Name: Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Apprenez une cytométrie de flux fiable pour analyser les fonctions des cellules NK, y compris la dégranulation et la production de cytokines. Cette méthode optimisée pour les petits échantillons convient aux patients pédiatriques et immunodéficients.

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Les auteurs ont été soutenus par l’Aide allemande contre le cancer (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe ; UE), le LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (UE, ST) financé par le ministère de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et des Arts de la Hesse (Allemagne (III L 4- 518/17.004) et par la « Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung », Francfort, Allemagne (UE). BJ a été financé par une bourse postdoctorale Mildred Scheel de la Fondation Dr. Mildred Scheel pour la recherche sur le cancer. ST a été fondée grâce à une bourse postdoctorale GO-IN (PCOFUND-GA-2011-291776). Les auteurs remercient Becton Dickinson (BD) d’avoir fourni les analyseurs de cytométrie en flux FACSCanto II et Canto10c utilisés dans cette étude.

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<li>Jacobs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+Cell+Subgroups%2C+Phenotype%2C+and+Functions+After+Autologous+Stem+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation.</a> Front. Immunol. 6, 583(2015).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li>
<li>Theorell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+viable+quantification+of+inside-out+signals+for+LFA-1+activation+in+human+cytotoxic+lymphocytes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).</li>
<li>Brander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+human+NK+cell-mediated+cytotoxicity+by+exposure+to+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+NK+cells+from+human+blood+with+the+RosetteSep+kit+from+StemCell+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies.</a> J Vis Exp. (8), e326(2007).</li>
<li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).</li>
<li>Baginska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+degradation+by+autophagy+decreases+tumor+cell+susceptibility+to+natural+killer-mediated+lysis+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li>
<li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serglycin+determines+secretory+granule+repertoire+and+regulates+NK+cell+and+CTL+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity.</a> FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).</li>
<li>Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+clonal+analysis+of+NK+cell+effector+functions+by+multi-parameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).</li>
<li>Björkström, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+NKG2A%2C+KIR%2C+and+CD57+define+a+process+of+CD56dim+NK-cell+differentiation+uncoupled+from+NK-cell+education%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education.</a> Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).</li>
<li>Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+requirement+for+induction+of+natural+cytotoxicity+and+intersection+of+activation+signals+by+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors.</a> Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).</li>
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<li>Salles, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+study+results+of+the+type+II+glycoengineered+humanized+anti-CD20+monoclonal+antibody+obinutuzumab+%28GA101%29+in+B-cell+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients.</a> Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).</li>
<li>Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR%2FHLA+interactions+negatively+affect+rituximab-+but+not+GA101+%28obinutuzumab%29-induced+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).</li>
<li>Hsu, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunostimulatory+effect+of+lenalidomide+on+NK-cell+function+is+profoundly+inhibited+by+concurrent+dexamethasone+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy.</a> Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).</li>
<li>Salih, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCR%2FABL-inhibitors+imatinib%2C+nilotinib+and+dasatinib+differentially+affect+NK+cell+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity.</a> Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).</li>
<li>Benson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+1+trial+of+the+anti-KIR+antibody+IPH2101+in+patients+with+relapsed%2Frefractory+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma.</a> Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).</li>
<li>Vey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+1+trial+of+the+anti-inhibitory+KIR+mAb+IPH2101+for+AML+in+complete+remission%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission.</a> Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).</li>
<li>Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell-directed+therapies%3A+moving+from+unexpected+results+to+successful+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies.</a> Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode décrite est une approche facile, rapide et fiable pour étudier les fonctions des cellules NK à partir d&#39;échantillons de sang total de donneurs sains ou de patients. Ce procédé offre le grand avantage de purifier directement les cellules NK dans le sang total, en évitant le temps centrifugation en gradient de densité, qui est obligatoire pour de nombreux autres procédés de purification 15. En outre, il nécessite une plus petite taille de l&#39;échantillon par rapport à des procédés d&#39;enrichi...

