimentaire, où les acides organiques influencent de façon critique la saveur, la sécurité et la stabilité. Pour commencer, préparez des échantillons pour l'extraction des acides carboxyliques à chaîne courte, ou SCCA. Préparez un gramme de graine de café à la fois afin de s'assurer qu'il restera suffisamment d'échantillon après le traitement.

Pour obtenir une taille de particules uniforme assurant une efficacité maximale d'extraction du SCCA, prérefroidissez d'abord un mortier et un pilon à l'aide d'azote liquide. Ajoutez l'échantillon à un petit volume d'azote liquide dans le mortier. À l'aide d'une louche, ajoutez suffisamment d'azote liquide dans le mortier pour immerger complètement l'échantillon.

Ajoutez les échantillons difficiles à broyer, comme les graines de café vert, à l'azote liquide. Laissez-les congeler de 10 à 30 secondes avant le broyage. Cassez le tissu en fragments plus petits à l’aide d’un mouvement vertical de broyage.

Ensuite, terminez le broyage des tissus en effectuant un mouvement de rotation circulaire. Répétez deux fois supplémentaires les étapes de congélation et de broyage, de sorte que les échantillons soient broyés au total trois fois. Généralement, trois cycles successifs de broyage réduisent les échantillons en une poudre de consistance semblable à celle de la farine.

Transférez la poudre dans des flacons en verre ou des tubes micro-centrifuge de 1,5 ml. Commencez le traitement en aval immédiatement après broyage ou conservez les échantillons à -80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’extraction. Préparez des étalons authentiques pour les ACSC d’intérêt afin d’élaborer des solutions d’étalonnage externe et interne utilisées pour déterminer les concentrations en ACSC.

Pour les échantillons de café, inclure l'acide citrique, l'acide malique, l'acide acétique et l'acide lactique comme acides d'intérêt, et l'acide adipique comme étalon interne. Préparer une solution mère à 10 milligrammes par millilitre en ajoutant 100 milligrammes d'étalon à une fiole jaugée de 10 millilitres. Compléter la fiole jaugée jusqu'au trait de 10 millilitres avec de l'eau ultra-pure afin de dissoudre l'acide.

Transférez chaque solution mère dans un tube en verre propre de 15 millilitres, avec un bouchon revêtu de polytétrafluoroéthylène, et scellez avec un film de paraffine plastique. Les solutions mères peuvent être conservées dans des tubes scellés à quatre degrés Celsius pendant une semaine. Préparez 50 millilitres de la solution d'extraction SCCA en diluant la solution mère de l'étalon interne à 0,05 milligramme par millilitre dans de l'eau ultra-pure.

Procédez en ajoutant 250 microlitres de la solution mère de l'étalon interne à 49,75 millilitres d'eau. Préparez ensuite des échantillons pour la courbe d'étalonnage des SCCA d'intérêt. Utilisez un minimum de cinq points avec des concentrations situées dans la plage de réponse linéaire, couvrant les concentrations attendues des SCCA dans les échantillons.

Diluer chaque SCCA à la concentration déterminée dans de nouveaux tubes micro-centrifuge à l'aide d'eau ultra-pure, jusqu'à un volume de un millilitre. S'assurer que chaque point de concentration contient les quatre étalons d'acide ainsi que l'étalon interne à la concentration correcte. Retirer les échantillons à extraire du stockage et les placer sur de la glace.

Prélevez 100 milligrammes d'échantillon pour l'extraction SCCA. Mesurez une quantité d'échantillon aussi proche que possible de la masse cible afin de réduire la variabilité. Après avoir pesé chaque échantillon, transférez le tissu dans un tube micro-centrifuge propre de 1,5 millilitre.

Suivez attentivement la masse de chaque échantillon mesuré, car les quantités de SCCAs détectées seront normalisées en fonction de la masse de l'échantillon. Après avoir pesé tous les échantillons, ajoutez un millilitre de solution d'extraction à chacun des tubes d'échantillon. Conservez le même rapport entre la solution d'extraction et la masse du tissu pour toutes les extractions.

