Induire complète Polyp Régénération du aboral Physa de la mer Anémone Starlet Nematostella vectensis

L’objectif global de cette procédure est d’illustrer la série prévisible de changements morphologiques qui se sont produits lors de la régénération d’un polype complet à partir d’une minuscule section de tissu prélevée à l’extrémité aborale de Nematostella vectensis Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie de la régénération, telles que la façon dont les cellules au site d’une plaie se réorganisent et se déploient pour refaire les structures manquantes. J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode parce que je voulais voir comment des polypes relativement complexes pouvaient se reconstituer en commençant par le moins d’informations morphologiques possible. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la progression du stade après la blessure initiale est parfois masquée par une muqueuse.

Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal à obtenir une séparation complète du tissu au site de la plaie, en raison de la nature molle, collante et gélatineuse du polype. Commencer cette procédure par le conditionnement de Nematostella vectensis comme décrit dans le protocole textuel. Il est particulièrement important lors de l’utilisation de cette technique que les animaux sélectionnés soient de la même taille et aient le même historique de culture, comme une alimentation identique et d’autres paramètres de condition.

Retirez la parabole des animaux sélectionnés de l’incubateur à la lumière de la pièce au moins une heure avant l’amputation. À l’aide d’une pipette en plastique de gros calibre, transférez les cinq animaux de la piscine à amputer dans le fond d’un plat de découpe en verre stérile de 100 millimètres de diamètre contenant de l’eau de mer artificielle à une salinité de 12 parties pour mille. Placez la parabole sur la platine d’un stéréomicroscope avec un grossissement variable entre 10 et 40x.

Choisissez des polypes de taille identique et d’environ la même longueur et placez-les dans un bol séparé de la colonie pendant trois jours avant l’amputation. À l’aide d’un scalpel stérile, amputez la physe aborale de chaque polype pour obtenir une section de la physe à peu près aussi longue que large et ne contenant pas de mésentère. Pour ce faire, placez la lame du scalpel en contact avec l’animal au site d’amputation souhaité.

Faites-le soit sans aide, soit en saisissant doucement le corps de l’animal avec une pince numéro cinq. Coupez le tissu en tirant parti de la lame incurvée du scalpel dans un mouvement de balancement sur le corps. Retirez chaque polype amputé du donneur de la boîte et remettez-le dans un bol séparé étiqueté Pooled amputees.

Après avoir daté le bol, remettez-le en culture mère. Rincez les physes excisées qui restent dans le plat de découpe dans de l’eau de mer artificielle à une salinité de 12 parties pour 1 000. Ensuite, transférez chaque physe dans un puits stérile séparé dans une plaque de culture cellulaire multi-puits contenant 10 millilitres d’eau de mer artificielle à une salinité de 12 parties pour 1 000 dans chaque puits.

Répétez ces étapes pour recueillir au moins cinq physes dans chaque puits à réserver pour chaque traitement expérimental. Placez la plaque contenant la physe dans un incubateur à température régulée à une température fixe déterminée par le taux de régénération souhaité. Mesurez la physe à l’aide d’un microscope stéréo composé à grossissement variable.

Notez la Nematostella physa fraîchement coupée au stade zéro, et continuez à noter à la même heure chaque jour après l’amputation, ou DPA, à l’aide du NRSS. Classez la physe au stade zéro si une physe fraîchement coupée apparaît sous la forme d’une masse en forme de coupe ressemblant à un ballon flacide avec un site de plaie ouvert qui est probablement visible. Marquez une physe au premier stade si la plaie d’amputation semble fermée.

Marquez une physe à la deuxième étape si la surface du pôle auditif semble gonflée, révélant huit arcs surélevés disposés selon un motif radialement symétrique et séparés par des rainures. Au deuxième stade, observez de petites bulles hémisphériques au sommet des arcades qui sont à peu près aussi hautes que larges, probablement transitoires et initialement composées d’une seule couche de cellules ectodermiques. Au fur et à mesure que la physe vieillit, elle peut s’enfermer dans du mucus, qui doit être soigneusement retiré avec des pinces.

Marquez une physe au troisième stade si les bourgeons des tentacules contenant des couches de tissu endodermique et ectodermique sont formés de manière stable à l’extrémité auriculaire d’au moins quelques arcs radiaux. Classez un physe au quatrième stade si le physe contient huit mésentères visibles distincts qui s’étendent dans un coelenteron à partir d’insertions dans la paroi corporelle avec des longueurs aborales auditives qui sont plus de deux fois leur largeur radiale mesurée à partir de l’endroit où ils semblent se connecter au pharynx à son extrémité aborale, ou entérostome. Enfin, classez une physe au stade cinq si la physe a plus de quatre mésentères avec plissage, et que le plissage est plus plein et sinueux qu’au stade quatre.

Au cinquième stade, l’animal a une apparence adulte presque normale, mais il n’y a pas de cellules gonadiques visibles. Ce groupe de Nematostella physa témoins traitées avec 0,1 pour cent de DMSO s’est complètement régénéré au stade cinq. Les physes traitées à la chloroquine n’ont cependant pas réussi à former complètement des mésentères complets.

Un gros plan montre à la fois la présence et l’absence de plissage dans les mésentères d’une physe qui a été incubée dans la chloroquine. Ce graphique illustre les résultats globaux du traitement à la chloroquine. Tout traitement entre 10 et 50 micromolaires provoquait des défauts similaires, principalement l’absence de reformation complète des mésentères en ce sens que les mésentères n’avaient pas de plissage.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure pour chaque plaque de six puits contenant 30 physes coupées. Le pointage est rapide, il faut peut-être une demi-heure pour chaque plaque répétée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’amputer le physe pour visualiser les changements morphologiques qui se produisent lors de la régénération d’un polype complet à partir d’une minuscule section de tissu aboral.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des étapes morphologiques dans lesquelles identifier les événements moléculaires sous-jacents à la régénération d’un polype complet à partir d’une tasse de tissu visuellement uniforme. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de préconditionner les animaux en fonction de leurs antécédents nutritionnels, de les couper en deux pour exclure le mésentère adulte et de normaliser la taille des physes en régénération pour réduire les variations au sein des traitements. À la suite de cette procédure, les effets de mutations génétiques ou de perturbations de la voie de signalisation avec de petites molécules, par exemple, ont pu être évalués.

Ou les changements morphogénétiques pourraient être corrélés à l’analyse microscopique de l’auto-prolifération, au traçage de la lignée ou à l’expression des gènes du site deux. Cette technique permettra aux chercheurs dans le domaine de la biologie de la régénération d’explorer la biologie cellulaire, les voies de signalisation et les processus morphogénétiques qui sous-tendent la remarquable capacité de régénération de cet organisme modèle.