Dans le cadre du système immunitaire inné tueuses naturelles (cellules NK) contribuent à la première ligne de défense contre les cellules infectées par le virus ou malignement transformées. Un système de récepteurs inhibiteurs et activateurs qui leur permet de distinguer entre les cellules saines et transformées sans apprêt préalable de l&#39;antigène, contrairement aux lymphocytes T. Lors de la rencontre de la cellule cible les cellules NK libèrent le contenu de leurs granules cytotoxiques (par exemple, perforine, granzymes) dans la synapse immunitaire de tuer leur cible. En outre, les cellules NK produisent et sécrètent différents types de cytokines (par exemple, gamma interferon: IFN-γ, facteur de nécrose tumorale α: le TNF-α) et de chimiokines (par exemple, macrophage inflammatoire protéine-1β: MIP-1 ß) sur la cellule cible l&#39; interaction ou la stimulation des cytokines 1. les fonctions des cellules NK suffisantes telles que la cytotoxicité, la chimiokine et la production de cytokines ont un impact important sur le sort des diverses dissoulage. Les patients leucémiques montrent une augmentation des taux de rechute si elles présentent un profil défectueux des cellules NK au moment du diagnostic consistant en une production réduite de l&#39; IFN-γ et une expression réduite d&#39;activation des cellules NK 2 récepteurs. Un redressement rapide du nombre de cellules NK et la fonction , y compris la production de cytokines lors de l&#39; interaction de la cellule cible est associée à une rechute réduite et l&#39; amélioration de taux de survie chez les patients recevant souches allogéniques transplantation de cellules 3. En outre, lors de l&#39; initiation de la thérapie par interféron chez les patients infectés par le virus de l&#39; hépatite C dont la capacité de dégranulation des cellules NK périphériques est plus forte dans les premiers répondeurs que chez les non-répondeurs 4. Le nombre de cellules NK (&gt; 80 / ul) au jour 15 après la transplantation de cellules souches autologues (autoSCT) chez les patients souffrant d&#39; un lymphome ou un myélome multiple sont prédictifs d&#39;une amélioration sans progression et la survie globale 5. Chez les patients souffrant de mélanome l&#39;expression de la cellule T et immunoglobulin- mucine domaine containing molécule-3 (TIM-3), une protéine de régulation immunitaire sur les cellules NK, est en corrélation avec stade de la maladie et le pronostic 6. Les scientifiques ont suivi les fonctions des cellules NK au cours des dernières décennies. L&#39;analyse initiale de cytotoxicité des cellules NK contre les cellules tumorales sans amorçage préalable a été traitée en utilisant un dosage 51 Cr-release 7. Plus récemment, des chercheurs ont développé un procédé non radioactif pour évaluer la cytotoxicité des cellules NK expansées 8. Cytokine et chimiokine production a souvent été évaluée en utilisant un dosage immuno (ELISA) techniques liés aux enzymes 9,10. Au cours des dernières décennies, ces méthodes ont été complétés par des essais à base de cytométrie en flux. L&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de la protéine de transport (par exemple, la monensine et la brefeldine A) et des procédés de perméabilisation cellulaire en combinaison avec des protocoles de coloration de surface classiques ont permis aux chercheurs d&#39;étudier la chimiokine et la production de cytokines dans différents ganglions spécifiquesous - ensembles de ocyte (par exemple, T, cellules NK B ou) 11. En outre, des dosages à base de cytométrie de flux ont été développés pour surveiller T et la cytotoxicité des cellules NK. En 2004 , Alter et al. , Décrit l&#39;expression de surface de la protéine associée au lysosome CD107a (Lampe 1) sur les cellules NK à la rencontre de la cellule cible en tant que marqueur pour la dégranulation des granules 12 cytotoxiques. Etant donné qu&#39;une large gamme de différents fluorochromes et les cytomètres de flux à canaux multiples sont disponibles de nos jours, il est devenu possible de surveiller simultanément les différentes fonctions cellulaires (NK cytotoxicité, de cytokines et de production de chimiokine) dans différents sous-ensembles de cellules NK. Cela devient particulièrement important dans les situations où la taille de l&#39; échantillon est limitée, par exemple, dans des biopsies ou des échantillons de sang de patients atteints de leucopénie. Pour tester les fonctions globales de cellules NK, les essais à base de cytométrie de flux différents peuvent être efficacement combinés. Theorell et al. Les cellules NK stimulées de headonateurs lthy avec la lignée cellulaire tumorale K562 et analysé NK dégranulation cellulaire, signal à l&#39; intérieur-out et chimiokine production via cytométrie en flux 13. Récemment des sous-groupes de cellules NK, phénotypes et fonctions chez les patients de tumeur pendant autoSCT ont été analysées à l&#39;aide de flux tests basés sur la cytométrie. Il a été démontré que les cellules NK ont été capables de produire des cytokines et dégranulent / chimiokines sur la reconnaissance des cellules tumorales à des moments très tôt après 11 autoSCT. Ici, un protocole est décrit pour évaluer les fonctions des cellules NK lors de l&#39;interaction avec des cellules tumorales y compris la capacité de la dégranulation, la chimiokine et la production de cytokines à l&#39;aide d&#39;un flux de dosage basé sur une cytométrie qui permet de contrôler les fonctions des cellules NK dans les différents sous-ensembles simultanément.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 + glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>6187-044</td><td></td></tr><tr><td>péniciline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Round Bottom Tube</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>inactivé par la chaleur avant</td></tr><tr><td>utilisation Fiole en T</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690195</td><td></td></tr><tr><td>tumeur K562 lignée cellulaire</td><td>DSMZ GmbH</td><td>ACC 10</td><td></td></tr><tr><td>tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK)</td><td>fabriqué en interne</td><td>/</td><td>les composants sont énumérés dans le texte</td></tr><tr><td>Eau distillée : Ampuwa Sp&uuml ; ll&ouml ; sung 1,000 ml Plastipur</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1088813</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40R Centrifugeuse</td><td>Heraeus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Tubes collecteurs</td><td>de sang Sarstedt</td><td>386453</td><td>S-Monovette 7,5 ml, K3EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Milieux hématopoïétiques (XVIVO)</td><td>Lonza Group Ltd</td><td>BE04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>sérum humain</td><td>DRK Blutspendedienst, Francfort/M&nbsp ;</td><td>/</td><td>donneurs sains du groupe sanguin AB ; chaleur inactivée avant utilisation</td></tr><tr><td>Chambre de comptage améliorée Neubauer, ligne brillante</td><td>Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.</td><td>0640030/ 1110000</td><td></td></tr><tr><td>solution de bleu de trypan (0,4 %)</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>3 % d’acide acétique avec bleu de méthylène</td><td>Stemcell Technologies&nbsp ;</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Microplaques transparentes à fond en V traitées TC</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96 Fond bien rond non traité Microplaques</td><td>Corning&nbsp ;</td><td></td><td></td>351177</tr><tr><td>DPBS (Ca2+- et Mg2+-free)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>524400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ionomycine&nbsp ;</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1566-5</td><td></td></tr><tr><td>interleukin 15 (IL-15)</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (IL-2)&nbsp ;</td><td>Novartis Pharma</td><td>730523</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Stop, inhibiteur du transport des protéines (contenant du monensin)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Ce produit peut être utilisé en combinaison ou à la place de Golgi Plug. La meilleure combinaison pour le cadre expérimental souhaité doit être testée.</td></tr><tr><td>Golgi Plug, inhibiteur de transport de protéines (contenant de la Brefeldin A)</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>AppliChem</td><td>UN2209</td><td></td></tr><tr><td>saponine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>cytomètre en flux : Canto10C</td><td>BD Biosciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Bloc graphique</td><td>Graph Pad Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress Séparateur</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp ;</td><td>130-098-308</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress NK kit d’isolation</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp ;</td><td>130-098-185</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress Kit de déplétion érythrocytaire, humain</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp ;</td><td>130-098-196</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de tube MACSmix&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp ;</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>CD3 anti-humain APC</td><td>Biolegend</td><td>300412</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD3 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560366</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD14 PerCP</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp ;</td><td>130-094-969</td><td></td></tr><tr><td>CD14 V450</td><td>BD</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>CD16 ( (en anglais) CD16 (en</td><td></td> anglais) (en anglais) CD16 (en anglais) <td>302008</td><td></td></tr> (en anglais) <tr><td>CD16 (en anglais) PerCP</td><td>Biolegend</td><td>302029</td><td></td></tr><tr><td>(en anglais) CD19 (</td><td></td>en anglais) (en anglais) <td>302216</td><td></td></tr><tr><td>CD19 (en anglais) CD19 (en</td><td></td> anglais) et en anglais, <td>560353</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD45 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563204</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD56 FITC</td><td>Biolegend</td><td>345811</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD107a PE</td><td>Biolegend</td><td>328608</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain IFN-&gamma ; AF-647</td><td>BD Biosciences</td><td>557729</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain MIP-1&beta ; APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>561280</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Kit de viabilité fixable</td><td>Biolegend</td><td>423113</td><td>marqueur de cellules mortes fixable</td></tr></tbody></table>

cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules nk fonctions

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont une partie importante du système de surveillance immunitaire des tumeurs humaines. Les cellules NK sont capables de faire la distinction entre les cellules saines et les cellules infectées par le virus ou transformées de manière maligne en raison d’un ensemble de récepteurs inhibiteurs et activateurs codés par la lignée germinale. Lors de la reconnaissance d’un virus ou d’une cellule tumorale, une variété de fonctions différentes des cellules NK sont initiées, y compris la cytotoxicité contre la cellule cible, ainsi que la production de cytokines et de chimiokines, conduisant à l’activation d’autres cellules immunitaires. Il a été démontré que des fonctions précises des cellules NK sont cruciales pour le résultat du traitement de différentes infections virales et maladies malignes. Ici, une méthode simple et fiable est décrite pour analyser différentes fonctions des cellules NK à l’aide d’un test basé sur la cytométrie en flux. Les fonctions des cellules NK peuvent être évaluées non seulement pour l’ensemble de la population de cellules NK, mais également pour différents sous-ensembles de cellules NK. Cette technique permet aux scientifiques d’étudier facilement les fonctions des cellules NK chez des donneurs sains ou des patients afin de révéler leur impact sur différentes tumeurs malignes et de découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques.

<html> La stratégie d&#39;ouverture de porte pour analyser la dégranulation, la production de cytokines et chimiokines de l&#39; ensemble de la population de cellules NK et de trois sous - ensembles de cellules NK différentes sont illustrés sur la figure 1. Des résultats représentatifs d&#39;un donneur sain sont illustrés sur la figure 2. Les cellules NK sans stimulation produites ni IFN-γ , ni...

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

L'objectif général de cette procédure est de surveiller les fonctions des cellules NK à l'aide d'un test basé sur la cytométrie en flux. Les cellules tueuses naturelles jouent un rôle essentiel dans l'évolution de diverses infections virales et maladies malignes. Afin de mieux évaluer les fonctions des cellules NK, notre laboratoire a perfectionné un test basé sur la cytométrie en flux qui peut être utilisé à la fois dans la recherche scientifique et les évaluations cliniques.Nous avons optimisé le protocole afin de permettre l'analyse de faibles échantillons de cellules NK, ce qui est essentiel pour son utilisation en pédiatrie et chez les patients immunodéprimés. Un avantage supplémentaire de cette technique est la possibilité de mesurer les fonctions des cellules NK non seulement au sein de la population entière de cellules NK, mais également dans différents sous-populations de cellules NK. Pour isoler les cellules NK, commencez par mélanger le volume approprié de solution de cocktail d'isolement de cellules NK avec six à dix millilitres de sang total périphérique contenant de l'EDTA provenant d'un patient, en effectuant plusieurs inversions.Ensuite, poursuivre l'homogénéisation

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre l’activité lytique des cellules tueuses naturelles contre les cellules cibles colorées par fluorescence. La méthode permet de mesurer la cytotoxicité induite par les cellules NK en colorant les cellules mortes et en utilisant un cytomètre en flux pour quantifier les cellules cibles vivantes et mortes.

Préparation d’un échantillon pour un test de cytotoxicité à médiation cellulaire tueuse naturelle pour l’analyse cytométrique en flux

Cette vidéo présente une technique basée sur la cytométrie en flux utilisant deux fluorochromes pour identifier les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes T γδ, les lymphocytes B, les cellules tueuses naturelles (NK) et les monocytes dans les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC). Lors de l’incubation des cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome contre les marqueurs de surface, les sous-ensembles cellulaires sont identifiés à l’aide d’une stratégie optimale...

Un test de cytométrie en flux pour identifier des sous-ensembles de cellules immunitaires dans des cellules mononucléées du sang périphérique

Ce protocole décrit un test de cytotoxicité sensible basé sur des cellules. En énumérant la diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+ cibles vivantes en présence d’un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ effecteurs, ce test permet d’évaluer directement l’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.

Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

Ce travail décrit un flux de travail avancé pour la détermination précise et rapide du nombre de cellules NK (Natural Killer) et de la cytotoxicité des cellules NK dans des échantillons de sang humain.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Nous présentons ici un protocole de cytométrie en flux pour identifier les CD4+ et CD8+ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et monocytes dans le sang périphérique humain en utilisant seulement deux fluorochromes au lieu de sept. Avec cette approche, cinq marqueurs additionnels peuvent être enregistrées sur la plupart des cytomètres.

Discrimination des sept sous-ensembles de cellules immunitaires par deux-fluorochrome cytométrie en flux

L’évasion de l’éradication des cellules par le tueur naturel (NK) par les cellules cancéreuses est importante pour l’initiation et la progression du cancer. Ici, nous présentons deux protocoles non radioactivité-basés pour évaluer la cytotoxicité cellule-négociée de NK vers les cellules hépatiques de tumeur. En outre, un troisième protocole est présenté pour analyser la migration des cellules NK.

Mesure de la cytotoxicité et de la migration à médiation cellulaire naturelle dans le contexte des cellules tumorales hépatiques

Un protocole d’étude des événements induits par FcγRIIIa par des anticorps thérapeutiques dans des cellules tueuses naturelles humaines est décrit ici. Cette plate-forme de stimulation artificielle permet d’interroger les fonctions effectrices en aval telles que la dégranulation, la production de chimiokines / cytokines et les voies de signalisation médiées par les parties FcγRIIIa et Fc des anticorps impliqués dans la liaison.

Évaluation des événements des cellules tueuses naturelles humaines provoquées par l’engagement de FcγRIIIa en présence d’anticorps thérapeutiques

Nous présentons deux protocoles de souillure différents pour la détection du ligand NKG2D (NKG2DL) dans les échantillons humains primaires de leucémie myéloïde aiguë (AML). La première approche est basée sur une protéine de fusion, capable de reconnaître tous les ligands connus et potentiellement encore inconnus, tandis que le second protocole repose sur l’ajout de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.

Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Ce protocole fournit un flux de travail standardisé in vitro. pour une mesure cohérente de la cytotoxicité naturelle, médiée par les récepteurs antigéniques chimériques et dépendante des anticorps des cellules humaines naturelles tueuses grâce à l’imagerie des cellules vivantes et à la cytométrie en flux.

Quantification de la cytotoxicité des cellules NK potentialisée par des récepteurs antigéniques chimériques et des anticorps thérapeutiques à l’aide d’imagerie à cellules vivantes et de cytométrie en flux

Apprenez une cytométrie de flux fiable pour analyser les fonctions des cellules NK, y compris la dégranulation et la production de cytokines. Cette méthode optimisée pour les petits échantillons convient aux patients pédiatriques et immunodéficients.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

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