Name: Transduction-Transplantation Modèle de souris de syndrome myéloprolifératif (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez la méthode de transduction-transplantation pour générer des modèles murins exprimant des gènes d'intérêt dans les cellules hématopoïétiques. Cette technique permet d'étudier les malignités hématologiques et l'hématopoïèse normale.

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Ce travail est soutenu par le V Foundation Scholar (AGF) et la MPN Research Foundation (AGF).

Cette étude a été approuvée et réalisée conformément aux recommandations formulées par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;Université de Californie, Irvine. Toutes les procédures ont été réalisées sous anesthésie à l&#39;isoflurane et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. 1. Production de retrovirus écotropique <ol><li> Préparer des plasmides de haute qualité avec une concentration d&#39;au moins 1 pg / pl en utilisant soit un kit maxi-prep commerciale ou la purification de chlorure de césium. NOTE: notamment un vecteur MSCV squelette codant pour le gène d&#39;intérêt (dans ce cas CALR 7,8) et marqueur de choix (GFP, Neo, etc.) ainsi qu&#39;un emballage plasmide écotrope, codant gag-pol-env (appelé ici en tant que plasmide). </li><li> Décongeler et divertissez cellules 293T faible passage dans DMEM additionné de 10% de FBS et L-glutamine avec de la pénicilline / streptomycine (D10). Plate 5 x 10 6 cellules dans une boîte de culture traitée de tissu 10 cm dans un humidifiéla culture tissulaire incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Développer des cellules 293T en culture. Le jour avant la transfection, laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS et aspirer le surnageant dans un ballon à vide. </li><li> À trypsiniser cellules, ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% et on incube la vaisselle dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée pendant 2 à 3 min à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Pour arrêter trypsinisation, ajouter 3 ml D10 à plat et les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Faire tourner les cellules à 400 xg pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et resuspendre le culot de cellules dans 2 ml de D10. </li><li> Compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Seed 2 x 10 6 cellules par boîte en trois 10 cm de culture tissulaire traités plats par virus générés. REMARQUE: Pour des résultats optimaux, ne permettent pas aux cellules de dépasser 30 - 50% de confluence au moment de la transfection ou un rendement de virus pauvre peut être obtenu. </li><li> Immédiatement avant la transfection,médias aspirés dans une fiole à vide et remplacer par 5 ml de D10 frais. </li><li> Pour tous les 10 cm boîte de Pétri à transfecter préparer un tube de 1,5 ml stérile individuel. </li><li> Pipette 760 ul de milieu de sérum réduit dans chaque tube à centrifuger, puis ajouter soigneusement 40 ul de réactif de transfection directement dans les médias. Incuber les tubes dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter 30 pg de MSCV vecteur avec le gène d&#39;intérêt (15 ug si on utilise un vecteur vide), ainsi que 5 ug de plasmide dans chaque tube respectif et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber à la température ambiante sous la hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes supplémentaires. NOTE: Les petits vecteurs ont tendance à avoir des rendements viraux plus élevés. </li><li> Ajouter délicatement le volume total de chaque réaction (environ 800 pi) goutte à goutte dans sa 10 cm boîte de Pétri respective et inclinez légèrement le plat d&#39;un côté à l&#39;autre pour mélanger. cellules Retour à la cu tissulaire humidifiéincubateur lture. </li><li> Après 8 heures, ou une nuit d&#39;incubation dans une culture tissulaire incubateur, les médias aspirés dans une fiole à vide et doucement remplacer par 10 ml de D10 frais. </li><li> A 48 heures post-transfection recueillir surnageant dans une seringue de 35 ml et filtrer à travers une membrane de 0,45 um pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> EN OPTION: Placer 10 ml D10 frais de retour sur les cellules 293T et virus supplémentaire peut être récolté à 72 heures après la transfection. </li><li> Jeter les cellules 293T dans les déchets biohazard quand aucun virus supplémentaire est recueilli. </li><li> aliquote surnageant viral dans des volumes à usage unique (par exemple 1 ml pour le titre viral ou 6,5 ml pour une infection BM). virus Flash gel avec de l&#39;azote liquide et le virus de la conserver à -80 ° C. REMARQUE: Éviter les cycles répétés de gel / dégel , car ils réduisent grandement le titre viral. </li></ol> 2. Déterminer Titer Relative Viral par cytométrie de flux <ol><li> Décongeler les cellules 3T3 et maintenir en D10. La culture des cellules dans 10 cmculture tissulaire traitée plat dans un incubateur humidifié de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Effectuer le titre viral en triple exemplaire. Pour préparer des cellules, laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS et aspirer le surnageant dans un ballon à vide. </li><li> À trypsiniser cellules, ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% et on incube la vaisselle dans un incubateur humidifié de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Pour arrêter trypsinisation, ajouter 3 ml D10 à plat et les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Faire tourner les cellules à 400 xg pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et resuspendre le culot de cellules dans 2 ml de D10. </li><li> Compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Semence des cellules 3T3 à une densité de 1 x 10 5 cellules dans les quinze boîtes de culture de tissus traités par 60 mm et incuber pendant une nuit. </li><li> Faire 1: 3, 1:10, 1:30 et 1: 100 dilutions de surnageant viral décongelé en utilisant D10 dans un total de 1 ml. Inclure aussi un contrôle sans virus. </li><li> aspirer media de