Name: Un modèle aigu rétinienne pour lévaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez un modèle ex vivo rétinien pour évaluer les traitements contre les brèches de la barrière sang-rétine induites par l'histamine. Cette méthode utilise des rétines de porc pour tester la lipoxine A4.

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Bringhurst Meats (Berlin, NJ) est reconnue pour son aide sincère en fournissant des globes oculaires aux porcs.

Tous les protocoles ont été effectués en conformité avec les politiques du Comité des soins et l&#39;utilisation des animaux institutionnels, le cas échéant. 1. Préparation <ol><li> Préparer le milieu de stabilisation avec 75% de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 25% de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Bien mélanger, aliquote et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer le tampon phosphate salin (PBS) et stériliser par autoclavage. Conserver la solution à la température ambiante. Chauffer le PBS à 37 ° C avant l&#39;expérience (5 ml par puits). </li><li> Préparer 10%, 20% et 30% de saccharose dans du PBS. Filtrez toutes les solutions individuellement plus de 0,22 um filtres séparés pour la stérilisation. Enregistrer les solutions à 4 ° C. </li><li> Préparer la solution d&#39;histamine stock dans du PBS à une concentration de 90 mM. Stériliser la solution par filtration sur un filtre de 0,22 pm. Aliquoter et sauver la solution à -80 ° C. Évitez de multiples cycles de gel et de dégel. </li><li> Faire frais paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS avant l&#39;expérience. Placez-le sur la glace. Attention: Gardez PFA dans une hotte et porter un équipement de protection approprié. </li><li> Décongeler le moyen de stabilisation (20 ml par rétine). Ajouter pénicilline- streptomycine à une concentration finale de 100 U / ml. partie chaude du milieu (15 ml par rétine) à 37 ° C dans l&#39;incubateur avant l&#39;expérience. Laissez le reste du milieu sur la glace. </li><li> Placez le HBSS (10 ml par rétine) sur la glace. </li></ol> 2. Retinal organotypiques Culture <ol><li> Transférer les échantillons dans une hotte de culture tissulaire. Ouvrez l&#39;œilleton en coupant autour de la lentille. Avec un pinceau, retirez délicatement l&#39;humeur vitrée sans tirer sur la rétine. détacher délicatement la rétine à partir du bord de coupe avec une brosse pour exposer le disque optique. Sévère du nerf optique avec un rasoir et de libérer la rétine. </li><li> Transférer la rétine dans une boîte de Pétri et rincer soigneusement la rétine une fois en utilisant HBSS froid. Placer l&#39;échantillon dans HBSS sur ice. Disséquer autant rétines comme nécessaire en répétant l&#39;étape 2.1 et cette étape. </li><li> Couper en deux la rétine de manière symétrique avec un rasoir. transférer doucement échantillons sur une plaque de 6 puits avec 3 ml de milieu de stabilisation par puits. Permettre équilibration pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur avec l&#39;atmosphère contenant 5% de CO 2. </li><li> Préparer les réactifs suivants au cours de l&#39;incubation à l&#39;étape 2.3: Diluer la solution d&#39;histamine des stocks à la concentration désirée (450 uM) dans un milieu chaud. Dissoudre la LXA4 (stocké sous argon) dans le milieu à une concentration finale de 250 ng / ml. REMARQUE: Lorsque l&#39;on mesure l&#39;effet de LXA4, une moitié d&#39;une seule rétine est utilisée pour l&#39;histamine seul, tandis que l&#39;autre moitié est utilisée pour l&#39;histamine avec la LXA4. </li><li> Aspirer le milieu de stabilisation et ajouter soigneusement le moyen disposé à chaque puits (3 ml par puits). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure dans un incubateur avec l&#39;atmosphère contenant 5% de CO 2. </li><li> Rincer leéchantillons une fois dans un endroit chaud, PBS stérile. </li></ol> 3. Préparer les échantillons pour immunocoloration <ol><li> Aspirer le PBS des plaques. Ajouter 4% de PFA (3 ml par puits) et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Aspirer rapidement la PFA. Rincer les échantillons une fois à l&#39;aide de PBS. Transférer les échantillons à 10% de saccharose (5 ml par puits) et incuber pendant 2 à 4 heures à 4 ° C. </li><li> Transférer les échantillons à une teneur en saccharose à 30% (5 ml par puits) et on incube pendant une nuit à 4 ° C. Mélanger une partie du milieu de congélation commercial avec deux parties de 20% de saccharose pour rendre