Name: Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Apprenez à étudier les interactions endothélium-péricytes humaines in vivo avec l'essai de plug de gel matriciel chez la souris. Cette méthode permet d'identifier les voies de signalisation impliquées dans la formation des vaisseaux sanguins.

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Dr. K. Yuan a reçu une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (15SDG25710448) et le prix Proof of Concept Award de la Pulmonary Hypertension Association (SPO121940). Le Dr V. de Jesus Perez a reçu une bourse de développement de carrière de la Fondation Robert Wood Johnson, une bourse HL105884-01 du NIH K08, une bourse de la Pulmonary Hypertension Association, une bourse de recherche biomédicale de l’American Lung Association et une bourse de recherche translationnelle et de médecine appliquée de l’Université de Stanford.

Déclaration d&#39;éthique: Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l&#39;Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité à l&#39;école de médecine de l&#39;Université de Stanford. NOTE: Les animaux sont sous anesthésie avec 3% d&#39; isoflurane de vaporisateur et 3% fourniture de gaz O 2. L&#39;utilisation de vétérinaire pommade sur les yeux peut aider à prévenir la sécheresse sous anesthésie. 1. Préparation des cellules <ol><li> Cultivez endothéliales et cellules péricytes cultures humaines dans des plaques de 100 mm avec 10 ml du support approprié. Remplacer 10 ml de milieu frais tous les 2 - 3 jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent 80% de confluence. <ol><li> la culture de cellules endothéliales (EC) dans un milieu complet des cellules endothéliales (ECM) additionné de compagnie fourni 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 10% de pénicilline / streptomycine et de supplément de croissance de cellules endothéliales de 10%. </li><li> péricytes de culture dans les médias de péricytes complète (PM) supplémenté avec la société fournis 2% de FBS, 10% de pénicilline / streptomycine et le supplément de croissance des péricytes 10%. </li&gt; </ol></li><li> Préparer des mélanges de cellules <ol><li> Calculer le nombre requis de cellules pour les groupes expérimentaux et de contrôle. NOTE: Chaque bouchon dans le groupe expérimental contient un million (1 x 10 6) CEs humaine et deux cent mille (2 x 10 5) péricytes. Pour le groupe de contrôle, chaque fiche ne contient que 1,2 million CEs humaines. Le groupe témoin négatif a un gel de matrice seulement. Chaque groupe doit comprendre au moins quatre prises, ce qui nécessiterait deux souris que des bouchons peuvent être injectés dans chaque côté du bas du dos d&#39;une souris. Trois fiches serviraient triple pour l&#39;expérience et le quatrième pourrait être utilisé dans le cas où l&#39;on échoue. Préparer 25% de cellules supplémentaires en fonction du volume supplémentaire de gel. </li><li> Recueillir et compter les cellules à partir des plaques de culture. <ol><li> Pour détacher les cellules, enlever les médias et laver une fois avec 1x température ambiante tampon phosphate salin (PBS). Retirer du PBS, ajouter 1 ml de trypsine à 0,25% EDTA / 2,21, et on incube pendant 1 min. Laver les cellules de la plaque en ajoutant 2ml de milieu et de recueillir dans un tube de 15 ml. </li><li> Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre selon les instructions du fabricant. </li><li> Centrifuger le nombre approprié de cellules en une pastille à 400 g pendant 5 min. Pour le groupe expérimental, centrifugeuse à la fois CEs et péricytes vers le bas en une seule pastille. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Matrice Gel Préparation <ol><li> Dégeler gel de matrice complètement à 4 ° C pendant 4 heures ou toute la nuit pour obtenir une solution homogène. Pas de mélange est nécessaire. </li><li> Aliquoter gel de matrice dans 1,5 ml tubes et conserver à 4 ° C. </li><li> Pré-refroidissement stériles tubes de 1,5 ml et 28 G 1 insuline cc seringues à 4 ° C. Attention: Gardez le gel de la matrice sur la glace en tout temps. </li><li> Mélanger un gel de matrice à froid avec du bFGF dans un rapport volumique de 1: 100 (concentration finale de bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF solution mère = 50 pg / ml) Après avoir mélangé la solution de gel de matrice, par pipetage de haut en bas plusieurs fois, laisser incuber sur de la glace pour 30 - 60 min bvant le mélange avec les cellules à l&#39;étape 3.1. NOTE: Décongeler le stock bFGF avant le mélange. Calculer le nombre de bouchons nécessaires pour l&#39;injection. Par exemple, chaque bouchon nécessite un gel de matrice 200 ul. Par conséquent, préparer 25% de gel supplémentaire. </li></ol> 3. Gel de matrice avec des cellules Mix <ol><li> Pour chaque groupe, remettre en suspension le culot cellulaire (contenant le nombre de cellules approprié) avec le volume calculé de gel de matrice contenant du bFGF. Mélanger doucement pour éviter de faire mousser et laisser dans le tube de 15 ml sur la glace jusqu&#39;à ce que les souris sont préparées pour l&#39;injection. </li></ol> 4. Préparation de la souris <ol><li> 1 anesthésier les souris SCID pendant 5 min à 3% d&#39; isoflurane plus 3% de O 2 dans une chambre d&#39;induction. Focus sur un groupe expérimental, ou 2 souris, à la fois. </li><li> Retirez la souris de la chambre d&#39;induction, lieu sur une face ventrale du coussin chauffant vers le bas et fixer rapidement une buse de museau sur le visage de la souris via un système non-réinhalation pour fournir une anesthésie tout au long du InjeProcédure ction. Commuter l&#39;écoulement de gaz depuis la chambre d&#39;admission du système de non-réinhalation et d&#39; abaisser la pression de gaz à 1,5% d&#39; isoflurane et de 1,5% de O 2. </li><li> Enlever les poils des deux régions postérieures latérales (environ 1 cm de diamètre) avec une crème dépilatoire rasoir ou des cheveux. </li><li> Essuyez la zone de la peau avec un tampon d&#39;alcool à 70%. </li><li> Retour de la souris à la chambre d&#39;induction et répétez les étapes 4.2 à 4.4 avec la seconde souris. </li></ol> Gel Matrice 5. Injection <ol><li> Préparer une souris pour l&#39;injection en se fixant sur le système non-réinhalation et en plaçant sur la face ventrale du coussin chauffant vers le bas. </li><li> Charger le gel de matrice dans un pré-refroidie 28 G 1 cc une seringue à insuline de souris à la fois. <ol><li> Chargez le volume de 500 pi complète de gel de matrice pour deux bouchons (200 pi par prise, plus de 25% supplémentaires) dans la seringue. </li><li> Assurez-vous d&#39;injecter le gel de la matrice dans les souris en 3 minutes de chargement des cellules dans la seringue pour empêcher la CEIIs de se fixer sur le côté de la seringue et pour empêcher le gel de la matrice de se solidifier à l&#39;intérieur de la seringue. </li></ol></li><li> Soulevez la peau du dos pour localiser l&#39;espace sous-cutané, puis injecter 200 ul du gel de la matrice lentement et uniformément dans l&#39;espace sous-cutané de la partie postérieure arrière de la cage thoracique. </li><li> Retirer l&#39;aiguille d&#39;injection lentement, en prenant soin d&#39;éviter le gel de la matrice de fuir du site d&#39;injection. Une bosse se forme au niveau du site d&#39;injection. Essuyez site d&#39;injection avec un tampon d&#39;alcool. </li><li> étapes injection répétée 05.02 à 05.05 de l&#39;autre côté du dos de la souris, puis laisser la souris sur son dos pendant 1 min pour permettre la gélification du gel de matrice sur le coussin chauffant. </li><li> Décrire les deux bosses à l&#39;aide d&#39;un marqueur permanent pour identifier la bosse après 14 jours. Après quelques cheveux repoussent, il sera plus facile de trouver la bosse. </li></ol> 6. Matrice Gel plug Isolation: 14 jours après l&#39;injection <ol><li> Euthanasier les souris humainement en exposant l&#39;animals à&gt; 5 min d&#39;inhalation de dioxyde de carbone suivie d&#39;une dislocation cervicale pour assurer la mort. </li><li> Retirez le bouchon de gel de la matrice du dos de la souris. <ol><li> Retirez délicatement les cheveux