cellules 3T3 dans un flacon à vide et la remplacer par 4 ml de D10. </li><li> Superposer les cellules 3T3 avec les dilutions du surnageant viral et ajoute du polybrène à une concentration finale de 8 ug / ml dans chaque boîte. Incuber pendant 48 heures dans la culture tissulaire incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Déterminer par rapport titre viral par cytométrie de flux: <ol><li> Pour laver les cellules, aspirer les médias dans un flacon à vide et ajouter 5 ml de PBS. </li><li> Aspirer le PBS dans un flacon à vide. Ajouter 1 ml de 0,05% de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2 - 5 min pour détacher les cellules du plat. </li><li> Ajouter 3 ml D10 et la pipette de haut en bas pour détacher toutes les cellules restantes de la plaque. Transférer les cellules dans un tube FACS et centrifuger à 400 g pendant 10 min. </li><li> Décanter le surnageant et laver les cellules avec 3 ml de PBS. Centrifugeuse à 400 g pendant 10 min et le surnageant de décantation. Remettre en suspension dans 200 ul de PBS. </li><li> Cellules Exécuter sur un cytomètre de flux 9. Collecter entre 20.000 - 30.000 événements dans til vit la porte de la cellule (déterminée par FSC vs SSC) et calculer le pourcentage de la GFP + et GFP - cellules. NOTE: Le titre viral est considéré comme acceptable lorsque la dilution 1:30 du rendement surnageant viral au moins 50% GFP + 3T3 cellules. Si cette dilution des résultats dans moins de 50% des cellules GFP + , puis les résultats de transduction suboptimales peuvent être obtenus. Le calcul pour déterminer le titre viral a été adapté de Limon et al. Blood (1997) 9. </li><li> Pour déterminer par rapport titre du virus, utilisez l&#39;équation: titre viral = particules formant des unités (PFU) / ml = [(Nombre de cellules 3T3 × Fréquence de cellules GFP +) / volume de surnageant (ml)] x facteur de dilution. </li></ol></li></ol> 3. transduction donateurs cellules de moelle osseuse <ol><li> Pour préparer souris donneuses pour la moelle osseuse (BM) récolte, premier anesthésier souris par vaporiseur isoflurane avec un taux de 5% supplémentaire combiné de débitoxygène à 1 L / min. Pincez pied pour évaluer la réactivité. NOTE: Les souris donneuses (moins de 8 semaines) devraient être préparés 5 jours avant la récolte de la moelle osseuse (8 jours avant la transplantation). Un souris donateurs fourniront suffisamment de cellules pour au moins 2 destinataires. </li><li> Injecter 150 mg / kg de 5-fluorouracile (5-FU) par injection rétro-orbital dans des souris anesthésiées au moyen d&#39;un 27 G x ½ &quot;aiguille. PRUDENCE! 5-FU, un agent chimiothérapeutique anti-cancéreux. Toujours manipuler 5-FU dans une hotte chimique certifié ou une enceinte de biosécurité canalisé. Consulter avec le comité de sécurité en laboratoire et des animaux de l&#39;institution pour déterminer l&#39;étiquetage approprié des souris traitées avec le 5-FU. <ol><li> Placez la souris anesthésiée sur le côté et retenir en utilisant à la fois le pouce et l&#39;index de telle sorte que l&#39;œil dépasse légèrement de la tête. </li><li> En commençant par la partie latérale de l&#39;aiguille du canthus interne et avec le biseau vers le haut, insérer l&#39;aiguille à un 45° angle dans le sens médial et arrêter lorsque l&#39;aiguille est à mi-chemin inséré. Injecter lentement les cellules et enlever retirer délicatement l&#39;aiguille. NOTE: Si cette technique est effectuée correctement, l&#39;œil doit se rétracter légèrement et aucune résistance doit être ressentie lors de l&#39; insertion de l&#39; aiguille. </li><li> Examiner la souris pour tout signe de blessure, tels que le gonflement ou de saignements. </li></ol></li><li> Récolte de moelle osseuse de 5 jours après le traitement 5-FU (3 jours avant la transplantation). <ol><li> Anesthetize souris par vaporisateur isoflurane avec un débit de 5% d&#39;oxygène supplémentaire combiné à 1 L / min. Pincez pied pour évaluer la réactivité. </li><li> Sacrifiez la souris par dislocation cervicale. Stériliser souris par pulvérisation généreusement avec 70% EtOH jusqu&#39;à ce que la fourrure est mouillé. </li><li> Utilisation de disséquer des ciseaux, faire une incision dans la peau et disséquer le fascia loin des muscles de la jambe. Ensuite, disséquer la jambe loin de la souris en coupant le fémur à la hanche et le tibia à la cheville. </li><li> plierla jambe en forme de «L» et séparer chaque os jambe en coupant à l&#39;articulation du genou avec des ciseaux de dissection. </li><li> Pour retirer le cartilage aux extrémités distales de chaque os de la jambe, utiliser les ciseaux de dissection pour gratter délicatement le muscle vers une extrémité de l&#39;os de la jambe jusqu&#39;à ce que le cartilage est désengagé. </li><li> En utilisant une seringue avec une aiguille 27 G x ½ pouces, rincer chaque os jambe avec du PBS additionné de 2% de FBS sur une membrane en nylon de 100 uM dans un tube conique de 50 ml. os Flush jusqu&#39;à l&#39;os devient blanc pour maximiser le nombre de cellules récoltées. </li><li> Utiliser le piston d&#39;une seringue pour écraser les cellules à travers la membrane en nylon dans le tube conique de 50 ml pour obtenir une suspension cellulaire unique. Répétez avec l&#39;autre jambe de la souris. </li></ol></li><li> Centrifuger les cellules à 4 ° C pendant 10 min à 400 xg et jeter le surnageant. Remettre en suspension dans 5 ml BM chlorure d&#39;ammonium potassium (ACK) du tampon pour lyser les globules rouges. Incuber les cellules sur de la glace pendant 10 minutes. </li><li> Remplir le tube avec du PBS pour arrêter la lyse cellulaire. Centricellules Fuge à 4 ° C pendant 10 min à 400 xg et jeter le surnageant. Répétez l&#39;étape de lyse si le culot BM a la couleur rouge. </li><li> Remettre en suspension dans 5 ml de PBS et compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Resuspendre les cellules à 2 x 10 6 cellules par m avec un cocktail de pré-Stim 2x contenant du DMEM supplémenté avec 20% de FBS, L-glutamine, de la pénicilline / streptomycine, l&#39; IL-3 (14 ng / ml), l&#39; IL-6 (24 ng / ml) et du SCF (112 ng / ml). Plate 2 ml par puits en plaques à 6 puits. </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Ajouter 2 ml de surnageant viral dans chaque puits contenant des cellules BM et ajouter polybrène (8 ug / ml). plaques de Spin à 30 ° C pendant 90 min à 1500 xg retournent ensuite la plaque au tissu incubateur de culture durant la nuit. </li><li> Pipette suspension cellulaire dans des tubes coniques et centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 400 g, ne jetez pas la plaque. Resuspendre les cellules dans 2 ml cocktail frais pré-stim 2x par puits et retourner dans les puits d&#39;origine. </li&gt; <li> Effectuer une 2 ème spinoculation en répétant les étapes 3,7-3,9. </li></ol> 4. Les cellules Transplant des donateurs sur les souris receveuses <ol><li> Préparer des souris receveuses syngéniques pour la transplantation avec une dose létale totale irradiation corporelle &lt;24 heures avant l&#39;injection de cellules BM. NOTE: l&#39; irradiation de la dose létale pour les souris BALB / c est typiquement 800-900 cGy et 1000-1200 cGy pour C57B / 6 10. La dose est généralement divisée en deux sessions d&#39;irradiation espacées d&#39;au moins 3-4 heures d&#39;intervalle. </li><li> Suite de l&#39;étape 3.11, les cellules du donneur de récolte transduction des plaques 6 puits par pipetage surnageant dans des tubes coniques. Laver chaque puits avec 1 ml de PBS pour recueillir les cellules résiduelles et l&#39;ajouter à 50 ml tubes coniques. </li><li> Ajouter 0,5 ml de trypsine à 0,05% dans les puits et incuber à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture tissulaire pendant 5 min. </li><li> Ajouter 1 ml D10 aux puits et détacher les cellules restantes par pipetage doux. Ajouter les cellules au tube respectifs à l&#39;étape 4.2 et le culot par centrifugation à 4 ° C pendant 10 min à 400 x g. </li><li> Laver les cellules avec du PBS et on centrifuge à 4 ° C pendant 10 min à 400 x g. Resuspendre dans 5 ml de PBS et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre par exclusion au bleu trypan. NOTE: Si le vecteur a une balise GFP puis quantifier le pourcentage de cellules GFP-positives avec un cytomètre de flux. </li><li> Remettre en suspension à 5 x 10 5 - 2 x 10 6 cellules de 50 à 100 ul de PBS pour l&#39; injection à des souris. </li><li> Injecter cellules par injection rétro-orbital dans des souris anesthésiés en utilisant un 27 G x ½ &quot;aiguille stérile. NOTE: D&#39; autres techniques d&#39;injection comprennent la queue veine, splénique ou fémorale. <ol><li> Anesthetize souris à l&#39;aide d&#39;isoflurane et pincer le pied pour évaluer la réactivité. </li><li> Placez la souris sur le côté et retenir en utilisant à la fois le pouce et l&#39;index de telle sorte que l&#39;œil dépasse légèrement de la tête. </li><li> Avec le biseau vers le haut, insérez le nEedle latéral au canthus interne à un angle de 45 °. NOTE: Si cette technique est effectuée correctement, l&#39;œil doit se rétracter légèrement et aucune résistance doit être ressentie lors de l&#39; insertion de l&#39; aiguille. </li><li> Examiner la souris pour tout signe de blessure, tels que le gonflement ou de saignements. REMARQUE: les souris de transplantation suivants ont des numérations globulaires faibles pour un certain nombre de semaines et sont donc sensibles à l&#39; infection. Prophylaxie avec des antibiotiques ou l&#39;utilisation de l&#39;eau acidifiée peut être utilisé. </li></ol></li><li> Un mois après la transplantation, mesurer la GFP% dans le sang périphérique comme un indicateur de cellules donneuses greffées par cytométrie de flux. NOTE: GFP seule ne peut pas déterminer le succès de la greffe des cellules. La transduction virale peut avoir encore échoué greffe peut avoir eu lieu. Dans ce cas, pas de cellules GFP + seraient détectés, mais la prise de greffe des cellules transplantées était réussie. <ol><li> Prendre 10 pl de sang périphérique by perforer la veine saphène de la jambe avec une 21 G x 1 ½ &quot;la seringue et l&#39;ajouter à 100 mM d&#39;EDTA dans du PBS pour empêcher la coagulation. </li><li> Ajouter 1 ml ACK au sang et lyse sur la glace pendant 10 min. cellules à pellets par centrifugation à 400 g pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et ajouter 1 ml de PBS additionné de 2% de FBS pour arrêter la lyse. cellules à pellets par centrifugation à 400 g pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS additionné de 2% de FBS. </li><li> Exécutez des échantillons sur un cytomètre de flux et de recueillir 300.000 événements au sein de la grille de cellules vivantes (déterminé par FSC vs SSC) et calculer le pourcentage de la GFP + et GFP - cellules 9. </li></ol></li><li> De plus à 1 mois après la transplantation, effectuer la numération globulaire complète (CBC) à l&#39; aide d&#39; un analyseur d&#39; hématologie vétérinaire automatisé 18 pour surveiller la progression de la maladie. NOTE: Continuer à surveiller la maladie en%GFP dans le sang périphérique et CBC mensuel. </li><li> Pour mettre fin à l&#39;expérience, anesthésier la souris en utilisant l&#39;isoflurane et pincée pied pour évaluer la réactivité. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale et la récolte de la rate et de la moelle osseuse pour l&#39;histopathologie. NOTE: La durée de l&#39;expérience est subjective et la date de résiliation doit être évaluée en fonction du phénotype de la maladie attendue. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole fournit une description détaillée de la façon d&#39;effectuer des greffes de moelle osseuse chez des souris de récapituler une maladie thrombocytémie comme essentielle à la progression de la myélofibrose avec mutation CALRdel52 comme le conducteur de la maladie. transplanter avec succès des cellules exprimant les résultats CALRdel52 une augmentation des plaquettes, l&#39;expansion des mégacaryocytes et la fibrose de la moelle osseuse. Comme greffe de moelle osseuse est un processus en plusieurs étapes, il e...

