Un modèle aigu rétinienne pour l'évaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement

Un faible coût, système facile à utiliser et puissant est mis en place pour évaluer les traitements qui pourraient améliorer la violation du sang barrière rétinienne induite par l'histamine. navire de fuite de sang, l'activation des cellules Müller et la continuité des processus neuronaux sont utilisés pour évaluer la réponse aux dommages et son inversion avec un médicament potentiel, la lipoxine A4.

L’objectif global de ce système modèle rétinien ex vivo est de cribler des médicaments qui améliorent la brèche de la barrière neuronale sanguine. Cette méthode peut répondre à plusieurs questions clés dans le domaine des maladies dégénératives neuronales, comme quels sont les premiers événements et comment pouvons-nous dépister des médicaments qui peuvent aider à traiter ces patients. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est peu coûteuse, facile à utiliser, rapide et adaptable.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car l’obtention de données fiables et reproductibles dépend des compétences techniques nécessaires pour générer de bons échantillons. Les premières rétines porcines, obtenues à partir d’une source commerciale, sont utilisées ici. Après l’approvisionnement à la source, les globes oculaires doivent être maintenus à quatre degrés, ou sur de la glace, et traités dès que possible.

Commencez la dissection dans un pare-soleil de culture tissulaire en coupant autour de la lentille pour ouvrir l’œillet. Ensuite, à l’aide d’une brosse, retirez délicatement l’humeur vitrée, sans tirer sur la rétine. À l’aide d’une brosse, détachez doucement la rétine du bord coupé, afin d’exposer le disque optique.

Sectionnez le nerf optique avec un rasoir et relâchez la rétine. Transférez la rétine dans une boîte de Pétri et rincez soigneusement la rétine une fois à l’aide de HBSS froid. Placez l’échantillon dans HBSS sur de la glace.

Ensuite, utilisez un rasoir pour couper la rétine en deux de manière symétrique. Lorsque des traitements sont nécessaires, une moitié de la rétine est traitée, tandis que l’autre moitié de la même rétine doit être traitée pour établir la référence et corriger les variations animales. Transférez doucement les échantillons dans une plaque à six puits contenant trois millilitres de milieu de stabilisation par puits.

Équilibrez les rétines pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur dont l’atmosphère contient 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, aspirez soigneusement le milieu de stabilisation et ajoutez trois millilitres de milieu contenant de l’histamine et du LXA4 dans chaque puits. Incuber les échantillons pendant une heure supplémentaire.

Après avoir rincé avec du PBS stérile chaud, ajoutez trois millilitres de PFA à 4 % dans chaque puits et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Une fois le temps d’incubation écoulé, aspirez rapidement le PFA et rincez les échantillons une fois avec du PBS. Ajoutez 10 % de saccharose dans les puits et incubez pendant deux à quatre heures à quatre degrés Celsius.

Ensuite, remplacez les 10 % de saccharose par 30 % de saccharose et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Mélangez ensuite une partie de produit de congélation commercial avec deux parties de 20 % de saccharose, pour obtenir un produit de congélation fonctionnel. Laisser à quatre degrés Celsius toute la nuit ou plus longtemps jusqu’à ce que les bulles d’air disparaissent.

Le lendemain, remplacez le saccharose à 30 % par un produit de congélation fonctionnel et laissez-le s’équilibrer pendant cinq minutes à température ambiante. Après l’équilibrage, coupez chaque rétine en rectangles de trois millimètres sur cinq millimètres, puis congelez les tranches de rétine en les plaçant dans un produit de congélation, contenu dans un cylindre de feuille d’aluminium. Assurez-vous que les coupes rétiniennes sont verticales pour fournir une coupe transversale de la rétine lors de la section, et congelez-les dans de l’azote liquide.

Sectionnez chaque bloc d’un cryostat en tranches de 14 microns et montez les sections sur des lames de verre. Conservez les lames à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Commencez l’immunocoloration en lavant les sections avec un tampon de phosphate de saccharose à 5 %, ou SPB.