regrown autour du site d&#39;injection où le bouchon est situé par l&#39;étape 4.3 répéter. La ligne de marqueur indique la taille de bosse d&#39;origine sous la peau. </li><li> Exciser la fiche ainsi que les couches de la peau et des muscles environnants attachés sur les faces supérieure et inférieure de la fiche, respectivement. <ol><li> Avec des ciseaux chirurgicaux fines, faire une incision à la frontière marquée de la fiche qui est perpendiculaire à la peau et couper à travers le muscle sous le bouchon. Ensuite, couper soigneusement autour de la périphérie du bouchon le long de la frontière marquée. </li><li> Enlever le bouchon, en le maintenant pris en sandwich entre les couches de la peau et des muscles. Rincer immédiatement dans un petit bécher avec PBS 1x pour laver l&#39;excès de sang. Le bouchon est maintenant prêt à être fixé (étape suivante, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Fixer les plug dans 4% de paraformaldehyde. <ol><li> Placer l&#39;ensemble de bouchon, y compris les couches de peau et de muscle, dans un tube de 50 ml avec 25 ml de paraformaldehyde à 4% pendant 24 heures à température ambiante, sans basculer. Le lendemain, le transfert de la fiche dans 25 ml d&#39;éthanol à 70% pendant 24 heures avant l&#39;inclusion en paraffine. REMARQUE: Manipulez paraformaldéhyde avec prudence. Porter des gants. </li></ol></li></ol> 7. Paraffine Process le Gel Plug-matrice <ol><li> Préparer le bouchon pour l&#39;inclusion en paraffine. <ol><li> Orientez la fiche comme illustré sur la figure 1a; placer le bouchon dans une cassette de tissu de telle sorte que le côté du bouchon est orientée vers le haut et les deux couches de peau et de muscle sont visibles à travers la surface du bloc de tissu qui sera coupée en premier lors de la coupe. </li></ol></li><li> Paraffine intégrer la prise selon les protocoles de paraffine enrobage standards 13. </li><li> Couper 8 - 10 um d&#39;épaisseur des sections hors du bloc de tissu et monter sur des lames de microscope according aux protocoles de paraffine sectionnant standards 13. </li><li> Stocker les diapositives dans un endroit frais et sec à la température ambiante avant d&#39;être prêt pour la coloration. </li></ol> 8. Stain Sections avec hématoxyline et éosine (H &amp; E) 13 <ol><li> De-paraffinize les coupes de tissu en faisant passer les lames à 100% de xylene deux fois, 100% d&#39;éthanol, 95% d&#39;éthanol, 70% d&#39;éthanol et enfin 1 x PBS, chacun pendant 5 minutes à température ambiante. Laisser les lames dans 1x PBS jusqu&#39;à ce que la prochaine étape. </li><li> Pipeter 100 ul H &amp; E solution sur la section et incuber pendant 1 - 5 min ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il y ait un contraste clair entre les noyaux bleus et cytoplasme rose dans une cellule telle que vue sous un microscope à lumière verticale à un grossissement de 10X. Faites attention à ne pas laisser la solution H &amp; E toucher l&#39;objectif. </li><li> Laver H &amp; E solution hors de la diapositive par tremper la lame dans un grand bêcher d&#39;eau du robinet, puis placez la lame dans un rack dans le bécher et rincer à l&#39;eau courante pendant 2 min. </li><li> Move à l&#39;étape 9.8 pour monter les diapositives. </li></ol> 9. Stain Autres Diapositives pour Capillaires humaines et péricytes <ol><li> De-paraffinize les coupes de tissu en faisant passer les lames à 100% de xylene deux fois, 100% d&#39;éthanol, 95% d&#39;éthanol, 70% d&#39;éthanol et enfin 1 x PBS, chacun pendant 5 minutes à température ambiante. Laisser les lames dans 1x PBS jusqu&#39;à ce que la prochaine étape. </li><li> Faire bouillir les sections dans une solution de récupération d&#39;antigène. <ol><li> Dans un bécher de 2 L, de préparer une solution bouillante de récupération d&#39;antigène en utilisant un tampon citrate 1x (pH 7,0) à 95 ° C sur un bloc chauffant. </li><li> Une fois l&#39;ébullition, placer les lames dans un rack métallique et plonger dans la solution de récupération d&#39;antigène d&#39;ébullition pendant 20 min. </li><li> Retirez