Mesure de la rigidité de Ex Vivo Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

L’objectif général de ce protocole est de décrire les procédures d’utilisation de la microscopie à force atomique pour mesurer le module d’élasticité ex vivo des aortes de souris. Cette méthode aide à répondre à des questions clés dans le domaine de la biomécanique vasculaire et des maladies, telles que les maladies cardiovasculaires et le vieillissement. Le principal avantage de cette technique est les propriétés biomécaniques caractérisées par l’AFM d’échantillons biologiques mous tels que les artères et les cellules avec un grand degré de précision aux niveaux Danoscale.

Je présenterai les procédures de l’AFM, et le docteur Shu-lin Liu, chercheur associé de notre laboratoire, montrera comment isoler les aortes de souris. Pour commencer, euthanasiez une souris et disséquez-la jusqu’à l’aorte comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. À l’aide d’une paire de petites pinces, saisissez la graisse entourant l’aorte et utilisez une petite paire de ciseaux pour couper soigneusement la graisse qui se trouve autour de l’aorte.

Ensuite, saisissez doucement l’aorte avec une pince et faites une incision à travers le vaisseau au début de l’aorte ascendante et une autre coupe à l’extrémité de l’aorte descendante, juste au-dessus de l’aorte abdominale. Transférez l’aorte disséquée dans une boîte de 60 millimètres contenant du PBS sans calcium ni magnésium. Dans la boîte, continuez à disséquer tout tissu adipeux restant de l’aorte, puis ouvrez l’aorte longitudinalement.

Ensuite, coupez un morceau de 2 millimètres sur 4 millimètres de l’aorte descendante, et un morceau de la même taille de l’arc aortique, pour analyse à l’aide du microscope à force atomique. Placez ces morceaux de tissu dans un plat en plastique frais de 60 millimètres et gardez-les humides dans une goutte de PBS. Retirez soigneusement le PBS autour du tissu à l’aide d’une lingette de laboratoire sans toucher l’aorte.

Assurez-vous que le côté luminal du tissu est tourné vers le haut et utilisez cinq à 10 microlitres d’adhésif cyanoacrylate pour coller doucement chaque extrémité de l’aorte ouverte sur la plaque. Il est essentiel que l’aorte ne soit pas étirée au cours de ce processus. Une fois terminé, vérifiez que l’aorte collée n’est pas pliée ou flottante.

Après avoir séché à l’air libre la colle sur l’aorte pendant 30 à 60 secondes, ajoutez doucement du PBS et immergez l’échantillon. À l’aide d’une pince à épiler, glissez une sonde AFM en nitrate de silicone avec une pointe sphérique sur le support de sonde. Ensuite, fixez fermement le support de sonde au support ZScanner de la tête AFM.

Ensuite, ouvrez le logiciel AFM. Choisissez le type de test en accédant à la catégorie Expérience et en sélectionnant Mode de contact. Ensuite, allez dans Groupe d’expériences et sélectionnez Mode de contact dans Fluid, et enfin allez dans Expérience et sélectionnez Mode de contact dans Fluid.

Une fois ceux-ci sélectionnés, cliquez sur Charger l’expérience. Cela allumera le laser. Préparez ensuite un échantillon utilisé pour aligner le laser comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

Placez l’échantillon sur l’AFM. Positionnez le spot laser sur l’extrémité de la sonde AFM, en ajustant les boutons de positionnement laser. Ensuite, utilisez les boutons de positionnement du détecteur pour ajuster la position de la photodiode jusqu’à ce que les valeurs de la déviation verticale soient comprises entre zéro et moins un volt, et que la déviation horizontale soit proche de zéro volts.

Ensuite, vérifiez que la somme du signal laser est maximisée. Si nécessaire, réajustez la position du faisceau laser sur la pointe AFM, et la position de la photodiode, pour obtenir le signal de somme maximum. Pour commencer l’étalonnage, sélectionnez Paramètres de vérification et réglez le paramètre Taille de balayage sur zéro.

Réglez le taux de balayage sur un hertz. Réglez l’échantillon/la ligne sur 256 et le point de consigne de déviation sur 20 nanomètres. Sélectionnez ensuite Engager.

Une fois que la sonde entre en contact avec la surface de la plaque, cliquez sur Rampe. Ensuite, sélectionnez le mode développé dans le menu de la barre d’outils de balayage et définissez les paramètres comme indiqué ici. Dans la barre d’outils de la rampe, sélectionnez Rampe continue et obtenez une courbe de force sur la plaque.