Transduction-transplantation est une méthode utile pour modéliser les hémopathies malignes chez les souris. Cette technique a été particulièrement précieux pour l&#39; étude des tumeurs malignes myéloïdes remontant à la première démonstration que l&#39; expression ectopique de BCR-ABL1 pourrait fidèlement récapituler la leucémie myéloïde chronique chez les souris 1. Cette technique a ensuite facilité l&#39;étude approfondie de JAK2 V617F et MPL W515K / L muté syndrome myéloprolifératif (MPN). NPP sont un groupe de tumeurs malignes caractérisées par une surproduction de cellules myéloïdes matures et une fibrose de la moelle osseuse. Ces maladies proviennent généralement de l&#39;expansion clonale d&#39;une cellule souche hématopoïétique qui a acquis une mutation somatique soit dans Jak2, MPL ou CALR. Transduction-transplantation JAK2 V617F et MPL W515K / L modèles présentent les caractéristiques cliniques de la maladie de Vaquez et myélofibrose 2-5 &lt;/ Sup&gt;. Récemment, un modèle de souris de la calréticuline mutée MPN a été généré par la méthode de transduction transplantation 6. Ces souris développent une maladie thrombocytémie comme essentielle à l&#39;augmentation des plaquettes, l&#39;augmentation du nombre de mégacaryocytes et la fibrose de la moelle osseuse. Ensemble, ces modèles ont non seulement donné l&#39;occasion de mieux comprendre la pathogenèse moléculaire de MPN, mais aussi la capacité à développer et à étudier la thérapeutique dans un cadre pré-clinique. Ce manuscrit fournit une description détaillée de la méthodologie transduction-transplantation avec un accent sur la mutation CALRdel52. Cette technique implique la transplantation de cellules de moelle osseuse transduites par un retrovirus exprimant le mutant de construction dans des souris receveuses syngéniques irradiés.