délicatement le bécher du bloc de chauffage avec les lames encore submergées et laissez la solution revenir lentement à la température ambiante pendant environ 30 min. </li><li> Placer les lames dans PBS 1x jusqu&#39;à l&#39;étape suivante. </li></ol></li><li> Bloquer les sections dans un tampon de blocage (1x PBS, 5% de sérum de chèvre, 00,3% de Triton X-100). <ol><li> Tracez un cercle hydrophobe autour des bords de chaque section avec un stylo PAP. </li><li> Placer les lames dans un bac d&#39;humidité avec de l&#39;eau distillée au fond du bac. </li><li> Distribuer 100 ul du tampon de blocage sur les sections en veillant à tout le tissu est couvert par un fluide (peut nécessiter plus de 100 pi). </li><li> Incuber les sections avec du tampon de blocage pendant 1 h. </li></ol></li><li> Incuber sections avec l&#39;anticorps primaire. <ol><li> Préparer une solution avec deux anticorps primaires pour sonder chaque section pour CD31 (EC) et de l&#39;actine des muscles lisses (les pericytes) dilué dans du tampon de dilution (1 x PBS, 1% de BSA, 0,3% de Triton X-100). NOTE: Ici, la concentration anti-CD31 est 01h50 et la concentration de l&#39;actine musculaire lisse est anti-1: 300. </li><li> Incuber les sections pendant une nuit à 4 ° C avec 100 ul d&#39;anticorps primaires dans un bac d&#39;humidité contenant de l&#39;eau distillée. </li></ol></li><li> Laver les lames trois fois en 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) pendant 5 min à chaque lavage. </li><li> Incuber les sections avec un anticorps secondaire. <ol><li> Préparer une solution avec une chèvre conjuguée à un anticorps secondaire anti-lapin fluorophore pour reconnaître l&#39;anticorps de lapin anti-CD31 dilué dans du tampon de dilution. <ol><li> NOTE: L&#39;anticorps primaire actine du muscle lisse est déjà conjugué à un fluorophore CY3, de sorte qu&#39;aucune coloration d&#39;anticorps secondaire est nécessaire. lapin concentration d&#39;anticorps secondaire de chèvre anti est égal à 1: 250. </li></ol></li><li> Incuber les sections pendant 1 heure avec 100 pi d&#39;anticorps secondaire dans le bac d&#39;humidité contenant de l&#39;eau distillée. </li></ol></li><li> Laver les lames trois fois 1x PBST pendant 5 minutes chaque lavage. </li><li> Monter les lames. <ol><li> Pipette 2 - 3 gouttes (~ 40 - 60 pi) de antifade solution de montage avec DAPI coloration nucléaire sur chaque section. </li><li> Placez délicatement un non. 1,5 lamelle sur les sections et solution de montage, permettant au fluide d&#39;étaler sur les sections et les bords dela lamelle. utiliser doucement un doigt pour appuyer sur les bulles d&#39;air qui peuvent être situés sur la section. </li><li> Laissez les diapositives sécher pendant au moins 1 h avant de le manipuler. </li></ol></li></ol> 10. Quantifier Capillaire Densité et structure 14 <ol><li> Comptez le nombre de capillaires dans H &amp; E coupes colorées, exprimée en # / mm 2. <ol><li> Acquérir des photos de quatre domaines différents sur un microscope à lumière verticale sous un grossissement de 40X. NOTE: Les capillaires sont identifiés comme des tubes remplis de globules rouges. </li><li> Alternativement, au lieu des capillaires de comptage manuel, utiliser un logiciel d&#39;analyse d&#39;image (par exemple, Wimasis Analyse d&#39;image) pour quantifier différents paramètres de l&#39; angiogenèse tels que le nombre de navires, la longueur du navire moyen et le diamètre, et des points de branchement. </li></ol></li><li> Analyser la structure capillaire dans les sections d&#39;immunofluorescence colorées. <ol><li> Acquérir des photos de quatre domaines différents sur un microscope à fluorescence inverséavec FITC et TxRed cube de filtre. <ol><li> Utilisez un cube FITC à l&#39;image CEs par une excitation à 488 nm de longueur d&#39;onde et d&#39;utiliser un cube TxRed à péricytes d&#39;image par excitation à 594 nm de longueur d&#39;onde. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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Aucun intérêt financier concurrent n’est inclus.