le milieu de congélation de travail. Laissez-le à 4 ° C pendant une nuit ou plus jusqu&#39;à ce que l&#39;air des bulles disparaissent. </li><li> Transférer les échantillons dans le milieu de congélation de travail et permettre équilibration pendant 5 min à température ambiante. Coupez chaque rétine en rectangles (environ 3 mm par 5 mm). </li><li> transférer soigneusement les échantillons dans le milieu de congélation de travail contenu dans un récipient cylindrique (environ 1 cm de rayon x 2 cm de hauteur) devnisé de feuille d&#39;aluminium. Veiller à ce que les tranches de la rétine sont verticales (orientées pour fournir une coupe transversale de la rétine sur sectionnant) et les congeler dans de l&#39;azote liquide. Enregistrer les blocs à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Section chaque bloc sur un cryostat en 14 um tranches épaisses et monter les sections sur des lames de verre. Stocker les diapositives à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 4. immunocoloration <ol><li> Laver les sections avec du tampon phosphate 5% de saccharose (SPB, 5% de saccharose dans du PBS, pH 7,4) une fois. Bloquer les sites de liaison non spécifiques par incubation des coupes dans un tampon de blocage (5% SPB avec 10% de sérum de chèvre normal et 0,5% de Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Incuber les sections () sur des lames avec l&#39;anticorps primaire approprié (GFAP ou MAP2, dilué à 1: 500 dans un tampon de blocage) pendant 1 h. Aspirer la solution. Laver trois fois dans 5% SPB. Pour la coloration de la IgG endogène, sautez cette étape. </li><li> Incuber les sections avec le correspondant de secondeanticorps dary (Cyanine3 / FITC âne conjugué anti-souris / anti-IgG de lapin, dilué à 1: 800 dans le tampon de blocage) pendant 1 h. </li><li> Laver les coupes à fond avec 5% SPB trois fois. Préparer les échantillons pour la microscopie par leur montage dans le montage milieu contenant DAPI et couvrant avec des lamelles. </li><li> En utilisant un laser confocal, de capturer des images à travers un objectif 20X avec des paramètres identiques , tels que l&#39; intensité du laser, la valeur de gain, le temps de séjour, etc. , entre les groupes. Définissez les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission pour le canal bleu (pour détecter DAPI) comme 408/447 nm, pour le canal rouge (pour détecter Cyanine3) comme 561/785 nm et pour le canal vert (pour détecter FITC) comme 488/525 nm . </li></ol> 5. Analyse de l&#39;image <ol><li> Quantifier pourcentage de vaisseaux sanguins qui fuient selon les critères suivants 12: Inclure seulement les vaisseaux sanguins avec les noyaux des cellules endothéliales dans le plan de coupe dans le compte; envisager une leaky des vaisseaux sanguins si elle montre agradient de immunocoloration entourant le récipient. </li><li> Pour déterminer le niveau d&#39;expression, sélectionner des régions d&#39;intérêt et de mesurer la valeur de gris moyenne en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Pour mesurer la largeur du processus, pour choisir une zone de la section où les processus sont distinctes (la couche extérieure nucléaire, ONL, par exemple). Ensuite, choisissez un champ optique où ces processus sont visibles et continue. Réglez la barre d&#39;échelle en fonction du réglage microscopique, tracer une ligne sur le processus et effectuer la mesure. </li><li> Pour analyser la continuité du processus, certaines régions d&#39;intérêt, appliquer le filtre appelé variance qui améliore les bords de l&#39;image en remplaçant chaque pixel par sa variance de voisinage, ajuster automatiquement le contraste et la luminosité, compter les lignes et de normaliser le compte par le région. </li><li> Calculer significations statistiques en utilisant &#39; t -test de Student bilatéral. * P &lt;0,05; **, P &lt;0,01; *** P &lt;0,001. Pbeaucoup le résultat en moyenne ± SEM. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce rapport, nous présentons un puissant modèle rétinien aigu ex vivo de dysfonctionnement BRB en utilisant la rétine porcine. Ce modèle ne nécessite pas d’instruments spéciaux et peut être facilement adapté dans la plupart des environnements de laboratoire. Cependant, pour obtenir un résultat réussi, plusieurs étapes nécessitent une attention particulière. Après avoir obtenu les globes oculaires de la source, ils doivent être conservés à 4 °C ou sur de la glace et traités dès que possible. Lorsque l’effet d...

