Application des barrières imperméables combinées avec le facteur de candidat Perles Soaked pour étudier les signaux inductifs dans le poussin

Le but de cette intervention chirurgicale est d’élucider les mécanismes d’induction des membres chez l’embryon de poussin en empêchant les molécules de signalisation de se diffuser des tissus médians vers les cellules du mésoderme de la plaque latérale et en étudiant son effet sur l’expression des gènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que : quels sont les signaux inductifs pour contrôler l’initiation des bourgeons des membres. L’avantage de cette technique est que l’embryon de poussin est accessible à la manipulation chirurgicale et très robuste, de plus, le bourgeon de membre de contrôle controlatéral non opéré sert de contrôle interne très utile.

Susan Wilde fera une démonstration de la procédure. Pour commencer, coupez un morceau carré de 1 cm de papier d’aluminium de 0,013 mm d’épaisseur et stérilisez-le en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, placez le carré sur une boîte de Pétri en plastique stérile de 6 cm.

Pour éviter l’électricité statique, jetez le couvercle et faites-en un nouveau pour le plat à partir du même papier d’aluminium. Ensuite, placez la boîte de Pétri sur le réticule d’une platine sous un microscope binoculaire réglé à un grossissement de 1,6x. À l’aide d’un petit scalpel à lame numéro 15, coupez des bandes de feuille de 1,3 mm de large et de 2 mm de long.

Séparez les bandes de film à l’aide de deux paires de pinces d’horlogerie numéro quatre. Ensuite, faites une courbure à angle droit au centre de la barrière de feuille de sorte qu’elle ressemble à une charnière. Alignez les barrières au centre de la boîte de Pétri avec un côté à plat contre le plat et l’autre pointant vers l’extérieur du plat, préparez 20 barrières ou plus avant le jour de l’opération.

Placez le couvercle en aluminium sur le plat et rangez les barrières dans un endroit où elles ne seront pas dérangées. Avec l’œuf couché sur le côté, saisissez fermement une paire de pinces puissantes de type AA et utilisez un mouvement de poignardage contrôlé pour percer l’extrémité émoussée de l’œuf contenant le sac aérien tout en tenant l’œuf avec la main libre. Assurez-vous que la membrane de la coque intérieure a été cassée.

Ensuite, prenez l’œuf à deux mains et tournez-le à 180 degrés le long de son axe horizontal. Ensuite, prenez un morceau de ruban adhésif transparent d’environ 5 cm carrés et collez-le étroitement sur la surface supérieure de l’œuf pour empêcher la coquille de l’œuf de s’effriter sur l’embryon lorsque l’œuf est ouvert. Utilisez une paire de ciseaux incurvés pour percer doucement la coquille et ses membranes cellulaires internes associées au centre de la partie supérieure de l’œuf.

Faites un très petit trou avec une lame des ciseaux pour que l’air puisse entrer dans l’œuf au-dessus de l’embryon. Utilisez les ciseaux pour agrandir le trou dans la coquille en un cercle d’environ 1 cm de diamètre. Retirez ce morceau de coquille de la taille d’un œuf de l’œuf.

Couvrez le trou de l’œuf avec un morceau de ruban adhésif transparent d’environ 5 cm de côté. Appuyez sur le ruban pour le coller uniquement au niveau du rebord du trou, en laissant le reste du ruban libre. Le ruban adhésif libre peut ensuite être saisi pour desceller facilement l’œuf.

Prenez un embryon de stade 15 de l’incubateur et placez l’œuf sur un repose-œuf sous un microscope binoculaire réglé sur un grossissement de 3,2x ou plus. Ensuite, retirez la couche supérieure de ruban adhésif transparent. À l’aide d’un micro-couteau en acier, faites une incision à travers la membrane vitelline et placez latéralement le mésoderme adjacent aux somites 26-32 sur le côté droit de l’embryon.

Prenez la barrière avec la micro-pince numéro 5 à une extrémité et tournez la barrière pour insérer l’extrémité libre dans l’incision. Dès que possible, scellez l’œuf avec du ruban adhésif transparent et remettez-le dans l’incubateur. Si une bille doit être insérée en conjonction avec une barrière, préparez d’abord des billes imbibées d’acide rétinoïque comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

Ensuite, prenez la perle et une paire de micro-pinces numéro 5 et insérez-les dans la face coupée du mésoderme latéral du côté distal de l’incision. Ensuite, insérez la barrière dans l’incision proximale à la perle. Scellez l’œuf et remettez-le rapidement dans l’incubateur.

Si une ou plusieurs perles doivent être insérées sans barrière, ne faites pas la longue incision. Au lieu de cela, faites une petite incision à travers la membrane vitelline et dans le mésoderme de la plaque latérale à l’endroit où la perle doit être placée. Ensuite, prenez la perle et la micro-pince numéro 5 et insérez-la dans le trou du mésoderme de la plaque latérale.

Enfoncez-le un peu plus loin avec les extrémités fermées de la pince. Prenez un embryon de stade dix fenêtré de l’incubateur et placez l’œuf sur un repose-œuf sous un microscope binoculaire réglé sur un grossissement de 3,2x ou plus si vous préférez. Ensuite, à l’aide d’un micro-couteau en acier, faites une incision à travers la membrane vitelline et le mésoderme de la plaque latérale, latérale à la bande primitive à l’extrémité caudale de l’embryon dans l’alignement des somites, d’environ six longueurs de somite.

Ensuite, prenez la barrière avec une paire de micro-pinces numéro 5, à l’extrémité dépassant de la boîte de Pétri et tournez la main pour insérer l’extrémité libre de la barrière dans l’incision. Dès que possible, scellez l’œuf avec du ruban adhésif transparent et remettez-le dans l’incubateur. Si une perle doit être insérée sans barrière, faites une petite incision à travers la membrane vitelline et dans le mésoderme de la plaque latérale à l’endroit où la perle doit être placée.

Ensuite, prenez la perle et une paire de micro-pinces numéro 5 et insérez-les dans le trou du mésoderme de la plaque latérale. Enfin, enfoncez-le un peu plus loin avec les extrémités fermées de la pince. La position barrière au niveau de la jambe présumée des somites 26-32 dans un embryon de stade 15 est illustrée.

Cette barrière conduit à l’absence d’expression de Fhf10 et Fhf8 dans la région du bourgeon de la patte du côté opéré et présente dans le côté gauche non opéré. Cependant, l’expression de Tbx4 est observée à la fois au stade 19 et au stade 23 du côté opéré. Cela implique que l’expression de Tbx4 seule n’est pas suffisante pour initier l’excroissance des membres postérieurs à partir du lpm.

Lorsque des billes imbibées d’acide rhétinoïque sont placées distales par rapport à la barrière au stade 15, Tbx4, Fgf10 et Fgf8 sont tous exprimés du côté opéré comme ils le sont du côté contrôle gauche. Ainsi, dans le développement normal, l’acide rétinoïque des somites est essentiel avant que la croissance des bourgeons des membres puisse être initiée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser des barrières imperméables et des billes facturées candidates pour étudier comment les signaux inductifs régulent l’initiation des bourgeons des membres dans l’embryon de poussin.