Name: Mesure de la rigidité de Ex Vivo Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Apprenez à mesurer le module élastique d'aortes de souris ex vivo par microscopie à force atomique. Cette méthode précise permet d'étudier la biomécanique vasculaire et les maladies cardiovasculaires.

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AFM l’analyse a été réalisée sur des instruments soutenus par le Pennsylvania Muscle Institute et l’Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, l’Université de Pennsylvanie. Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH HL62250 et AG047373. YHB a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’American Heart Association.

<ol><li>Kothapalli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Protection+by+ApoE+and+ApoE-HDL+Linked+to+Suppression+of+ECM+Gene+Expression+and+Arterial+Stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening.</a> Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).</li>
<li>Liu, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-12+is+an+essential+mediator+of+acute+and+chronic+arterial+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening.</a> Sci Rep. 5, 17189(2015).</li>
<li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+arterial+aging+and+the+epidemic+of+systolic+hypertension+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis.</a> J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).</li>
<li>Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+in+diabetes+and+the+metabolic+syndrome%3A+a+pathway+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease.</a> Diabetologia. 51, 527-539 (2008).</li>
<li>Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Stiffness+and+Increased+Pulse+Pressure+in+the+Aging+Cardiovascular+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System.</a> Cardiol Res Pract. 2011, 263585(2011).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+Stiffness+and+Cardiovascular+Events%3A+The+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study.</a> Circulation. 121, 505-511 (2010).</li>
<li>Sutton-Tyrrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Aortic+Pulse+Wave+Velocity%2C+a+Marker+of+Arterial+Stiffness%2C+Predicts+Cardiovascular+Events+in+Well-Functioning+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults.</a> Circulation. 111, 3384-3390 (2005).</li>
<li>Klein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Cycle+Control+by+Physiological+Matrix+Elasticity+and+In+Vivo+Tissue+Stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening.</a> Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li>
<li>Bae, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FAK-Cas-Rac-lamellipodin+signaling+module+transduces+extracellular+matrix+stiffness+into+mechanosensitive+cell+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling.</a> Sci signal. 7, ra57(2014).</li>
<li>Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+differentiated+properties+and+proliferation+of+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).</li>
<li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Regulation+of+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+in+Development+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease.</a> Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Intimal+Stiffening+Enhances+Endothelial+Permeability+and+Leukocyte+Transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration.</a> Sci Transl Med. 3, 112ra122(2011).</li>
<li>Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Perspectives+on+Arterial+Stiffness+and+Pulse+Pressure+in+Hypertension+and+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases.</a> Circulation. 107, 2864-2869 (2003).</li>
<li>Raffetto, J. D., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+vascular+remodeling+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease.</a> Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).</li>
<li>Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E3+Inhibits+Rho+to+Regulate+the+Mechanosensitive+Expression+of+Cox2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2.</a> PLoS ONE. 10, e0128974(2015).</li>
<li>Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Energy+and+the+Contact+of+Elastic+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+A%22%5BJournal%5D)">Surface Energy and the Contact of Elastic Solids.</a> Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).</li>
<li>Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+contact+deformations+on+the+adhesion+of+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of contact deformations on the adhesion of particles.</a> J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).</li>
<li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+atomic-force+microscope+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch+EJP%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).</li>
<li>Pogoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-sensing+analysis+of+cytoskeleton+organization+based+on+AFM+data%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data.</a> Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).</li>
<li>Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+Enhances+Cell+Elastic+Behavior+and+Protects+against+Compressive+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress.</a> Biophys J. 107, 314-323 (2014).</li>
<li>Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relaxation+and+creep+on+living+cells+with+the+atomic+force+microscope%3A+a+means+to+calculate+elastic+moduli+and+viscosities+of+cell+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components.</a> Nanotechnology. 21, 445101(2010).</li>
<li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts%2C+chondrocytes%2C+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> J Biomech. 41, 454-464 (2008).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Elastic+Moduli+of+Thin+Layers+of+Soft+Material+Using+the+Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope.</a> Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).</li>
<li>Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe-Based+Frequency-Dependent+Microrheology+of+Polymer+Gels+and+Biological+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells.</a> Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).</li>
<li>Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Testing+of+Mouse+Carotid+Arteries%3A+from+Newborn+to+Adult%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult.</a> J Vis Exp. , e3733(2012).</li>
<li>Laurent, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document+on+arterial+stiffness%3A+methodological+issues+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications.</a> Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nat Nano. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Raman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nanomechanical+properties+of+live+cells+using+multi-harmonic+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy.</a> Nat Nano. 6, 809-814 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

AFM indentation peut être utilisée pour caractériser la rigidité (module d&#39;élasticité), des cellules et des tissus. Dans cet article, nous fournissons des protocoles étape par étape détaillées pour isoler l&#39;aorte descendante et l&#39; arc aortique chez la souris et déterminer les modules élastiques de ces régions artérielles ex vivo. Nous résumons maintenant et discuter les problèmes techniques et les limites de la méthode décrite dans le présent document. Plusieurs problème...