Un nombre croissant de preuves soutient l&#39;existence de la barrière de la rétine de sang (BRB) 1-5 et sa similitude avec la barrière hémato - encéphalique (BHE) 6,7. Compromission de la BHE a été étroitement liée causalement ou en tant que marqueur diagnostique pour les maladies neurodégénératives chroniques telles que la maladie d&#39;Alzheimer (MA) et 8,9 aiguës des conditions telles que le délire 10. idées mécanistes dans ces pathologies et de découvertes pour les cibles potentielles de médicaments sont généralement entravés par l&#39;accessibilité et réseau intrication limitée du cerveau. Des alternatives telles que l&#39; imagerie in vivo 11, le cerveau organotypique culture 12, des cultures de cellules primaires 13,14 et des systèmes de co-culture 15 ont été générés. Cependant, la plupart de ces modèles nécessitent des instruments spéciaux, de longues périodes expérimentales ou plusieurs marqueurs pour identifier les cellules. similitudes structurelles et fonctionnelles entre BBB et BRB, ainsi qu&#39;une corrélation entre l&#39;dysfunctions des deux ont été soutenu 16-19. En outre, un accès plus facile, les types de cellules bien définies et une structure en couches ont permis à la rétine bien caractérisé comme une fenêtre dans le cerveau. Les identités structurales et fonctionnelles de la BHE et BRB restent à comparer en détail. Cependant, pathologies de la rétine, en particulier la violation BRB, ont également été étroitement associée à la progression de diverses maladies, y compris le diabète 18-19 et AD 21,22. Par conséquent, il est intéressant de mettre en place un système de dysfonctionnement BRB non seulement de délimiter le mécanisme, mais aussi pour cribler des médicaments potentiels. Dans ce rapport, un protocole permettant un dysfonctionnement BRB utilisant une culture rétinienne aiguë simple est élaboré et présenté. Augmentation de la perméabilité BBB et des changements pathologiques AD-like ont été établis dans une culture du cerveau organotypique incubé avec de l&#39; histamine, un médiateur pro-inflammatoire 12. Par conséquent, dans le système présenté, l&#39;histamine a été applié à la culture ex vivo de la rétine à induire un dysfonctionnement BRB. Les rétines de plusieurs espèces, comme Mus musculus et Bos Taurus, ont été testés. En raison de leur disponibilité commerciale et de ressemblance avec les tissus humains, des globes oculaires du porc frais ont été utilisés pour fournir les données rapportées ici. Après incubation avec de l&#39; histamine et / ou d&#39; autres médicaments, les rétines ont été traitées pour l&#39; évaluation par immunocoloration pour plusieurs protéines 12 telles que l&#39; immunoglobuline G (IgG), l&#39; un des principaux composants du sang; protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), un marqueur bien connu pour l&#39;activation gliale; et la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2), une protéine du cytosquelette spécifique des neurones essentiels pour l&#39;assemblage des microtubules. En outre, la structure en couches de la rétine permet une analyse détaillée des processus de cellules de Müller et les cellules ganglionnaires, tels que des changements dans la largeur et la continuité. Ainsi plusieurs paramètres supplémentaires sont disponibles pour évaluer les conséquences de laviolation BRB à un stade précoce et d&#39;évaluer les effets d&#39;inversion des traitements potentiels. Dans ce protocole, les effets d&#39;inversion potentiels des médicaments dépistés sont évalués à partir de trois perspectives: la fuite des vaisseaux sanguins (BVS), l&#39;activation des cellules gliales et les dommages-réponse des cellules neuronales. Plusieurs méthodes de quantification sont utilisées, par exemple, le niveau d&#39;expression représentée par l&#39;intensité de l&#39;immunocoloration, mesure de la largeur d&#39;un processus et la continuité des processus neuronaux représentés par un filtre d&#39;amélioration. Pour mieux illustrer la méthode et pour aider à interpréter les résultats, lipoxine A4 (LXA4), un composé synthétisé de manière endogène en réponse à une lésion inflammatoire et atténuer la dysfonction endothéliale 23, a été choisie à des fins de démonstration.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Milieux de congélation&nbsp ;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal&nbsp ;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFAP</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps MAP2</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC Âne conjugué anti-lapin</td><td>IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Conjugué Donkey anti-souris IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>Support de montage <td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>contenant DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal laser</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti ImageJ</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle aigu rétinienne pour l&#39;évaluation sanguin rétinien barrière breach et potentiels médicaments pour le traitement

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Un système modèle peu coûteux, facile à utiliser et puissant est établi pour évaluer les traitements potentiels qui pourraient améliorer la brèche de la barrière hémato-rétinienne. Il a été démontré qu’un facteur inflammatoire, l’histamine, compromet l’intégrité des vaisseaux dans la rétine en culture par une coloration positive des IgG à l’extérieur des vaisseaux sanguins. Les effets de l’histamine elle-même et ceux des médicaments candidats à des traitements potentiels, tels que la lipoxine A4, sont évalués à l’aide de trois paramètres : la fuite des vaisseaux sanguins via l’immunocoloration IgG, l’activation des cellules de Müller via la coloration GFAP et la modification des dendrites neuronales par coloration pour MAP2. De plus, l’organisation en couches de la rétine permet une analyse détaillée des processus de Müller et des cellules ganglionnaires, tels que les changements de largeur et de continuité. Bien que les données présentées proviennent de la culture rétinienne porcine, le système est applicable à plusieurs espèces. Ainsi, le modèle fournit un outil fiable pour étudier les effets précoces de la compromission de l’intégrité des vaisseaux rétiniens sur différents types de cellules et également pour évaluer les candidats médicaments potentiels pour le traitement.