Bloquez ensuite les sites de liaison non spécifiques, en incubant les sections et en bloquant le tampon pendant une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les sections avec l’anticorps primaire approprié pendant une heure. Une fois l’heure écoulée, aspirez la solution et lavez les sections trois fois avec du SPB à 5 %.

Ensuite, incubez les sections avec les anticorps secondaires correspondants pendant une heure, à l’abri de la lumière. Après avoir lavé les sections trois fois avec 5 % de SPB, préparez les échantillons pour la microscopie en les montant dans un milieu contenant du DAPI et en les recouvrant de lamelles. Enfin, capturez des images à l’aide d’un microscope confocal.

Pour mesurer la largeur du processus, utilisez la loupe pour choisir une zone de la section où les processus se déplacent, comme la couche nucléaire externe. Choisissez ensuite un champ optique où ces processus sont visibles et continus. Cliquez sur l’outil d’analyse dans le menu principal, puis cliquez sur définir l’échelle dans le sous-menu, pour définir la barre d’échelle en fonction du paramètre microscopique.

Sélectionnez la fonction ligne dans le menu principal et tracez une ligne sur le processus. Cliquez sur Analyser dans le menu principal, puis sur Mesure dans le sous-menu pour effectuer la mesure. Pour analyser la continuité du processus, revenez au menu principal et utilisez la fonction polygone pour sélectionner la couche plexiforme interne comme région d’intérêt.

Mesurez la zone en cliquant sur Analyser, puis sur Mesurer. Cliquez sur Traiter, Filtrer, puis sur Variantes, pour améliorer les bords de l’image en remplaçant chaque pixel par sa variante de voisinage. Ensuite, ajustez automatiquement le contraste et la luminosité en cliquant sur image, ajuster, luminosité et contraste, puis auto dans le sous-menu.

Comptez ensuite les lignes. Sur ces images, l’immunoréactivité IGG est visible en rouge. Dans les groupes témoins, l’IGG est limitée dans les vaisseaux sanguins.

Dans le groupe histamine, l’IGG est détecté à partir des vaisseaux sanguins, où il forme des nuages de fuite indiqués par des cercles pointillés. Dans les groupes traités par LXA4, l’IGG est à nouveau restreint dans les vaisseaux sanguins. L’ajout supplémentaire de LXA4 sauve la fonction des vaisseaux induite par l’histamine.

Cet histogramme montre le pourcentage de vaisseaux sanguins qui fuient dans les groupes testés. Dans ces images, l’immunomarquage pour GFAP, qui colore les cellules de Muller, est présenté. La coloration positive est obtenue dans les processus des cellules de Muller, à travers la rétine et autour des vaisseaux sanguins.

La largeur des processus de la cellule de Müller, de tous les groupes est présentée. Le traitement à l’histamine, ou LXA4 seul, a réduit la largeur du processus. Mais lorsque les deux réactifs ont été appliqués ensemble, la largeur du processus a été sauvée.

Dans ces images, l’immunomarquage pour MAP2 est présenté. Une coloration positive des processus et des corps cellulaires des cellules ganglionnaires est observée. La densité des processus continus de cellules ganglionnaires positives à MAP2 de tous les groupes est présentée.

Le traitement à l’histamine diminue la continuité des processus dendritiques, tandis que LXA4 n’a pas d’effets significatifs. Une fois maîtrisée, cette expérience peut être réalisée en trois à cinq jours, si elle est effectuée correctement, avec cinq minutes par rétine pour la dissection, six minutes pour le traitement, suivies d’une section, d’une immunocoloration et d’une analyse. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser des tissus frais et des contrôles appropriés.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’imagerie en direct, peuvent être ajoutées, pour suivre en temps réel les changements dans les niveaux de calcium et les propriétés mitochondriales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ce modèle de culture rétinienne aiguë ex vivo, pour créer un dysfonctionnement de BRB, pour évaluer les dommages et pour dépister les médicaments potentiels. Merci beaucoup d’avoir regardé et tout le meilleur pour vos expériences.