Les propriétés biomécaniques des artères sont un déterminant critique des maladies cardiovasculaires (MCV) et du vieillissement. La rigidité artérielle, un facteur de risque majeur indépendant du cholestérol et un indicateur de la progression des MCV, augmente avec les lésions vasculaires, l’athérosclérose, l’âge et le diabètede 1 à 8 ans. Le raidissement de la paroi artérielle est associé à une dédifférenciation, une migration et une prolifération accrues des cellules musculaires lisses vasculaires9-12. De plus, l’augmentation de la rigidité artérielle a été associée à une meilleure adhérence des macrophages1, à une perméabilité endothéliale et à une transmigration leucocytaire13, ainsi qu’à un remodelage de la paroi des vaisseaux14,15. Ainsi, les thérapies qui pourraient prévenir le raidissement artériel dans les MCV ou le vieillissement pourraient compléter les interventions pharmacologiques actuellement disponibles pour traiter les MCV en réduisant l’hypercholestérolémie. 
AFM est un outil analytique puissant utilisé pour diverses applications physiques et biologiques. L’AFM est de plus en plus utilisé pour obtenir des images à haute résolution et caractériser les propriétés biomécaniques d’échantillons biologiques mous tels que les tissus et les cellules1,2,10,16,17 avec un grand degré de précision à l’échelle nanométrique. L’un des principaux avantages de l’AFM est le fait qu’il peut être utilisé avec des cellules vivantes.
Cet article décrit notre méthode de mesure du module d’élasticité des artères de souris ex vivo à l’aide de l’AFM. La méthode décrite montre comment nous 1) isolons correctement les artères de souris (aorte descendante et arc aortique) et 2) mesurons le module d’élasticité de ces tissus par AFM. Les mesures des modules élastiques déchargés dans les artères peuvent aider à élucider les changements dans la matrice extracellulaire (MEC) qui se produisent en réponse à une lésion vasculaire, à une MCV et au vieillissement.

<table><tbody><tr><td>BioScope Catalyst Système AFM</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE 200 microscope inversé</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonde AFM au nitrure de silicium</td><td>Novascan Technologies</td><td>PT. SI02. SN.1</td><td>0,06 N/m en porte-à-faux ; 1 & micro ; m Pince SiO2 particule</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-10</td><td>Voir section 1.4</td></tr><tr><td>Pince #5SF Dumont</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-00</td><td>Voir section 1.8</td></tr><tr><td>Ciseaux fins-ToughCut</td><td>Outils de science fine</td><td>14058-11</td><td>Voir section 1.4 (taille moyenne)</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml ; ciseaux à ressort Bingen</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>15008-08</td><td>Voir section 1.6 (petite taille)</td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire traité TC de 60 mm</td><td>Corning</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Sans calcium ni magnésium</td></tr><tr><td>Krazy Glue liquide tout usage instantané</td><td>Krazy Glue</td><td>KG58548R</td><td>Voir section 2.2</td></tr><tr><td>Embouts de chargement de gel, 1 - 200 & micro ; l</td><td>Fisher</td><td>02-707-139</td><td>Voir la section 2.2</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>78092-CP</td><td>Voir la section 3.2</td></tr><tr><td>Plats à paroi transparente de 50 mm à fond en verre</td><td>TED PELLA</td><td>14027-20</td><td>Voir la section 4.4</td></tr></tbody></table>

mesure de la rigidité de<em&gt; ex vivo</em&gt; souris aortes utiliser atomic force microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