Nous présentons, un système de temps efficace et facile à utiliser à faible coût pour évaluer les traitements potentiels qui pourraient protéger contre la violation BRB induite par l&#39;histamine. L&#39; IgG est limitée dans les vaisseaux de la rétine témoin (figure 1A), mais les fuites hors des vaisseaux sanguins lors d&#39;une exposition à l&#39;histamine (figure 1B), ce qui confirme que le modèle est établi avec succès. <p class="jove_content" fo...

Un faible coût, système facile à utiliser et puissant est mis en place pour évaluer les traitements qui pourraient améliorer la violation du sang barrière rétinienne induite par l&#39;histamine. navire de fuite de sang, l&#39;activation des cellules Müller et la continuité des processus neuronaux sont utilisés pour évaluer la réponse aux dommages et son inversion avec un médicament potentiel, la lipoxine A4.

Un modèle aigu rétinienne pour l&#39;évaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Le but général de ce système de modèle rétinien ex vivo est de tester des médicaments capables d'améliorer la rupture de la barrière hémoneurale. Cette méthode permet de répondre à plusieurs questions clés dans le domaine des maladies neurodégénératives, telles que quelles sont les premières manifestations, et comment pouvons-nous sélectionner des médicaments susceptibles d'aider ces patients. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est peu coûteuse, facile à utiliser, rapide et adaptable.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car l'obtention de données fiables et reproductibles dépend des compétences techniques nécessaires pour produire de bons échantillons. Ici, des rétines de porc provenant d'une source commerciale sont utilisées. Après leur obtention, les globes oculaires doivent être conservés à quatre degrés ou sur de la glace, et être traités le plus rapidement possible.Commencez la dissection dans une hotte de culture tissulaire en coupant autour du cristallin pour ouvrir la capsule oculaire. Ensuite, à l’aide d’un pinceau, retirez délicatement l’humeur vitrée sans tirer sur la rétine. Utilisez un pinceau pour détacher doucement la rétine du bord coupé afin d’exposer le disque optique.Sectionnez le nerf optique avec un rasoir et libérez la rétine. Transférez la rétine dans une boîte de Pétri et rincez-la soigneusement une fois à l'aide d'HBSS froid. Placez l'échantillon dans l'HBSS sur de la glace.Ensuite, utilisez un rasoir pour couper la rétine en deux de manière symétrique. Lorsque des traitements sont nécessaires, une moitié de la rétine est traitée, tandis que l'autre moitié de la même rétine doit être analysée afin d'établir une ligne de base et de corriger les variations entre animaux. Transférez délicatement les échantillons dans une plaque à six puits contenant trois millilitres de milieu de stabilisation par puits.Équilibrez les rétines pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur dont l'atmosphère contient 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation, aspirez soigneusement le milieu de stabilisation et ajoutez trois millilitres de milieu contenant de l'histamine et du LXA4 dans chaque puits. Incubez les échantillons pendant une heure supplémentaire.Après un rinçage avec du PBS stérile tiède, ajouter trois millilitres de PFA à 4 % dans chaque puits et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Une fois le temps d'incubation écoulé, aspirer rapidement le PFA et rincer les échantillons une fois avec du PBS. Ajouter du saccharose à 10 % dans les puits et incuber de deux à quatre heures à quatre degrés Celsius.Ensuite, remplacez le saccharose à 10 % par du saccharose à 30 % et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Puis mélangez une partie de milieu de congélation commercial avec deux parties de saccharose à 20 % afin d'obtenir un milieu de congélation de travail. Laissez reposer à quatre degrés Celsius toute la nuit ou plus longtemps, jusqu'à ce que les bulles d'air disparaissent.Le lendemain, remplacer la solution de saccharose à 30 % par le milieu de congélation de travail et laisser équilibrer pendant cinq minutes à température ambiante. Après l'équilibration, découper chaque rétine en rectangles de trois millimètres sur cinq millimètres, puis congeler les tranches de rétine en les plaçant dans le milieu de congélation contenu dans un cylindre en aluminium. Veiller à ce que les tranches de rétine soient verticales afin d'obtenir une section transversale de la rétine lors de la coupe, et les congeler dans de l'azote liquide.Découper chaque bloc au cryostat en tranches de 14 micromètres et monter les sections sur