Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

L'objectif général de ce test in vivo avec gel matriciel est d'étudier l'interaction entre les cellules endothéliales et les parasites. Ce test de matrigel est conçu pour aider les chercheurs à analyser les étapes majeures de l'androgenèse. Il permettra également d'identifier les voies de signalisation responsables des principales étapes de la formation des vaisseaux sanguins, ainsi que les gènes dont le dysfonctionnement peut entraîner des troubles vasculaires et d'autres anomalies de l'androgenèse.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle nous permet d'étudier la formation des vaisseaux sanguins in vivo impliquant à la fois les cellules endothéliales et leurs cellules de soutien, les péricytes. Pour commencer, cultivez des cellules endothéliales humaines et des cellules parasitaires sur des plaques de 100 millimètres avec 10 millilitres du milieu approprié. Changez le milieu toutes les deux à trois journées jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 %.

Pour préparer la solution de gel matriciel à mélanger avec les cellules, décongelez un stock de gel matriciel toute une nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez des aliquotes de 1,5 millilitre à conserver à long terme à moins vingt degrés Celsius, ou à quatre degrés Celsius pendant un maximum de deux semaines. Chaque prise expérimentale nécessitera 200 microlitres de gel matriciel.

Ainsi, un tube approvisionné peut alimenter six bouchons avec un excès de 25 %. Préparez chaque aliquot requis en ajoutant 15 microlitres de stock décongelé de bFGF à 100x. Mélangez le bFGF en solution par pipetage, puis incubez sur de la glace pendant au moins 30 minutes avant d'ajouter les cellules.

À ce stade, refroidissez quelques seringues d'insuline de 1 ml à l'aiguille de calibre 28 pour les injections. Pour recueillir les cellules à partir des plaques de culture, retirez le milieu et lavez les cellules une fois avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez un millilitre de solution de trypsine et remettez les plaques à l'incubateur pendant une minute.

Ensuite, pipetez deux millilitres de milieu de culture sur les plaques pour détacher les cellules et recueillir le milieu dans un tube de 15 millilitres. Vérifiez maintenant la concentration des prélèvements à l’aide d’un hématimètre. Préparez ensuite des aliquotes de cellules dans des tubes de 15 millilitres.

Une combinaison d'un million de cellules endothéliales et de 200 000 parasites est utilisée ici pour le groupe expérimental. Ensuite, centrifuger les aliquotes cellulaires à 400g pendant cinq minutes. Puis, ajouter le volume calculé de gel matriciel au culot cellulaire, et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette afin d’éviter la formation d’écume, car les bulles d’air ne peuvent pas être injectées.

Maintenant, conservez les préparations sur de la glace jusqu'à ce que les souris soient prêtes à être injectées. Après avoir anesthésié une souris avec de l'isoflurane et confirmé l'état d'anesthésie par une pincée du orteil, fixez la souris au système non réutilisable fournissant de l'isoflurane et placez-la sur le tapis chauffant, le côté ventral vers le bas. Ensuite, retirez environ un centimètre carré de poils des deux régions latérales postérieures.

Ensuite, nettoyez la peau exposée à l’aide d’alcool à 70 %. Puis, chargez un millilitre de la solution cellulaire préparée dans une seringue refroidie, ce qui suffit pour quatre implants. Pour effectuer une injection, soulevez la peau du dos afin de localiser l’espace sous-cutané.

Ensuite, injecter lentement 200 microlitres de manière uniforme dans l'espace sous-cutané postérieur à la cage thoracique, puis retirer lentement l'aiguille afin d'éviter toute fuite. Après l'injection, une bosse se formera au site d'injection. Nettoyer le site avec de l'alcool, puis délimiter la bosse à l'aide d'un marqueur indélébile afin de pouvoir la retrouver ultérieurement.

Ensuite, répétez la procédure d'injection de l'autre côté de la souris. Veillez à injecter toutes les cellules dans les trois minutes, sinon elles commenceront à adhérer à la seringue. L'étape d'injection est cruciale et doit être réalisée avec soin afin de garantir la formation d'un bouchon de gel matriciel entre les couches cutanée et musculaire, de sorte que ce bouchon conserve une bonne forme et ne devienne pas diffus.

Avant de passer à l'injection de la souris suivante, laissez la souris injectée rester sur le coussin chauffant pendant une minute afin de permettre au gel de polymériser. Après l'euthanasie, placez la souris sur le plateau opératoire. Après avoir retiré tout poil repoussé au site d'injection, repérez les lignes de marquage qui identifient l'emplacement du bouchon.

Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins, pratiquez une incision le long de la limite marquée du prélèvement, perpendiculairement à la peau et jusqu’au muscle sous-jacent. Découpez soigneusement tout autour de la périphérie de la limite marquée. Puis retirez le prélèvement en le maintenant pris en sandwich entre les couches de peau et de muscle.

Rincez immédiatement le fragment dans un petit bécher contenant du PBS pour éliminer le sang. Ensuite, placez l'ensemble du fragment dans un tube de 50 millilitres contenant 25 millilitres de paraformaldéhyde à 4 %. Laissez fixer à température ambiante pendant 24 heures sans agitation.

Le lendemain, transférer les prélèvements dans 25 millilitres d'éthanol à 70 % pendant 24 heures. Ensuite, procéder à l'inclusion en paraffine. Des sections de prélèvements ne contenant que des cellules endothéliales montrent que certains vaisseaux ne sont pas perfusés par le sang de l'hôte après 14 jours in vivo.

En revanche, les implants contenant à la fois des cellules endothéliales et des parasites présentent de nombreux vaisseaux perfusés après 14 jours in vivo. Ces implants contiennent des cellules positives au marquage de l'actine des muscles lisses, visibles en rouge, situées immédiatement adjacentes à des cellules endothéliales positives pour le CD31, visibles en vert. Ainsi, les parasites pourraient jouer un rôle important dans la formation de nouveaux vaisseaux sanguins.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment appliquer cette puissante technique in vivo pour étudier la formation des vaisseaux sanguins en utilisant plusieurs types cellulaires. Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs pour explorer divers sujets de biologie vasculaire dans des modèles murins. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la PCR quantitative et le immunoblotting Western, peuvent également être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les modifications de l'expression génique et les analyses protéomiques.

Cette technique puissante permettra à l'investigateur d'étudier in vivo l'interaction entre les cellules endothéliales et les parasites durant la formation des vaisseaux sanguins, une étape clé de l'androgénèse. Cette technique puissante permettra également à l'investigateur d'étudier d'autres interactions entre cellules qui sont pertinentes pour comprendre les maladies vasculaires telles que l'hypertension pulmonaire, entre autres.