<table><tbody><tr><td>Lignées cellulaires </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cellules 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>3T3 cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak, également connu sous le nom de pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>Des lignées cellulaires d’emballage rétroviral, telles que EcoPack 2-293, peuvent être utilisées à la place du plasmide EcoPak et des cellules 293T standard. D’autres plasmides d’enveloppe et d’emballage du &gamma ;-rétrovirus sont disponibles auprès d’Addgene et d’autres.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene</td><td></td> <td>20672</td><td>Des plasmides de transfert &gamma ;-rétroviral supplémentaires sont disponibles auprès d’Addgene et d’autres.</td></tr><tr><td><fort>Consommables</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2" aiguilles</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine/L-glutamine</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>Peut être fait maison</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de 10 cm</td><td>Fisher</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>tubes coniques de 15 ml</td><td>Fisher</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>de 60 mm Boîtes</td><td>Fisher</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>en polybrène</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>Fisher</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &#181 ; Croires à cellules m Fisher</td><td></td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>tubes coniques de 50 ml</td><td>Fisher</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>à plaque à 6 puits</td><td>Fisher</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>tubes FACS</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu ; m filtres à seringue</td><td>Fisher</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Tampon ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Peut être fait maison</td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>1,5 ml tubes à centrifuger</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiateur</td><td></td><td></td><td></td> à rayons X</tr></tbody></table>