Dans cette courbe de force, réglez le canal 1 sur Erreur de déflexion afin de permettre au logiciel de représenter graphiquement les résultats sous forme de déviation verticale en fonction de la position Z. Cliquez sur les extrémités gauche ou droite de la courbe de force et faites glisser le curseur pour englober une région linéaire de la courbe de force qui sera ajustée à la ligne droite. Ensuite, sélectionnez Rampe dans la barre d’outils et cliquez sur Mettre à jour la sensibilité.

Enregistrez la valeur actuelle. Ensuite, sélectionnez Calibrer, puis cliquez sur Détecteur. Valeur d’entrée et moyenne des cinq mesures dans la zone Sensibilité à la déflexion.

Cliquez sur Retirer deux à trois fois pour soulever la tête AFM et éviter l’interaction entre la pointe AFM et la plaque pendant le processus de réglage thermique. Ensuite, cliquez sur Réglage thermique dans la barre d’outils. Réglez la plage de réglage thermique entre un et 100 kilohertz et réglez la correction de sensibilité à la déflexion sur 1,144 pour les porte-à-faux en forme de V et 1,166 pour les porte-à-faux rectangulaires.

Dans le menu Réglage thermique, cliquez sur Acquérir des données pour obtenir une courbe de réglage thermique. Ensuite, placez un tiret rouge sur les lignes de chaque côté de la courbe et sélectionnez le modèle d’oscillateur lorentzien ou harmonique simple selon celui qui correspond le mieux aux données. Ensuite, cliquez sur Données d’ajustement et sélectionnez Calculer le ressort K pour enregistrer cette valeur.

Placez une boîte de culture de 60 millimètres contenant le tissu aortique sur la platine du microscope et fixez la plaque avec le support de plaque magnétique. Une fois que l’aorte est engagée avec le cantilever, assurez-vous que le centre piézoélectrique est stable et cliquez sur Rampe. Réglez la taille de la rampe sur trois micromètres, le mode de déclenchement sur Relatif et le seuil de déclenchement sur 100 nanomètres.

Sélectionnez ensuite rampe continue. Observez que le point de contact entre la sonde et l’échantillon se trouve approximativement au centre des trois quarts inférieurs du cycle de rampe Z. Si ce n’est pas le cas, débrayez-vous de l’échantillon, ajustez la taille de la rampe au besoin et réengagez l’échantillon.

Ensuite, cliquez sur Microscope dans la barre de menus, puis sélectionnez Paramètres d’engagement. Réglez le retrait SPM à 30 micromètres, puis cliquez sur OK. Après avoir observé la courbe de force, cliquez sur Capturer dans la barre de menus et sélectionnez Capturer le nom du fichier. Entrez le nom de fichier souhaité se terminant par OOO, sélectionnez un dossier désigné et enregistrez les données.

Pour commencer l’analyse, ouvrez le logiciel d’analyse de la courbe de force, chargez le fichier à analyser, puis modifiez et lissez les données comme décrit dans le protocole texte ci-joint. Ensuite, sélectionnez Correction de la ligne de base dans la barre de menus et définissez les entrées comme indiqué ici. Ensuite, ajustez la ligne bleue pointillée verticale sur le graphique pour englober la partie plate de la courbe de force et cliquez sur Exécuter.

Ensuite, cliquez sur Indentation dans le menu de la barre d’outils et définissez les entrées comme indiqué ici. Enregistrez ces valeurs et analysez le module de Young de chacune des zones d’intérêt en mesurant cinq courbes de force par aire qui sont prises à une petite distance les unes des autres. Pour déterminer la rigidité globale de l’échantillon de tissu, jusqu’à 25 mesures doivent être prises sur cinq régions différentes de la zone de l’échantillon dans le tissu.

Ces zones peuvent être utilisées pour comparer des tissus à différents endroits, tels que l’arc aortique et l’aorte descendante. Dans ces graphiques, des courbes de force représentatives de l’aorte descendante et de l’arc aortique sont montrées à partir du même échantillon d’aorte de souris. Sur la base de ces données, le module d’élasticité peut être calculé pour chaque groupe et être utilisé pour comparer différentes régions ou conditions.

Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’isoler correctement l’aorte de la souris et de mesurer le module d’élasticité par microscopie à force atomique. Après avoir tenté cette procédure, il est important de ne pas oublier d’effectuer la mesure de l’AFM immédiatement après l’isolement des tissus. Une fois maîtrisée, l’isolation des aortes peut être réalisée en environ 45 minutes par souris, et la mesure et l’analyse de l’AFM peuvent être effectuées en une heure et demie, si elles sont effectuées correctement.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunofluorescence ou les tests de prolifération peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives au remodelage vasculaire ou à la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires.