Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

L’objectif global de cette procédure est de surveiller les fonctions des cellules NK à l’aide d’un test basé sur la cytométrie en flux. Les cellules tueuses naturelles sont cruciales pour l’issue de diverses infections virales et maladies malignes. Pour mieux surveiller les fonctions des cellules NK, notre laboratoire a développé un test basé sur la cytométrie en flux qui peut être utilisé à la fois dans la recherche scientifique et les évaluations cliniques.

Nous avons optimisé le protocole pour permettre l’analyse de petites tailles d’échantillons de cellules NK, ce qui est essentiel pour son utilisation en pédiatrie et pour les patients immunodéficients. Un avantage supplémentaire de cette technique est la possibilité de mesurer les fonctions des cellules NK non seulement au sein de l’ensemble de la population de cellules NK, mais également dans différents sous-ensembles de cellules NK. Pour isoler les cellules NK, commencez par mélanger le volume approprié de solution de cocktail d’isolement des cellules NK avec six à 10 millilitres de sang total périphérique EDTA d’un patient par plusieurs inversions.

Ensuite, homogénéisez davantage l’échantillon sur un rotateur de tube pendant cinq minutes à température ambiante. Placez ensuite le tube dans un séparateur magnétique pendant 15 minutes dans des conditions stériles, en veillant à ce que l’étiquette du tube soit orientée vers l’arrière de l’aimant pour faciliter la visibilité de la ligne de séparation. À la fin de la séparation, transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres et portez le volume final à 15 millilitres avec un milieu complet.

Lavez les cellules par centrifugation et remettez le granulé en suspension dans un millilitre de milieu complet frais. Ensuite, comptez les cellules et ajustez le volume à une concentration d’au moins deux fois 10 à la quatrième cellules NK pour 100 microlitres en milieu complet. Pour stimuler les cellules NK isolées, mélangez d’abord doucement en pipetant au moins cinq fois et aliquote 100 microlitres de cellules dans les puits appropriés d’une plaque à fond en V de 96 puits.

Éteignez la lumière et ajoutez l’anticorps anti-CD107a dans chaque puits des cellules NK. Ensuite, mélangez soigneusement une aliquote de cellules tumorales K562 à deux fois 10 à quatre cellules par volume de 100 microlitres en pipetant au moins cinq fois et transférez 100 microlitres de cellules tumorales à chaque puits bien planifié pour la stimulation. Un pipetage précis et la préparation d’un rapport cible effecteur un-à-un sont d’une importance capitale pour l’évaluation précise de la fonction des cellules NK.

Ensuite, ajoutez de l’IL-2 et de l’IL-15 dans les puits de stimulation et mélangez tous les puits en pipetant au moins cinq fois. Incuber la plaque à l’abri de la lumière pendant trois heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après la première heure avec la lumière éteinte, ajoutez une solution inhibitrice de transport de protéines fraîchement préparée dans chaque puits en mélangeant soigneusement et remettez la plaque dans l’incubateur.

À la fin de l’incubation, mélangez soigneusement les co-cultures et transférez-les dans leurs tubes de cytométrie en flux correspondants. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage dans chaque tube pour la centrifugation et remettez les granulés en suspension dans 99 microlitres de PBS plus un microlitre de marqueur de cellules mortes fixable par échantillon. Mélangez les cellules par vortex, suivi d’une incubation de 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans un millilitre de tampon de lavage et remettez les granulés en suspension dans 84 microlitres de tampon de lavage plus 16 microlitres du cocktail d’anticorps de surface cellulaire approprié. Mélangez les échantillons par vortex et incubez pendant 20 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules dans un millilitre de tampon de lavage et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres d’une solution de fixation à froid.

Mélanger par vortex, suivi de 10 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Lavez maintenant les cellules dans un millilitre de tampon de lavage et remettez les granulés en suspension dans 90 microlitres de tampon de perméabilisation. Colorer avec 10 microlitres des anticorps intracellulaires appropriés et mélanger par vortex.

Après 30 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius, lavez les cellules deux fois dans un millilitre de tampon de perméabilisation frais. Ensuite, mettez les échantillons en suspension dans 400 microlitres de tampon de perméabilisation frais. Bien mélanger par vortex et placer les cellules sur de la glace jusqu’à leur analyse par cytométrie en flux.

Dès que possible, transférez tous les tubes dans le cytomètre en flux et commencez l’acquisition des données. Ici, des stratégies de contrôle pour analyser la dégranulation et la production de cytokines et de chimiokines de l’ensemble de la population de cellules NK ainsi que de trois sous-ensembles différents de cellules NK sont illustrées. Les cellules NK non stimulées provenant de donneurs sains n’ont produit ni interféron gamma ni MIP-1 bêta et n’expriment pas CD107a à leur surface.

En revanche, les cellules NK stimulées par des cellules tumorales et des cytokines ont produit des quantités significatives d’interféron gamma intracellulaire et de MIP-1 bêta, plus de 20 % des cellules présentant une dégranulation lors de l’interaction entre les cellules tumorales, comme l’indique leur expression à la surface des cellules CD107a. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’être précis dans le placage des cellules NK et des cellules tumorales K562.

Pour maintenir le rapport cible de l’effecteur sélectionné, le comptage doit être aussi précis que possible. Cette procédure flexible peut être facilement modifiée. Par exemple, les cellules NK de la population PBMC peuvent être analysées ou différents anticorps peuvent être utilisés pour vérifier d’autres marqueurs d’intérêt.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier, de stimuler et de marquer les cellules NK pour surveiller leur fonction à l’aide d’un test basé sur la cytométrie en flux. N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines et cibles est potentiellement dangereux et que des précautions de sécurité, telles que le port d’un équipement de protection individuelle approprié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.