Name: Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Découvrez un test de fluorescence pour mesurer l'activité scramblase des phospholipides dans des liposomes reconstitués avec l'opsine. Cette méthode robuste permet d'étudier le transport lipidique intercellulaire et d'identifier les protéines impliquées.

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Cette étude a été soutenue par la Velux Stiftung (A.K.M.), la EY024207 de subventions NIH (A.K.M.) et le projet J3686 (B.P.) du Fonds autrichien pour la science (FWF).

1. Préparation de liposomes et protéoliposomes <ol><li> liposome Formation <ol><li> En utilisant une seringue en verre, ajouter 1,435 ul POPC (25 mg / ml dans du chloroforme) et 160 ul POPG (25 mg / ml dans du chloroforme) dans un ballon à fond rond pour obtenir 52,5 pmol de lipides dans un rapport molaire de POPC: POPG = 9: 1. </li><li> Sécher les lipides pendant 30 minutes en utilisant un évaporateur rotatif à une vitesse de rotation de 145 tours par minute (pas de bain d&#39;eau est nécessaire pour ce volume de solvant), puis transférer le ballon dans un dessicateur sous vide pendant au moins 3 heures, ou pendant une nuit, à la température ambiante (RT). </li><li> Hydrater le film lipidique séché avec 10 ml d&#39;HEPES 50 mM pH 7,4, 100 mM de NaCl (ci-après dénommé tampon A), en remuant doucement le ballon jusqu&#39;à ce qu&#39;une homogénéité, les résultats de suspension turbide; NOTE: La concentration des lipides à ce stade devrait être 5,25 mM comme aucune perte auraient eu lieu jusqu&#39;à présent. </li><li> Sonication de la suspension dans un bain d&#39;eau pendant 10 min à température ambiante avec une fréquence of 40 kHz. La solution se penchera un peu plus claire. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une extrudeuse, faire passer la suspension 10 fois à travers une membrane ayant une taille de pores de 400 nm, suivi d&#39;un deuxième cycle d&#39;extrusion avec 4 passages à travers une membrane ayant une taille de pores de 200 nm. REMARQUE: Le diamètre moyen des LUV résultant est d&#39;environ 175 nm. Si nécessaire, la taille et l&#39;homogénéité des GVU peuvent être contrôlées par diffusion dynamique de lumière en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Quantifier la concentration en phospholipides de la suspension de LUV comme décrit dans la section 1.2). NOTE: En raison des pertes au cours de l&#39;extrusion, la concentration est généralement autour de 3,6 mM. </li><li> Stocker les LUV à 4 ° C pendant environ 2 semaines si non utilisé immédiatement. </li></ol></li><li> Quantification phospholipides Remarque: pour déterminer la concentration en phospholipides de la suspension LUV utilisée pour la reconstitution, ainsi que celle des protéoliposomes qui sont éventuellement produites, une aliquote de l&#39;échantillon est SUBJECTED à l&#39;oxydation par l&#39;acide perchlorique. Cette procédure se décompose phospholipides pour libérer le phosphate inorganique qui est ensuite quantifié par un essai colorimétrique en comparaison avec les normes 23. <ol><li> Préparer une solution à 40 mM stock de phosphate de sodium (Na 2 HPO 4) dans de l&#39; eau distillée désionisée. </li><li> Diluer la solution mère avec de l&#39;eau distillée désionisée pour obtenir 4 mM et 0,4 mM des solutions qui serviront de normes d&#39;étalonnage de travail. </li><li> En utilisant les solutions de travail, préparer des étalons dans des tubes de 13 x 100 mm 2 en verre allant de 0 à 80 nmol de phosphate de sodium dans un volume final de 50 ul. </li><li> Prendre 10 pl chacun des échantillons LUV et protéoliposomes à quantifier et diluer avec 40 pl de ddH 2 O dans 13 tubes x 100 mm 2 de verre. NOTE: Comme la concentration en lipides des LUV et protéoliposomes est dans la gamme 2,5-5 uM, les 10 ul de l&#39;échantillon doit contenir 25-50 nmol lipide phosphore.</li><li> Ajouter de l&#39;acide 300 ul perchlorique à chacune des normes et des échantillons et de la chaleur pendant 1 heure à 145 ° C dans un bloc de chauffage. Mettez billes sur les tubes pour éviter l&#39;évaporation. </li><li> Laissez les tubes refroidir à la température ambiante et ajouter 1 ml de ddH 2 O. </li><li> Ajouter 400 pi chacun fraîchement préparé 12 g / L molybdate d&#39;ammonium et 50 g / L ascorbate de sodium et vortex pour mélanger. </li><li> Chauffer pendant 10 min à 100 ° C avec des billes sur le dessus des tubes. Retirer les tubes du bloc de chauffage et laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance des échantillons par rapport à l&#39;ébauche (échantillon standard contenant du phosphate de sodium 0 nmol) avec un spectromètre à une longueur d&#39;onde de 797 nm. </li><li> Déterminer la teneur en phosphate d&#39;échantillons sur la courbe étalon. </li></ol></li><li> Reconstitution de Opsin NOTE: Il est nécessaire de déterminer les conditions optimales de gonflement pour la reconstitution que ceux-ci dépendent de la nature du détergent, ainsique la composition lipidique et la concentration des LUV. Comme LUV changent leurs propriétés de diffusion de la lumière sur le processus de gonflement peut être contrôlée en mesurant l&#39; absorbance (Figure 2) tel que révisé par Rigaud et Levy 24 et Geertsma et al. 25. <ol><li> Pipette 800 pi de LUV (de la section 1.1, que la récupération des lipides après extrusion est de 70%, la concentration attendue de LUV est mM de phospholipides 3.6) dans un tube de 2 ml de microcentrifugation. </li><li> Ajouter 5,3 ul de tampon A et de 34,7 ul de 10% (p / v) dissous dans du DCM tampon A. </li><li> Incuber pendant 3 heures à la température ambiante avec un mélange de bout sur bout. </li><li> Pendant ce temps préparer les perles de polystyrène: <ol><li> Utilisez 400 mg de perles par échantillon et peser dans un récipient en verre. </li><li> Lavez-les deux fois avec du méthanol, trois fois avec de l&#39;eau et une fois avec le tampon A. Pour chaque utilisation de l&#39;étape de lavage 5 ml de liquide et remuer lentement pendant 10 min. NOTE: Il est recommandé de préparer le polystyrèneperles pour plusieurs échantillons à la fois, par exemple, peser 6 g de perles et on lave avec 75 ml de liquide. des perles en excès peuvent être stockés dans un réfrigérateur pendant plusieurs jours. </li></ol></li><li> Pendant les 30 dernières minutes de la vésicule déstabilisation sécher le phospholipide NBD marqué dans un tube à bouchon vissé en verre ( «reconstitution tube de verre»): Par exemple, 9,5 pi de NBD-PC (1 mg / ml dans le chloroforme, ce qui donne 0,4 mol% des phospholipides totaux) sont séchés sous un courant d&#39;azote dans un tube en verre et ensuite dissous dans 45 ul de 0,1% (p / v) de DCM dans le tampon A. </li><li> Au bout de 3 h de déstabilisation vésiculaire ajouter le phospholipide dissous NBD marqué, la protéine DDM-solubilisé et le tampon A de telle sorte que le volume final de 1 ml contient 0,36% (p / v), soit 7 mM, du DCM. <ol><li> Ainsi, pour produire des liposomes exempts de protéines (utilisé comme échantillon témoin) ajouter 45 pi de NBD-PC (dissous dans 0,1% de DCM), 60 ul de 0,1% de DCM et 55 pi de tampon A; pour protéoliposomes ajouter, pour examenple, 40 pl de protéine (à partir d&#39;une solution mère typique de ~ 110 ng / pl) à 0,1% DCM, 45 ul de NBD-PC (dissous dans 0,1% de DCM), 20 ul de 0,1% de DCM et 55 pi de tampon A . NOTE: L&#39;ordre d&#39;addition doit être comme indiqué. </li></ol></li><li> Mélanger l&#39;échantillon à une extrémité d&#39;une heure supplémentaire par rapport à la fin à la température ambiante. </li><li> Ajouter 80 mg de billes de polystyrène préparées et incuber l&#39;échantillon avec de bout en bout sur le mélange pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Ajouter ensuite 160 mg d&#39;un supplément de perles de polystyrène et on incube avec l&#39;extrémité sur l&#39;autre extrémité le mélange pendant encore 2 heures à température ambiante. </li><li> Transférer l&#39;échantillon (en laissant les billes de polystyrène passées derrière) à un tube de verre à bouchon à vis contenant 160 mg de perles de polystyrène frais et mélanger pendant une