transduction-transplantation modèle de souris de syndrome myéloprolifératif

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

La transduction-transplantation est un moyen rapide et efficace de modéliser les hémopathies malignes humaines chez la souris. Cette technique permet d’exprimer le gène d’intérêt dans les cellules hématopoïétiques et peut être utilisée pour étudier le rôle du gène dans l’hématopoïèse normale et/ou maligne. Ce protocole fournit une description détaillée de la façon d’effectuer une transduction-transplantation en utilisant des mutations de la calréticuline (CALR) récemment identifiées dans le néoplasme myéloprolifératif (NMP) à titre d’exemple. Dans ce protocole, des cellules entières de moelle osseuse provenant de souris donneuses traitées au 5-flurouracil (5-FU) sont transduites avec un rétrovirus codant pour le CALR mutant et transplantées dans des hôtes syngéniques létalement irradiés. Les cellules donneuses exprimant des CALR mutants sont marquées par une protéine fluorescente verte (GFP). Les souris transplantées développent un phénotype MPN comprenant une élévation des plaquettes dans le sang périphérique, une expansion des mégacaryocytes dans la moelle osseuse et une fibrose de la moelle osseuse. Nous fournissons un compte rendu étape par étape de la génération du rétrovirus, du calcul du titre viral, de la transduction de cellules entières de la moelle osseuse et de la transplantation chez des souris receveuses irradiées.

La technique de transduction transplantation se traduit par la reconstitution hématopoïétique des souris receveuses avec des cellules exprimant le gène d&#39;intérêt. La figure 1 montre une vue d&#39; ensemble du modèle de souris transduction transplantation de calréticuline muté NPP. En bref, un retrovirus exprimant CALRwt ou CALRdel52 est utilisé pour infecter des cellules BM à partir d&#39;un donneur de souris C57B / 6. Les cellules transduites sont transplantées dans...

Ce manuscrit fournit une description de la méthodologie utilisée pour établir des modèles murins de transduction-transplantation. Un compte rendu détaillé est donné des erreurs techniques à éviter lors de la réalisation de greffes de moelle osseuse. Il faut bien comprendre l’importance d’un titre viral élevé, de la transfection/transduction et de l’irradiation.

Transduction-Transplantation Modèle de souris de syndrome myéloprolifératif

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des souris exprimant le gène d'intérêt dans les cellules hématopoïétiques en utilisant la méthode de transduction-transplantation. En peu de temps, cette méthode permet de déterminer si votre gène d'intérêt induit une malignité hématologique. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic des malignités hématologiques, grâce au développement accéléré de modèles murins permettant de tester des thérapeutiques putatives.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les malignités hématologiques, elle peut également être utilisée pour étudier le rôle d'un gène d'intérêt dans l'hématopoïèse normale. En général, les personnes novices dans cette expérience éprouveront des difficultés, car celle-ci requiert plusieurs étapes. Par ailleurs, la production d'un virus à haut titre est essentielle pour la réussite de cette expérience.La démonstration visuelle de cette procédure est importante, car le travail avec les souris peut être difficile et nécessite de la pratique. Après avoir anesthésié une souris et vérifié la profondeur de l'anesthésie conformément au protocole décrit dans le texte, placez la souris sur le côté et, à l’aide du pouce et de l’index, maintenez l’animal de manière à ce que l’œil dépasse légèrement de la tête. Pour injecter 150 milligrammes par kilogramme de 5-fluorouracile, ou 5-FU, par injection rétro-orbitaire, insérez une aiguille de 27 gauge d’un demi-pouce à un angle de 45 degrés, avec le biseau orienté vers le haut dans une direction médiale, et arrêtez-vous lorsque l’aiguille est insérée à moitié.Injectez lentement la solution, puis retirez soigneusement l'aiguille. Examinez la souris à la recherche de signes de lésion, tels qu'un gonflement ou un saignement, et assurez-vous que la souris récupère et commence à marcher. Cinq jours plus tard, après avoir sacrifié l'animal conformément au protocole décrit, utilisez de l'éthanol à 70 % pour stériliser la souris en vaporisant généreusement jusqu'à ce que le pelage soit mouillé.Avec des ciseaux de dissection, pratiquez une incision dans la peau et disséquez le fascia des muscles de la patte. Ensuite, détachez la patte de la souris en sectionnant le fémur au niveau de la hanche et le tibia à la cheville. Pliez la patte en forme de L et utilisez les ciseaux de dissection pour séparer chaque os de la patte en coupant au niveau de l'articulation du genou.Ensuite, détacher délicatement le muscle vers une extrémité de l'os de la patte jusqu'à ce que le cartilage soit libéré. Puis, à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille de 27 gauge et d'un demi-pouce, rincer chaque os de patte dans du PBS supplémenté avec 2 % de FBS au-dessus d'une membrane en nylon de 100 micromètres, dans un tube conique de 50 millilitres, jusqu'à ce que l'os devienne blanc, afin de maximiser le nombre de cellules récupérées. À l'aide du piston d'une seringue, broyer les cellules à travers la membrane en nylon dans le tube conique de 50 millilitres pour obtenir une suspension monocellulaire.Répétez avec l'autre patte de la souris. Centrifugez les cellules récoltées à 400 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, puis jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de chlorure d'ammonium potassium, ou ACK, pour resuspendre la moelle osseuse.Incuber la suspension cellulaire sur de la glace pendant 10 minutes pour lyser les globules rouges. Pour arrêter la lyse, remplir le tube avec du PBS. Ensuite, centrifuger à nouveau les cellules et éliminer le surnageant.Avec cinq millilitres de PBS, resuspendez les cellules et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre par exclusion au bleu de trypan. Ensuite, ajoutez le cocktail pré-souche 2x pour resuspendre les cellules à deux fois 10⁶ cellules par millilitre. Puis, plaquez deux millilitres dans les puits de plaques à six puits.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Après l'incubation, ajouter deux millilitres de surnageant viral dans chaque puits, suivis de huit microgrammes par millilitre de polybrene. Faire centrifuger les plaques à 1500 ×g à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes.Ensuite, remettre les plaques dans l'incubateur pendant la nuit. Prélever la suspension cellulaire dans des tubes coniques et centrifuger à 400 × g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Utiliser 2x le cocktail pré-souche par puits pour resuspendre les cellules, puis les re-semer dans les puits d'origine.Après avoir préparé les souris receveuses pour la transplantation conformément au protocole décrit, récolter les cellules donneuses transduites à partir des plaques à six puits en pipetant doucement le surnageant dans des tubes coniques. Utiliser un millilitre de PBS pour laver chaque puits, et recueillir les cellules résiduelles dans les tubes. Ajouter 0,5 millilitre de trypsine à 0,05 % dans les puits, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Ensuite, ajoutez un millilitre de D-10 dans les puits et détachez les cellules restantes en pipetant doucement. Puis, ajoutez les cellules dans les tubes respectifs et centrifugez-les à 400 ×g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Lavez à nouveau les cellules avec du PBS.Ensuite, après centrifugation, utilisez cinq millilitres de PBS pour resuspendre les cellules, puis comptez-les à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan et d’un hématimètre. Pour l’injection chez les souris, resuspendez cinq fois 10 à la puissance 5 jusqu’à deux fois 10 à la puissance 6 cellules dans 50 à 100 microlitres de PBS. Placez la souris sur le côté et immobilisez-la à l’aide du pouce et de l’index, de manière à ce que l’œil dépasse légèrement de la tête.Avec le biseau orienté vers le haut, insérer l'aiguille latéralement au canthus médial selon un angle de 45 degrés, puis injecter. Après l'injection, examiner la souris à la recherche de signes de lésion, tels qu'un gonflement ou un saignement, au site d'injection, et se référer au protocole écrit pour les soins post-injection supplémentaires. Enfin, analyser l'expression de la GFP dans le sang, conformément au protocole écrit.Cette figure illustre la méthode de calcul du titre viral relatif, où le pourcentage de GFP est calculé à partir des événements recueillis dans la fenêtre des cellules viables. Ici, un titre avec plus d'une particule virale par cellule est représenté, tandis que ces échantillons correspondent à des titres avec une seule particule virale par cellule. Idéalement, au moins 50 % des cellules positives pour la GFP seraient détectées avec une dilution de 1 à 30 du surnageant viral.Dans cette expérience, un receveur de greffe réussi est présenté, chez lequel des souris CALRdel52 présentent un phénotype de NPM associé à une augmentation des plaquettes, une augmentation des mégacaryocytes dans la moelle osseuse et une fibrose médullaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit jours, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de suivre chaque étape du protocole.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les effets de gènes spécifiques dans l'hématopoïèse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de produire des souris exprimant votre gène d'intérêt dans les cellules hématopoïétiques.

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Recherche sur le cancer

Cette vidéo démontre l’induction de la maladie du greffon intestinal contre l’hôte, GvHD, chez une souris receveuse irradiée létalement à l’aide de cellules souches hématopoïétiques allogéniques allogéniques et de lymphocytes T alloréactifs spléniques induisant la GvHD. Ce protocole permet d’établir un modèle de GvHD intestinale aiguë sévère afin de comprendre le mécanisme de la maladie et de développer des options thérapeutiques innovantes.