Le bouchon de gel dosage de la matrice est avérée être un moyen pratique et efficace d&#39;évaluer la régulation des gènes dans l&#39; angiogenèse, angiogéniques et anti - angiogéniques in vivo, et pour compléter les tests in vitro. Ici, nous décrivons en détail un nouveau bouchon essai de gel de la matrice de l&#39;angiogenèse humaine qui étudie l&#39;interaction entre les cellules et les pericytes endothéliales lors de la formation des vaisseaux. Il y a quelques étapes no...

L&#39; angiogenèse est le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir d&#39; un réseau vasculaire préexistant 1 et est le centre de recherche en cours dans de nombreux domaines allant du développement normal de la maladie. Ce processus dynamique implique la prolifération et la migration des cellules endothéliales (EC) et le recrutement des pericytes pour construire un tube vasculaire qui est dirigée vers le site qui a besoin d&#39; oxygène et de nutriments livraison 2. Pour étudier ce processus nécessite une analyse aussi dynamique, le plus important qui peut récapituler le caractère tridimensionnel de la formation du tube. Les essais in vitro de la matrice 3D ont été développés pour répondre à ce besoin et ont bien fonctionné pour permettre aux chercheurs de définir les étapes discrètes dans l&#39; espace et le temps dans lequel l&#39; angiogenèse a lieu 3, 4, 5, 6. Cependant, ces modèles in vitro de la matrice 3D sont limitées à l&#39; étude des navires non-perfusé uned manquent donc des éléments essentiels pertinents pour le processus de l&#39; angiogenèse (par exemple, circulant croissance et facteurs inhibiteurs, la tension contre - nature / forces à travers le lit vasculaire) et ne parviennent pas à simuler l&#39;environnement complexe présent dans les tissus vivants. Pour remédier à cette limitation, plusieurs essais in vivo de l&#39; angiogenèse ont été mis au point 7, y compris le bouchon dosage de gel de matrice qui sera l&#39;objet de notre rapport 8, 9. Le dosage de bouchon de gel de matrice est un test in vivo bien établi dans l&#39; angiogenèse qui fait appel à des chercheurs car il offre une plate - forme robuste pour tester les rôles des différentes cellules et de substances dans l&#39; angiogenèse. gel de Matrix est une solution de la membrane basale disponible dans le commerce qui est sécrétée par la lignée cellulaire de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) qui se solidifie en une matière analogue à un gel à 37 ° C. Le gel de la matrice peut être mélangée avec des cellules et / ou des substances telles que des facteurs de croissance et injeCTED sous-cutanée dans la souris. L&#39;hôte CEs va envahir le bouchon de plus de 14 jours, former un réseau vasculaire, et devenir perfusé avec le sang de l&#39;hôte. À ce jour, les plug essais de gel de la matrice ont toutefois porté exclusivement sur l&#39;étude du comportement des cellules endothéliales lors de l&#39;angiogenèse, au meilleur de notre connaissance, aucun effort n&#39;a encore été faite pour déterminer si ce test peut être utilisé pour la co-culture de cellules endothéliales et péricytes pour étudier comment ces deux types de cellules interagissent au cours de l&#39;angiogenèse. Plus précisément, la compréhension de la relation entre les CEs et péricytes est précieux pour l&#39; étude des maladies où la perte de vaisseaux sanguins est pathologique, y compris microvasculaire ischémie et la maladie vasculaire périphérique 10, 11, 12. Ici, nous décrivons un protocole qui introduit péricytes d&#39;origine humaine au mélange de gel de matrice avec CEs humaine et le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF). Ce mélange peut ensuite être injecté par voie sous cutanée in le dos de souris SCID pour permettre la formation de, péricytes enduits, les navires hybrides entièrement fonctionnels. Notre protocole décrit comment préparer des fiches de gel de matrice contenant CEs humaines avec ou sans péricytes humains, le placement dans des souris SCID et la façon d&#39;analyser les coupes histologiques critères d&#39;angiogenèse critiques.