Mélanger soigneusement par vortex pendant 10 secondes. Laisser les échantillons reposer à température ambiante pendant une heure. Pendant cette heure, mélanger chaque tube toutes les 15 minutes par vortex pendant 10 secondes.

Après une heure d'extraction, mélangez les échantillons une dernière fois et transférez les tubes à échantillons dans une micro-centrifugeuse. Centrifugez les échantillons à quatre degrés Celsius, à 10 000 × g pendant 10 minutes, afin de précipiter la matière solide. Pour filtrer les échantillons, préparez des filtres en disque montés sur une seringue, en veillant à ce que chaque filtre soit correctement fixé à la seringue.

Préparez une seringue équipée d'un filtre à disque pour chaque échantillon à analyser, y compris les échantillons de la courbe standard. Filtrez directement les surnageants dans un tube de micro-centrifugeuse propre. Après filtration, fermez le tube contenant le filtrat et jetez l'appareil de filtration à seringue.

Transférez un millilitre d’échantillon dans chaque flacon d’électrophorèse capillaire, ou flacon CE, en prenant soin d’éviter que l’échantillon ne gicle dans le col du flacon. Après le transfert de l’échantillon, placez un bouchon CE sur chaque flacon. Configurez l’analyse de détection SCCA comme décrit dans le protocole écrit.

Placer les vials contenant les points de la courbe standard et les vials contenant les échantillons à analyser dans le plateau d'entrée, comme décrit dans les instructions du fabricant. Noter la position de chaque vial pour la programmation de l'auto-échantillonneur. Après la mise en condition décrite dans le protocole, lancer la séparation des échantillons en ouvrant le menu Contrôle dans le logiciel, puis en sélectionnant Exécuter la séquence.

Surveillez les barrettes de photodiodes, ou barrettes PDA, afin de garantir une séparation adéquate. Observez le premier tracé et assurez-vous qu’il présente une ligne de base plate et que les pics individuels des acides soient bien séparés. Pour intégrer les pics de l’échantillon, ouvrez le premier fichier et configurez les étapes d’intégration automatique de manière à exclure les trois premières minutes de l’analyse.

Dans le même menu, définir les critères de sélection des pics à une largeur de pic minimale de 50 unités et à une surface de pic de 100 unités, afin d'obtenir un niveau modérément élevé de sélectivité, permettant de distinguer les pics acides du bruit de fond sur le tracé. Effectuer l'analyse des données comme décrit dans le protocole textuel. On montre ici une comparaison de tracés PDA mettant en évidence un échantillon surchargé.

Lorsque la concentration de l'analyte augmente, la géométrie individuelle des pics peut commencer à devenir asymétrique. À 0,05 milligramme par millilitre, l'acide acétique présente un pic bien défini et symétrique par rapport à un axe médian. Lorsque la concentration d'acide acétique augmente jusqu'à 0,07 ou 0,10 milligramme par millilitre, le pic devient asymétrique et un élargissement de la queue du pic apparaît.

Cet aplatissement de la queue du pic est un bon indicateur d'une surcharge de l'échantillon. On voit ici des tracés PDA exemples montrant les acides organiques présents dans des échantillons de café vert. Les échantillons de café vert ont été dilués au 1:10 avant leur chargement dans les vials CE.

Les acides d'intérêt comprennent l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide lactique, l'acide malique et l'étalon interne, l'acide adipique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien moudre les échantillons afin d'obtenir une consistance uniforme et de pipeter soigneusement les échantillons, afin de maximiser la reproductibilité et de minimiser les erreurs expérimentales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de quantifier les acides organiques provenant d'échantillons végétaux à l'aide de l'électrophorèse capillaire, ou CE. Vous devriez également être capables de moudre des échantillons végétaux, d'extraire les acides organiques et de préparer les extraits végétaux en vue d'une analyse CE en aval.