nuit à 4 ° C. NOTE: Le moyen le plus simple pour transférer l&#39;échantillon et éviter d&#39;aspirer des billes est d&#39;utiliser une pipette Pasteur qui est poussé vers le bas du tube de verre, avec une petite pression positive. Une fois que la pointe de la pipette est fermement aufond du tube, l&#39;échantillon peut être retiré facilement sans interférence des perles. </li><li> Le lendemain matin, transférer l&#39;échantillon à un tube de micro sans porter sur des billes et placer sur la glace en préparation pour le dosage de l&#39;activité scramblase. </li></ol></li></ol> 2. scramblase Essai d&#39;activité NOTE: L&#39;intensité de fluorescence des liposomes ou des protéoliposomes dilués avec le tampon A est surveillé au fil du temps après l&#39;addition de dithionite dans un spectromètre à fluorescence. Pour obtenir une intensité stable de départ, la fluorescence est enregistrée pendant au moins 50 secondes (ou jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal stable est atteint) avant d&#39;ajouter dithionite à un échantillon constamment agité et est ensuite suivie pendant au moins 500 secondes après l&#39;ajout de dithionite. <ol><li> Ajouter 1,950 ul de tampon A à une cuvette en plastique contenant une barre d&#39;agitation Mini. </li><li> Ajouter 50 ul du proteo préparé (liposomes) et de laisser l&#39;échantillon équilibrer dans le spectro de fluorescencemètre sous agitation constante pendant plusieurs secondes. </li><li> Pendant ce temps , préparer une solution de 1 M dithionite dans 0,5 M tamponnée Tris (par exemple, pour deux échantillons peser 20 mg de dithionite dans un tube de microcentrifugation et se dissolvent dans 114 ul glacée 0,5 M Tris directement avant l&#39; utilisation et garder sur la glace pour la prochaine échantillon). NOTE: La solution dithionite doit être fraîchement préparée et ne doit pas être utilisé plus de 20 minutes après la préparation; si plusieurs mesures sont à effectuer, des aliquotes de dithionite peuvent être pesés à l&#39;avance et dissous juste avant utilisation. </li><li> Démarrer le suivi de fluorescence (excitation 470 nm, émission 530 nm, largeur de fente de 0,5 nm). </li><li> Ajouter 40 ul de la solution de dithionite de 1 M à la cuvette 50 secondes après le début de l&#39;enregistrement de la fluorescence (en utilisant la cloison dans le couvercle de la chambre de la cuvette, si possible), et continuer à enregistrer la fluorescence pendant encore 400-600 sec. </li><li> Analyser les données comme décrit dans la section 3. </li></ol> 3.L&#39;analyse des données <ol><li> Cinétique de Scrambling <ol><li> Caractériser la trace de fluorescence de chaque échantillon obtenu par le dosage de l&#39; activité scramblase en définissant la fluorescence initiale, F i, avant l&#39;addition de dithionite et la fluorescence du point final F, atteint au bout de &gt; 400 s. F i est déterminé pour chaque échantillon que la valeur moyenne de la fluorescence pour la période de 30 secondes avant l&#39;addition de dithionite. </li><li> Déterminer les données de point final correspondant à l&#39;ampleur de la réduction de la fluorescence, R = 100 • F / F i. Nous utilisons les termes R L pour les liposomes sans protéines et R P pour protéoliposomes contenant opsin. </li></ol></li><li> La détermination du poids moléculaire du Fonctionnellement Reconstituée scramblase <ol><li> Convertir les données de réduction de la fluorescence en fonction de l&#39;équation suivante: p (≥1 scramblase) = (R p - R L) / (R max - R L) (équation 1) REMARQUE: Où R max est la réduction maximale qui est obtenue lorsque suffisamment de protéine est reconstituée telle que toutes les vésicules dans l&#39;échantillon possèdent au moins une scramblase fonctionnelle, et p est la probabilité qu&#39;une vésicule particulière dans un échantillon reconstitué est «scramblase actif», à savoir, elle possède au moins une scramblase fonctionnelle. La valeur de R L est typiquement de 3 à 45% tandis que R max est typiquement 82,5% 3, au lieu de 100% attendus (R peuvent être déterminées