raidissement artérielle est un facteur de risque significatif et biomarqueur pour une maladie cardiovasculaire et une caractéristique de vieillissement. La microscopie à force atomique (AFM) est un outil d&#39; analyse polyvalent pour la caractérisation des propriétés mécaniques viscoélastiques pour une variété de matériaux allant du disque (plastique, verre, métal, etc.) des surfaces à des cellules sur tout substrat. Il a été largement utilisé pour mesurer la rigidité des cellules, mais moins fréquemment utilisé pour mesurer la rigidité des aortes. Dans cet article, nous allons décrire les procédures d&#39;utilisation de l&#39; AFM en mode contact pour mesurer l&#39;ex vivo module d&#39; élasticité des artères de souris non chargées. Nous décrivons notre procédure d&#39;isolement des aortes de souris, puis des informations détaillées pour l&#39;analyse de l&#39;AFM. Cela inclut des instructions étape par étape pour l&#39;alignement du faisceau laser, l&#39;étalonnage de la constante du ressort et de la sensibilité de déviation de la sonde AFM, et l&#39;acquisition de courbes de force. Nous fournissons également un protocole détaillé pour analy de donnéessis des courbes de force.

<html> La figure 5A montre une image de contraste de phase de la descente (thoracique) aorte d&#39;un enfant de 6 mois, mâle C57BL / 6 de souris. Le cantilever AFM est en place directement au- dessus du tissu et prêt pour l&#39; indentation. Figures 5B et 5C montrent des courbes de force représentatives obtenues par AFM indentation en mode contact. Lignes vertes représentées sur les figures 5B et 5C représentent les meilleures courbes d&...