<table><tbody><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % trypsine/0,53 mM EDTA</td><td>Le kit de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milieux de cellules endothéliales (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>comprend un milieu, un supplément de croissance EC et de la pénicilline/streptomycine, chacun étant fourni au volume approprié pour un mélange facile</td></tr><tr><td>Kit de milieux de péricytes (PM)</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>comprend un milieu, un supplément de croissance des péricytes et de la pénicilline/streptomycine, chacun fourni au volume approprié pour faciliter le mélange</td></tr><tr><td>de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines primaires</td> Initiative de percée <td></td> de <td>l’hypertension pulmonaire</td><td>ce type de cellule est également disponible dans le commerce. Cellules utilisées au passage 1-4</td></tr><tr><td>péricytes pulmonaires humains primaires</td><td>Initiative de percée de l’hypertension</td><td></td> pulmonaire <td>ce type de cellule n’est pas disponible dans le commerce, mais les paricytes cérébraux le sont. Cellules utilisées au passage 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (facteur de croissance des fibroblastes de base)</td>La solution mère de <td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>est de 50 &mu ; g/ml dans 0,1 % de BSA dans le PBS, aliquotes à 50 &mu ; l et stocké à -20 degrés</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Seringue</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency)</td><td>souris The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD. La souche gamma knockout SCID IL2R est la meilleure souche ; 4-6 semaines Tubes</td></tr><tr><td>microcentrifuges de 1,5 ml, stériles</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à vis de 15 ml, stériles</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stylo PAP Life</td><td>Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>hémocytomètre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Crème dépilatoire Nair</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr>la solution de travail de <td>l’anticorps primaire CD31 anti-humain</td><td>LS-B4737</td> de <td>LifeSpan Biosciences</td><td>est de 1:50</td></tr><tr><td>anti-action musculaire lisse humaine CY3</td> la solution de travail <td>Sigma</td><td>C6198</td><td>est de 1:300</td></tr><tr><td>anticorps secondaire anti-lapin de chèvre ; la solution de travail 488/vert</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>est de 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI</td><td>solution Cell Lames de microscope de signalisation</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>n° 1.5 lamelles</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>tampon à citrate 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>ciseaux chirurgicaux extra fins</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formol (paraformaldéhyde)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes de tissus</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>sérum de chèvre</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

etude in vivo de human interaction endothelial-péricytes utilisation du gel matrice plug - test chez la souris

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

L’angiogenèse est le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de vaisseaux existants. La croissance de nouveaux vaisseaux nécessite une prolifération, une migration et un alignement coordonnés des cellules endothéliales pour former des structures tubulaires, suivis d’un recrutement de péricytes pour fournir un support mural et faciliter la maturation des vaisseaux. Les approches actuelles de culture cellulaire in vitro ne peuvent pas reproduire pleinement l’environnement biologique complexe où les cellules endothéliales et les péricytes interagissent pour produire des vaisseaux fonctionnels. Nous présentons une nouvelle application du test in vivo du bouchon de gel matriciel pour étudier les interactions endothéliales-péricytes et la formation de vaisseaux sanguins fonctionnels à l’aide de souris atteintes d’immunodéficience combinée sévère (DICS). En bref, le gel matriciel est mélangé à une solution contenant des cellules endothéliales avec ou sans péricytes, suivi d’une injection dans le dos de souris SCID anesthésiées. Après 14 jours, les bouchons de gel matriciel sont retirés, fixés et sectionnés pour une analyse histologique. La longueur, le nombre, la taille et l’étendue de la couverture péricytaire des vaisseaux matures (définie par la présence de globules rouges dans la lumière) peuvent être quantifiés et comparés entre les groupes expérimentaux à l’aide de plateformes statistiques commerciales. Au-delà de son utilisation en tant que test d’angiogenèse, ce test de bouchon de gel matriciel peut être utilisé pour mener des études génétiques et comme plate-forme pour la découverte de médicaments. En conclusion, ce protocole permettra aux chercheurs de compléter les tests in vitro disponibles pour l’étude des interactions endothéliales-péricytes et de leur pertinence pour l’angiogenèse systémique ou pulmonaire.