des lames en verre. Conserver les lames à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Commencer la coloration immunohistochimique en lavant les sections avec un tampon phosphate de saccharose à 5 %, ou SPB.Ensuite, bloquer les sites de liaison non spécifiques en incubant les sections avec le tampon de blocage pendant une heure à température ambiante. Puis, incuber les sections avec l'anticorps primaire approprié pendant une heure. Une fois l'heure écoulée, aspirer la solution et laver les sections trois fois dans du SPB à 5 %.Incubez ensuite les sections avec les anticorps secondaires correspondants pendant une heure, à l'abri de la lumière. Après avoir lavé les sections trois fois avec du SPB 5 %, préparez les échantillons pour la microscopie en les montant dans un milieu contenant du DAPI, puis en les recouvrant de lamelles. Enfin, acquérez les images à l'aide d'un microscope confocal.Pour mesurer la largeur du processus, utilisez l'outil loupe pour sélectionner une zone de la section où les processus sont visibles, comme la couche nucléaire externe. Ensuite, choisissez un champ optique dans lequel ces processus sont visibles et continus. Cliquez sur l'outil analyser dans le menu principal, puis cliquez sur définir l'échelle dans le sous-menu, afin de régler la barre d'échelle selon le réglage microscopique.Sélectionnez la fonction de ligne dans le menu principal et tracez une ligne traversant le processus. Cliquez sur analyser dans le menu principal, puis sur mesurer dans le sous-menu, pour effectuer la mesure. Pour analyser la continuité du processus, revenez au menu principal et utilisez la fonction polygone pour sélectionner la couche plexiforme interne comme région d’intérêt.Mesurez la surface en cliquant sur analyser, puis sur mesurer. Cliquez sur traitement, filtre, puis variantes, afin d'améliorer les contours de l'image en remplaçant chaque pixel par la variante de son voisinage. Ensuite, ajustez automatiquement le contraste et la luminosité en cliquant sur image, ajuster, luminosité et contraste, puis sur auto dans le sous-menu.Ensuite, comptez les lignes. Sur ces images, l'immunoréactivité de l'IGG apparaît en rouge. Dans les groupes témoins, l'IGG est limitée aux vaisseaux sanguins.Dans le groupe histamine, l'IGG est détectée à l'extérieur des vaisseaux sanguins, où elle forme des nuages de fuite indiqués par des cercles en pointillés. Dans les groupes traités par la LXA4, l'IGG est à nouveau confinée à l'intérieur des vaisseaux sanguins. L'ajout supplémentaire de LXA4 permet de restaurer la fonction des vaisseaux altérée par l'histamine.Cet histogramme montre le pourcentage de vaisseaux sanguins fuyants dans les différents groupes testés. Sur ces images, une immunomarquage pour la GFAP, qui marque les cellules de Müller, est présenté. Un marquage positif est observé dans les prolongements des cellules de Müller, à travers la rétine et autour des vaisseaux sanguins.La largeur des prolongements des cellules de Müller, provenant de tous les groupes, est présentée. Le traitement par l'histamine ou par le LXA4 seul a réduit la largeur des prolongements. Toutefois, lorsque les deux réactifs ont été appliqués ensemble, la largeur des prolongements a été restaurée.Dans ces images, la coloration immunohistochimique pour MAP2 est présentée. Une coloration positive provenant des prolongements et des corps cellulaires des cellules ganglionnaires est observée. La densité des prolongements continus des cellules ganglionnaires positifs pour MAP2 provenant de tous les groupes est présentée.Le traitement à l'histamine diminue la continuité des prolongements dendritiques, tandis que le LXA4 n'a aucun effet significatif. Une fois maîtrisée, cette expérience peut être réalisée en trois à cinq jours, si elle est effectuée correctement, avec cinq minutes par rétine pour la dissection, six minutes pour le traitement, suivies de la sectionnement, de l'immunomarquage et de l'analyse. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'utiliser des tissus frais et des contrôles appropriés.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'imagerie en temps réel peuvent être ajoutées afin de suivre les changements en temps réel des niveaux de calcium et des propriétés mitochondriales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser ce modèle de culture rétinienne aiguë ex vivo pour induire une dysfonction de la barrière hématorétinienne, évaluer les lésions et effectuer un criblage de médicaments potentiels. Merci beaucoup d'avoir regardé cette vidéo et bon courage pour vos expériences.

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