Nous présentons des protocoles détaillés pour l’isolement des aortes de la souris et la mesure de leur module d’élasticité à l’aide de la microscopie à force atomique.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire les procédures permettant d'utiliser la microscopie à force atomique pour mesurer le module d'élasticité ex vivo de l'aorte de souris. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biomécanique vasculaire et des maladies, telles que les maladies cardiovasculaires et le vieillissement. Le principal avantage de cette technique réside dans la capacité de la MFA à caractériser les propriétés biomécaniques d'échantillons biologiques mous, tels que les artères et les cellules, avec un haut degré de précision à l'échelle nanométrique.Je présenterai les procédures de microscopie à force atomique (AFM), et le docteur Shu-lin Liu, chercheur associé de notre laboratoire, montrera comment isoler les aortes de souris. Pour commencer, euthanasiez une souris et disséquez-la jusqu'à l'aorte, comme décrit dans le protocole accompagnant. À l'aide d'une petite pince, saisissez la graisse entourant l'aorte et utilisez une petite paire de ciseaux pour couper soigneusement la graisse située autour de l'aorte.Ensuite, saisissez délicatement l'aorte avec une pince et effectuez une incision au niveau du début de l'aorte ascendante, puis une autre à la fin de l'aorte descendante, juste au-dessus de l'aorte abdominale. Transférez l'aorte disséquée dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant du PBS sans calcium ni magnésium. Dans la boîte, poursuivez la dissociation des tissus adipeux résiduels présents sur l'aorte, puis ouvrez l'aorte de façon longitudinale.Ensuite, découpez un fragment de 2 millimètres sur 4 millimètres à partir de l'aorte descendante et un fragment de même taille à partir de l'arc aortique, destinés à une analyse à l'aide du microscope à force atomique. Placez ces fragments de tissu dans une nouvelle boîte en plastique de 60 millimètres et maintenez-les humides dans une goutte de PBS. Retirez soigneusement le PBS autour du tissu à l’aide d’un essuie-tout de laboratoire sans toucher l’aorte.Veillez à ce que la face luminale du tissu soit orientée vers le haut, et utilisez cinq à 10 microlitres d'adhésif cyanoacrylate pour coller délicatement chaque extrémité de l'aorte ouverte sur la plaque. Il est essentiel que l'aorte ne soit pas étirée pendant cette étape. Une fois terminé, vérifiez que l'aorte collée n'est ni pliée ni flottante.Après avoir laissé sécher à l'air la colle sur l'aorte pendant 30 à 60 secondes, ajoutez délicatement du PBS et immergez l'échantillon. À l'aide de pinces, faites glisser une sonde AFM en nitrure de silicium à extrémité sphérique dans le porte-sonde. Ensuite, fixez fermement le porte-sonde sur le support ZScanner de la tête AFM.Ensuite, ouvrez le logiciel de microscopie à force atomique (AFM). Choisissez le type d'expérience en accédant à la catégorie d'expérience et en sélectionnant le mode contact. Puis, accédez au groupe d'expérience et sélectionnez le mode contact dans un fluide, et enfin, allez à l'expérience et sélectionnez le mode contact dans un fluide.Une fois ces éléments sélectionnés, cliquez sur Charger l'expérience. Cela activera le laser. Préparez ensuite un échantillon utilisé pour aligner le laser, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant.Placez l'échantillon sur le microscope à force atomique (AFM). Positionnez le spot laser sur l'extrémité de la sonde AFM en ajustant les molettes de positionnement du laser. Ensuite, utilisez les molettes de positionnement du détecteur pour régler la position de la photodiode jusqu'à ce que les valeurs de déflexion verticale soient comprises entre zéro et moins un volt, et que la déflexion horizontale soit proche de zéro volt.Ensuite, vérifiez que le signal somme du laser est maximisé. Si nécessaire, réajustez la position du faisceau laser sur la pointe de la MFA et la position de la photodiode afin d'obtenir le signal somme maximal. Pour commencer l'étalonnage, sélectionnez vérifier les paramètres et réglez le paramètre de taille de balayage à zéro.Régler la vitesse de balayage à un hertz. Régler l'échantillon/ligne à 256 et le point de consigne de déflexion à 20 nanomètres. Ensuite, sélectionner Engage.Une fois que la sonde entre en contact avec la surface de la plaque, cliquez sur Rampe. Ensuite, sélectionnez le mode élargi dans le menu de la barre d'outils de balayage et réglez les paramètres comme indiqué ici. Dans la barre d'outils de rampe, sélectionnez rampe continue et enregistrez une courbe de force sur la plaque.Dans cette courbe de force, régler le canal 1 sur Erreur de déflexion afin de permettre au logiciel de représenter graphiquement les résultats sous la forme d'une déflexion verticale en fonction de la position Z. Cliquer aux extrémités gauche ou droite de la courbe de force et déplacer le curseur pour englober une région linéaire de la courbe de force qui sera ajustée par une droite. Ensuite, sélectionner Rampe dans la barre d'outils et cliquer sur Mettre à jour la sensibilité.Enregistrez la valeur du courant. Ensuite, sélectionnez Étalonnage, puis cliquez sur Détecteur. Saisissez et faites la moyenne des valeurs provenant des cinq mesures dans la case Sensibilité de déflexion.Cliquez sur Retrait deux à trois fois pour relever la tête du microscope à force atomique (AFM) et éviter toute interaction entre la pointe de l'AFM et la plaque pendant le processus d'ajustage thermique. Ensuite, cliquez sur Ajustage thermique dans la barre d'outils. Réglez la plage d'ajustage thermique entre un et 100 kilohertz, puis réglez la correction de sensibilité de déflexion à 1,144 pour les leviers en forme de V et à 1,166 pour les leviers rectangulaires.Dans le menu Réglage thermique, cliquez sur Acquérir les données pour obtenir une courbe de réglage thermique. Ensuite, placez des lignes en pointillés rouges de chaque côté de la courbe, puis sélectionnez le modèle lorentzien ou celui de l'oscillateur harmonique simple, selon celui qui correspond le mieux aux données. Cliquez ensuite sur Ajuster les données et sélectionnez Calculer K du ressort pour enregistrer cette valeur.Placez une boîte de culture de 60 millimètres contenant le tissu aortique sur la platine du microscope et fixez la boîte à l’aide du support magnétique. Une fois l’aorte engagée avec le levier, assurez-vous que le centre du piezo est stable, puis cliquez sur Rampe. Réglez la taille de la rampe à trois micromètres, le mode de déclenchement sur Relatif et le seuil de déclenchement à 100 nanomètres.Ensuite, sélectionnez la rampe continue. Observez que le point de contact entre la sonde et l'échantillon se produit approximativement au centre des trois quarts inférieurs du cycle de rampe en Z. Si ce phénomène n'est pas observé, désengagez la sonde de l'échantillon, ajustez la taille de la rampe selon les besoins, puis réengagez l'échantillon.Ensuite, cliquez sur Microscope dans la barre de menu et sélectionnez Engage Settings. Modifiez le retrait SPM à 30 micromètres, puis cliquez sur OK. Après avoir observé la courbe de force, cliquez sur Capture dans la barre de menu et sélectionnez Capture Filename. Saisissez un nom de fichier souhaité se terminant par OOO, sélectionnez un dossier désigné, puis enregistrez les données.Pour commencer l'analyse, ouvrez le logiciel d'analyse des courbes de force, chargez le fichier à analyser, puis modifiez et lissez les données comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, sélectionnez Correction de la ligne de base dans la barre de menu, puis réglez les paramètres d'entrée comme indiqué ici. Ajustez ensuite la ligne pointillée bleue verticale sur le graphique afin d'englober la partie plate de la courbe de force, puis cliquez sur Exécuter.Ensuite, cliquez sur « Indentation » dans le menu de la barre d'outils et réglez les entrées comme indiqué ici. Enregistrez ces valeurs et analysez le module de Young de chacune des zones d'intérêt en mesurant cinq courbes de force par zone, prises à faible distance les unes des autres. Pour déterminer la rigidité globale de l'échantillon de tissu, jusqu'à 25 mesures doivent être effectuées sur cinq régions différentes de la zone d'échantillonnage dans le tissu.Ces zones peuvent être utilisées pour comparer les tissus à différents emplacements, tels que l'arc aortique et l'aorte descendante. Sur ces graphiques, des courbes de force représentatives de l'aorte descendante et de l'arc aortique sont présentées à partir d'un même échantillon d'aorte de souris. À partir de ces données, le module d'élasticité peut être calculé pour chaque groupe et utilisé pour effectuer des comparaisons entre différentes régions ou conditions.Après avoir visionné cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la manière d'isoler correctement l'aorte de souris et de mesurer le module d'élasticité par microscopie à force atomique. Après avoir tenté cette procédure, il est important de se souvenir d'effectuer la mesure de MFA immédiatement après l'isolement du tissu. Une fois maîtrisée, l'isolement des aortes peut être réalisé en environ 45 minutes par souris, et la mesure par MFA ainsi que l'analyse peuvent être terminées en une heure et demie, si elles sont effectuées correctement.Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'immunofluorescence ou les tests de prolifération peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives au remodelage vasculaire ou à la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires.

