Un test basé CFSE pour étudier la migration de la peau murine cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques de drainage lors de l'infection avec

Le but général de ce dosage basé sur un traceur cellulaire fluorescent est de surveiller et de caractériser des populations cellulaires spécifiques d'intérêt au fur et à mesure qu'elles migrent de la peau vers le ganglion lymphatique drainant après une infection de la pulpe plantaire par le Bacille Calmette-Guérin, ou BCG. Nous avons utilisé cette technique pour identifier la population de cellules dendritiques qui migrent vers le ganglion lymphatique drainant après une infection cutanée par le BCG. Cette technique a permis d'étudier la migration cellulaire en injectant les tumeurs pendant une fenêtre définie de 24 heures.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'injection dans la plante du pied et d'isolement des ganglions lymphatiques sont difficiles à apprendre à partir d'un texte uniquement. Pour l'injection de microbactérium Bovis BCG, après avoir confirmé le niveau approprié de sédation par une pression sur l'orteil, utilisez une seringue équipée d'une aiguille de calibre 29 et de 1/2 pouce pour inoculer la plante du pied postérieur d'une souris âgée de huit à douze semaines avec une concentration de 1 × 10⁶ unités formant des colonies de bactéries dans 30 µL de PBS. Injectez les pieds témoins avec du PBS uniquement.

Ensuite, surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils soient complètement couchés et capables de poser du poids sur la patte injectée. Pour l'injection de CFSE, au moment approprié après l'injection de BCG, diluer dix fois un flacon de CFSE à température ambiante et à cinq millimolaire dans du PBS, en veillant à bien resuspendre la solution. Puis, charger la seringue avec le CFSE dilué et administrer 20 microlitres dans la même patte postérieure qui a reçu la première injection.

24 heures après l'injection de CFSE, effectuez soigneusement une incision verticale dans la cuisse postérieure et retirez la graisse musculaire. Ensuite, utilisez des ciseaux et une pince pour exposer et exciser le ganglion lymphatique poplité, situé profondément dans la poche adipeuse au creux du genou. Transférez le ganglion lymphatique dans 0,5 millilitre de PBS stérile sur de la glace, puis homogénéisez-le à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 microns placé dans une cavité d’une plaque à six puits contenant cinq millilitres de PBS, en utilisant l’extrémité arrière d’une seringue de trois millilitres.

Lavez le filtre avec 5 millilitres supplémentaires de tampon, puis transférez la solution cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules et remettez en suspension le culot dans un volume suffisant de tampon. Pour marquer les cellules en vue d'une cytométrie en flux, je place de un à dix fois dix puissance six cellules dans des tubes polystyrènes de 5 millilitres à fond rond, puis je lave les cellules dans du tampon FACS frais.

Resuspendre les culots dans 50 à 100 microlitres de cocktail d'anticorps approprié contenant de l'anti-CD16 CD32 de souris pour bloquer les interactions FC non spécifiques dans le tampon FACS sur de la glace, à l'abri de la lumière. Après 30 à 45 minutes, laver les cellules dans le tampon FACS et resuspendre les culots dans 50 à 100 microlitres de tampon FACS frais. La majorité du marquage par CFSE dans le ganglion lymphatique poplité est observée dans les cellules MHC-II fortes et CD11c positives faibles, en accord avec les cellules dendritiques cutanées qui migrent vers les ganglions lymphatiques drainant la peau.

La fréquence et le nombre total de ces cellules marquées semblent augmenter dans les ganglions lymphatiques poplités des souris infectées par le BCG, par rapport aux témoins injectés avec du PBS, suggérant que le BCG favorise le reclassement de ces cellules vers le ganglion lymphatique drainant. Les cellules dendritiques cutanées continuent d'entrer dans le ganglion lymphatique drainant jusqu'à cinq jours après l'infection, prolongeant ainsi la migration des cellules dendritiques dans le modèle actuel bien au-delà de la période nécessaire à l'activation initiale des lymphocytes T CD4 positifs spécifiques de l'antigène dans le ganglion lymphatique poplité. De plus, les cellules dendritiques cutanées migratrices expriment des niveaux élevés de molécules co-stimulatrices, ce qui soutient l'idée que ces cellules dendritiques migratrices sont activées.

Il est important de noter que les deux types de cellules dendritiques, les cellules dendritiques monocytoïdes et plasmacytoïdes résistantes aux ganglions lymphatiques, qui pénètrent dans les ganglions lymphatiques enflammés par les veinules endothéliales hautes et non par les lymphatiques afférentes, sont négatives pour le CFSE, ce qui confirme davantage que le marquage au CFSE se produit principalement dans la pulpe plantaire. De plus, une analyse cytométrique en flux supplémentaire révèle qu'une sous-population de cellules EpCAM faible CD11b forte constitue le principal sous-ensemble de cellules dendritiques cutanées migratrices qui drainent vers le ganglion lymphatique poplité en réponse à une infection par le BCG. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq minutes si elle est correctement exécutée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire preuve de prudence quant au site d'injection et au volume injecté ; une grande attention doit être portée afin de ne pas endommager le ganglion lymphatique drainant pendant la dissection. Après la procédure, d'autres méthodes telles que la cytométrie en flux ou la microscopie confocale peuvent être réalisées afin d'analyser plus en détail l'expression microscopique cellulaire spécifique aux sous-populations. Cette technique a permis aux chercheurs de suivre les cellules de la peau jusqu'au ganglion lymphatique drainant, dans un délai de 24 heures suivant une infection ou une vaccination.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des injections dans la paume des pattes et localiser, puis isoler les ganglions lymphatiques drainants afin de suivre et caractériser les populations de cellules dendritiques migratrices d'intérêt.