expérimentalement pour protéoliposomes opsin avec un PPR&gt; 1 mg / mmol max). En tant que R max &lt;100% , il est supposé qu&#39;une sous-population de vésicules est réfractaire à la reconstitution. Pour R max = 82,5%, la fraction de vésicules qui est incapable d&#39;accepter la protéine est de 0,35. </li><li> Décrire la relation entre p (≥1 scramblase) et PPR (mg de protéine / mmol phospholipides) par les statistiques de Poisson comme suit: p (≥1 scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (Equation 2) NOTE: Où m = nombre de scramblases par vésiculaire et α = mono-exponentielle constante ajustement en unités de mg de protéine / mmol de phospholipides. </li><li> En une fraction des vésicules ne contribue pas à brouiller même à haute PPR (voir la discussion), de modifier l&#39;équation: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equation 3) NOTE: Lorsque PPR * = PPR / (1- f), où f est la population réfractaire de vésicules ou, dans ce cas, PPR * = PPR / 0,65 (équation 4). REMARQUE: La constante α ajustement est déterminée en ajustant une courbe de p (≥1 scramblase) par rapport à la PPR * avec une fonction mono-exponentielle. Si opsin (poids moléculaire de 41,7 kDa) recompose fonctionnellement dans des vésicules de 175 nm de diamètre (chaque vésicule a 280.000 phospholipides 26) en tant que monomère, alpha = 0,187 mg mmol -1. Si opsin dimérise avant la reconstitution 3 pour produire des vésicules scramblase-actif, α= 0,37 mg mmol -1. Si PPR plutôt que PPR * devaient être utilisés pour l&#39;analyse, les valeurs alpha correspondantes seraient 0,122 et 0,244 mg mmol -1. Ces valeurs prédites pour α supposent que toutes les molécules opsin sont fonctionnellement compétent. Si seulement une fraction des molécules est compétente pour brouiller les lipides, les valeurs correspondantes de α sera plus grande. </li></ol></li></ol>

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<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Le dosage de l&#39; activité de l&#39; origine scramblase nous a permis de déterminer que l&#39; opsine a phospholipide scramblase activité 2. L&#39;essai a également permis de caractériser l&#39;activité scramblase de l&#39; opsine en testant la spécificité (nous avons utilisé une variété de lipides rapporteurs NBD marqués tels que le NBD-phosphatidyléthanolamine marquée avec NBD sur une chaîne acyle comme représenté par NBD-PC sur la figure 1A ou sur la groupe de tête, NBD-sphingomyéline ou...

La rhodopsine photorécepteur, un récepteur de protéine G couplée à prototypique ( passage en revue par exemple dans la référence 1), est le premier phospholipide scramblase à identifier et biochimiquement vérifiée 2,3. Scramblases phospholipides sont des transporteurs qui augmentent le taux intrinsèquement lent du mouvement transbilayer phospholipide physiologiquement niveaux appropriés dans une bi - directionnelle, de façon ATP-indépendant 6/4. Des exemples de leurs actions peuvent être trouvées dans le réticulum endoplasmique et de la membrane cytoplasmique bactérienne , où le brouillage constitutif est nécessaire pour l&#39; homéostase de la membrane et la croissance, ainsi que pour une variété de voies de glycosylation 5. Phospholipide régulé embrouillage est nécessaire d&#39;exposer la phosphatidylsérine (PS) à la surface des cellules apoptotiques où il agit comme un «eat-moi» -signal pour les macrophages 7 et fournit une surface procoagulante sur les plaquettes sanguines activées pour catalyser la production de facteur protéiques nécessaire pour la coagulation sanguine. Dans les membranes du disque photoréceptrices, l&#39;activité de brouillage de la rhodopsine a été suggéré pour contrebalancer le déséquilibre phospholipide entre les deux feuillets de la membrane bi - couche qui est générée par l&#39;ATP-dépendante, un lipide unidirectionnel flippase ABCA4 4,8,9 10-12. En dépit de l&#39;importance physiologique de scramblases, leur identité est restée difficile à atteindre jusqu&#39;à ce que la rhodopsine a été rapportée en tant