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JoVE Journal

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La rigidité de la matrice extracellulaire influence fortement les comportements multiples de cellules adhérentes. Matrice de rigidité varie spatialement à travers un tissu, et subit des modifications dans les diverses maladies. Ici, nous développons des méthodes pour caractériser les variations spatiales de la rigidité dans le tissu pulmonaire normal de la souris et fibrotiques utilisant la microscopie à force atomique microindentation.

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Nous décrivons ici l'isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus ou de lentivirus de manipuler l'expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d'un microscope à force atomique (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Nous décrivons une technique de mesure de la rigidité aortique à partir de sa relation pression-diamètre in vivo chez la souris. Le diamètre de l’aorte est enregistré par ultrasons et la pression aortique est mesurée de manière invasive à l’aide d’un cathéter de pression à l’état solide. La pression artérielle est modifiée progressivement et le diamètre résultant est mesuré.

Mesure aortique ascendant Rigidité In Vivo Chez la souris en utilisant des ultrasons

Le présent protocole décrit les concepts et l’application technique de la technique du myographe tensométrique utilisant un système myographique à chambres multiples dans l’évaluation expérimentale ex vivo de la fonction endothéliale aortique de la souris.

Mesure de la vasorelaxation dépendante de l’endothélium dans l’aorte thoracique de souris à l’aide de la myographie tensométrique à petit volume

Nous présentons un protocole pour mesurer les modules élastiques des zones riches en collagène dans le foie normal et malade en utilisant la microscopie à force atomique. L’utilisation simultanée de la microscopie à polarisation fournit une grande précision spatiale pour localiser les zones riches en collagène dans les sections du foie.

Mesure de la rigidité hépatique par microscopie à force atomique couplée à la microscopie à polarisation

Nous avons récemment identifié le raidissement capillaire rétinien comme un nouveau paradigme pour le dysfonctionnement rétinien associé au diabète. Ce protocole détaille les étapes d’isolement des capillaires rétiniens de souris et de la matrice sous-endothéliale à partir de cultures endothéliales rétiniennes, suivi d’une description de la technique de mesure de la rigidité par microscopie à force atomique.

Isolement de capillaires rétiniens de souris et de matrice sous-endothéliale pour la mesure de la rigidité à l’aide de la microscopie à force atomique

Dans ce protocole, nous montrons comment préparer le tissu axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM) et effectuer des mesures d’indentation dans le cartilage des membres intact et en régénération.

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Ce protocole visualise comment préparer des cryosections de tissu pulmonaire murin, effectuer des expériences de carte de force de microscopie à force atomique et analyser les données pour déterminer le module de Young de la membrane basale pulmonaire murine native.

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