Induction de la maladie du greffon contre l’hôte dans des modèles murins par greffe allogénique de moelle osseuse et de cellules spléniques

Nous présentons un protocole rapide et flexible pour un système d’expression in vivo basé sur un seul récepteur de cellules T (TCR).  Les vecteurs rétroviraux sont utilisés pour transduire les cellules progénitrices de la moelle osseuse afin d’étudier le développement des lymphocytes T et la fonction d’un seul TCR in vivo comme alternative aux souris transgéniques TCR.

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

Ici nous utilisons bioluminescent, radiographie et tomographie par émission de positons/calculé tomographie imaging pour étudier comment inhiber l’activité mTOR impacts tumeurs myélome de la moelle osseuse-implanté dans un modèle de xénogreffe. Cela permet des analyses physiologiquement pertinents, non invasif et multimodales de l’effet anti-myélome de thérapies ciblant myélome de la moelle osseuse-greffée tumeurs in vivo.

Multimodal bioluminescentes et émission positronique tomographie/Computational imagerie par tomographie des xénogreffes de moelle osseuse de myélome Multiple chez les souris NOG

Les auteurs décrivent l’utilisation de greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour évaluer le potentiel maligne de cellules hématopoïétiques génétiquement. TCSH est utile pour évaluer les diverses cellules hématopoïétiques malignes in vivo comme générant une grande cohorte de souris atteintes de leucémie ou de syndromes myélodysplasiques (SMD) afin d’évaluer de nouveaux traitements.

Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique

La maladie de greffe-contre-hôte est une complication principale après la transplantation allogeneic de moelle. Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans la pathogénie de la maladie de greffe-contre-hôte. L’article actuel décrit une nouvelle plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans le développement de la maladie de greffe-contre-hôte et de l’effet de greffe-contre-leucémie.

Plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie de greffe-contre-hôte

Nous décrivons la transplantation intraparenchymateuse de cellules progénitrices neurales humaines transduites avec un double vecteur rapporteur exprimant la protéine fluorescente vert luciférase (GFP) dans le cerveau de la souris. Après la transplantation, le signal de la luciférase est mesuré à plusieurs reprises à l’aide de la bioluminescence in vivo et de cellules greffées exprimant la GFP identifiées dans des sections du cerveau à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Transplantation intracérébrale et suivi in vivo de la bioluminescence des cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau de la souris

Ce protocole décrit l’isolement de thymocytes doublement négatifs du thymus de souris, suivi d’une transduction rétrovirale et d’une co-culture sur le système de co-culture de lignée cellulaire stromale de moelle osseuse de type delta 4-exprimant la moelle osseuse (OP9-DL4) pour une analyse fonctionnelle plus approfondie.

Co-culture et transduction de thymocytes murins sur des cellules stromales exprimant 4-Delta-like pour étudier les oncogènes dans la leucémie à cellules T

Ici, l’injection intrapéritonéale de cellules leucémiques est utilisée pour établir et propager la leucémie myéloïde aiguë (LAM) chez la souris. Cette nouvelle méthode est efficace dans la transplantation en série de cellules AML et peut servir d’alternative pour ceux qui peuvent éprouver des difficultés et des incohérences avec l’injection intraveineuse chez la souris.

Transplantation intrapéritonéale pour générer une leucémie myéloïde aiguë chez la souris

Le présent protocole décrit le développement d’un modèle murin reproductible de gliome de la moelle épinière en injectant des cellules tumorales dans l’espace intervertébral, offrant une approche plus efficace et moins invasive pour la recherche et le développement thérapeutique.

Transplantation chirurgicale de cellules tumorales dans la moelle épinière de souris

Le protocole vise à décrire un modèle murin permettant de générer des rechutes de leucémie lymphoblastique aiguë, en se basant sur la dynamique de la réponse à la chimiothérapie d’induction.

Modèle murin de rechute de la leucémie à la chimiothérapie d’induction pour la leucémie lymphoblastique aiguë

Découvrez la méthode de transduction-transplantation pour générer des modèles murins exprimant des gènes d'intérêt dans les cellules hématopoïétiques. Cette technique permet d'étudier les malignités hématologiques et l'hématopoïèse normale.

Transduction-Transplantation Modèle de souris de syndrome myéloprolifératif

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