Représentant H &amp; E et immunofluorescence de sections de bouchon de gel de la matrice sont présentés dans la figure 2. Les articles de la CE uniquement les fiches présentent certains navires qui ne sont généralement pas perfusées avec du sang (Figure 2 en haut à gauche, flèches noires) , tandis que les bouchons contenant à la fois CEs et péricytes afficher plusieurs perfusé les navires avec des diamètres plus grands et une couverture complète des péri...

Nous présentons un protocole pour étudier les interactions endothéliale péricytes humaines chez la souris en utilisant une variante du test d&#39;angiogenèse bouchon de gel de matrice.

Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

L'objectif général de ce test in vivo avec gel matriciel est d'étudier l'interaction entre les cellules endothéliales et les parasites. Ce test de matrigel est conçu pour aider les chercheurs à analyser les étapes majeures de l'androgenèse. Il permettra également d'identifier les voies de signalisation responsables des principales étapes de la formation des vaisseaux sanguins, ainsi que les gènes dont le dysfonctionnement peut entraîner des troubles vasculaires et d'autres anomalies de l'androgenèse.Le principal avantage de cette technique est qu'elle nous permet d'étudier la formation des vaisseaux sanguins in vivo impliquant à la fois les cellules endothéliales et leurs cellules de soutien, les péricytes. Pour commencer, cultivez des cellules endothéliales humaines et des cellules parasitaires sur des plaques de 100 millimètres avec 10 millilitres du milieu approprié. Changez le milieu toutes les deux à trois journées jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 %.Pour préparer la solution de gel matriciel à mélanger avec les cellules, décongelez un stock de gel matriciel toute une nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez des aliquotes de 1,5 millilitre à conserver à long terme à moins vingt degrés Celsius, ou à quatre degrés Celsius pendant un maximum de deux semaines. Chaque prise expérimentale nécessitera 200 microlitres de gel matriciel.Ainsi, un tube approvisionné peut alimenter six bouchons avec un excès de 25 %. Préparez chaque aliquot requis en ajoutant 15 microlitres de stock décongelé de bFGF à 100x. Mélangez le bFGF en solution par pipetage, puis incubez sur de la glace pendant au moins 30 minutes avant d'ajouter les cellules.À ce stade, refroidissez quelques seringues d'insuline de 1 ml à l'aiguille de calibre 28 pour les injections. Pour recueillir les cellules à partir des plaques de culture, retirez le milieu et lavez les cellules une fois avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez un millilitre de solution de trypsine et remettez les plaques à l'incubateur pendant une minute.Ensuite, pipetez deux millilitres de milieu de culture sur les plaques pour détacher les cellules et recueillir le milieu dans un tube de 15 millilitres. Vérifiez maintenant la concentration des prélèvements à l’aide d’un hématimètre. Préparez ensuite des aliquotes de cellules dans des tubes de 15 millilitres.Une combinaison d'un million de cellules endothéliales et de 200 000 parasites est utilisée ici pour le groupe expérimental. Ensuite, centrifuger les aliquotes cellulaires à 400g pendant cinq minutes. Puis, ajouter le volume calculé de gel matriciel au culot cellulaire, et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette afin d’éviter la formation d’écume, car les bulles d’air ne peuvent pas être injectées.Maintenant, conservez les préparations sur de la glace jusqu'à ce que les souris soient prêtes à être injectées. Après avoir anesthésié une souris avec de l'isoflurane et confirmé l'état d'anesthésie par une pincée du orteil, fixez la souris au système non réutilisable fournissant de l'isoflurane et placez-la sur le tapis chauffant, le côté ventral vers le bas. Ensuite, retirez environ un centimètre carré de poils des deux régions latérales postérieures.Ensuite, nettoyez la peau exposée à l’aide d’alcool à 70 %. Puis, chargez un millilitre de la solution cellulaire préparée dans une seringue refroidie, ce qui suffit pour quatre implants. Pour effectuer une injection, soulevez la peau du dos afin de localiser l’espace sous-cutané.Ensuite, injecter lentement 200 microlitres de manière uniforme dans l'espace sous-cutané postérieur à la cage thoracique, puis retirer lentement l'aiguille afin d'éviter toute fuite. Après l'injection, une bosse se formera au site d'injection. Nettoyer le site avec de l'alcool, puis délimiter la bosse à l'aide d'un marqueur indélébile afin de pouvoir la retrouver ultérieurement.Ensuite, répétez la procédure d'injection de l'autre côté de la souris. Veillez à injecter toutes les cellules dans les trois minutes, sinon elles commenceront à adhérer à la seringue. L'étape d'injection est cruciale et doit être réalisée avec soin afin de garantir la formation d'un bouchon de gel matriciel entre les couches cutanée et musculaire, de sorte que ce bouchon conserve une bonne forme et ne devienne pas diffus.Avant de passer à l'injection de la souris suivante, laissez la souris injectée rester sur le coussin chauffant pendant une minute afin de permettre au gel de polymériser. Après l'euthanasie, placez la souris sur le plateau opératoire. Après avoir retiré tout poil repoussé au site d'injection, repérez les lignes de marquage qui identifient l'emplacement du bouchon.Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins, pratiquez une incision le long de la limite marquée du prélèvement, perpendiculairement à la peau et jusqu’au muscle sous-jacent. Découpez soigneusement tout autour de la périphérie de la limite marquée. Puis retirez le prélèvement en le maintenant pris en sandwich entre les couches de peau et de muscle.Rincez immédiatement le fragment dans un petit bécher contenant du PBS pour éliminer le sang. Ensuite, placez l'ensemble du fragment dans un tube de 50 millilitres contenant 25 millilitres de paraformaldéhyde à 4 %. Laissez fixer à température ambiante pendant 24 heures sans agitation.Le lendemain, transférer les prélèvements dans 25 millilitres d'éthanol à 70 % pendant 24 heures. Ensuite, procéder à l'inclusion en paraffine. Des sections de prélèvements ne contenant que des cellules endothéliales montrent que certains vaisseaux ne sont pas perfusés par le sang de l'hôte après 14 jours in vivo.En revanche, les implants contenant à la fois des cellules endothéliales et des parasites présentent de nombreux vaisseaux perfusés après 14 jours in vivo. Ces implants contiennent des cellules positives au marquage de l'actine des muscles lisses, visibles en rouge, situées immédiatement adjacentes à des cellules endothéliales positives pour le CD31, visibles en vert. Ainsi, les parasites pourraient jouer un rôle important dans la formation de nouveaux vaisseaux sanguins.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment appliquer cette puissante technique in vivo pour étudier la formation des vaisseaux sanguins en utilisant plusieurs types cellulaires. Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs pour explorer divers sujets de biologie vasculaire dans des modèles murins. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la PCR quantitative et le immunoblotting Western, peuvent également être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les modifications de l'expression génique et les analyses protéomiques.Cette technique puissante permettra à l'investigateur d'étudier in vivo l'interaction entre les cellules endothéliales et les parasites durant la formation des vaisseaux sanguins, une étape clé de l'androgénèse. Cette technique puissante permettra également à l'investigateur d'étudier d'autres interactions entre cellules qui sont pertinentes pour comprendre les maladies vasculaires telles que l'hypertension pulmonaire, entre autres.

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Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

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