que scramblase dans les disques photorécepteurs 2, des membres de la famille des protéines TMEM16 ont été identifiés comme Ca2 + scramblases -dépendantes nécessaires pour une exposition de PS à la membrane plasmique (passé en revue dans la référence 13), et la protéine bactérienne FTSW a été proposée comme un lipide II scramblase nécessaire pour la synthèse du peptidoglycane 14. Ces découvertes ont été basés sur la reconstitution de protéines purifiées dans des liposomes et la démonstration de l&#39;activité de scramblase dans les protéoliposomes résultant en utilisant la méthodologie described ici. Autres scramblases potentiels 15-21 - les protéines MurJ et AMJ impliqués dans la biosynthèse de peptidoglycane, WzxE et protéines apparentées impliquées dans le brouillage des précurseurs de O-antigène, la protéine MPRF nécessaire pour la translocation phosphatidylglycérol aminoacyle à travers la membrane cytoplasmique bactérienne, et les membres de la famille Xkr8 qui ont été proposées exposer PS à la surface des cellules apoptotiques - restent à tester biochimiquement. Cela souligne l&#39;importance d&#39;un test robuste pour identifier et caractériser l&#39;activité scramblase. Ici, nous décrivons la reconstitution de l&#39;opsine purifiée, l&#39;apoprotéine de la rhodopsine photorécepteur, en grandes vésicules unilamellaires (LUV), et l&#39;analyse ultérieure de l&#39;activité de scramblase dans les protéoliposomes résultant en utilisant un dosage basé sur la fluorescence. Il existe plusieurs protocoles bien décrits dans la littérature pour l&#39;expression hétérologue et la purification de l&#39;opsine, donc nous ne serons pasdécrire dans ce protocole; on utilise les protocoles décrits dans Goren et al. , ce qui donne 3 étiquetée FLAG, opsine thermostable à environ 100 ng / ul de 0,1% (p / v) , dodécylmaltoside (DDM). La reconstitution est obtenue par traitement avec un détergent LUV suffisante pour qu&#39;ils gonflent mais ne se dissolvent pas. Dans ces conditions, une protéine membranaire - fourni sous forme de micelles protéine-détergent - intégrera dans les liposomes et devient reconstituée dans la membrane des liposomes lors de l&#39;élimination de détergent, ce qui entraîne des protéoliposomes. Pour reconstituer opsine (obtenu sous la forme d&#39; une protéine purifiée dans 0,1% (p / v) DDM), LUV sont préparés à partir d&#39; un mélange de POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl - sn - glycéro-3-phosphocholine) et le POPG (1- palmitoyl-2-oléoyl sn - glycéro-3- [phospho-rac- (1-glycérol)]) et saturé avec DDM avant d&#39; ajouter opsin et NBD-PC. Le détergent est ensuite éliminé par traitement de l&#39;échantillon avec des billes de polystyrène. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Le principe de l&#39;essai à base de fluorescence est représentée sur la figure 1B. LUV sont symétriquement reconstitués avec une trace de NBD-PC ou un autre journaliste de phospholipides fluorescent NBD marqué (figure 1A). Par addition de dithionite, un non-fluorescente à la membrane impermeant dianion, les molécules NBD-PC dans le feuillet externe des GVU sont rendus en tant que groupe nitro du NBD est réduite à un groupe amino non fluorescent. Étant donné que ni les molécules NBD-PC ni dithionite sont capables de traverser la membrane sur l&#39;échelle de temps de l&#39;expérience (&lt;10 min), il en résulte 50 une réduction du signal fluorescent%. Cependant, si les liposomes sont reconstituées avec une scramblase, les molécules NBD-PC dans le feuillet interne peut mélanger rapidement vers l&#39;extérieur où ils sont réduits. Cela se traduit par la perte totale de la fluorescence dans le cas idéal (figure 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figure 1: Représentation schématique de l&#39;essai d&#39;activité scramblase L&#39;essai utilise un marqueur fluorescent rapporteur lipide NBD-marqué; NBD-PC est disponible (A). De grosses vésicules unilamellaires sont reconstituées avec une quantité trace de NBD-PC. Reconstitution produit des vésicules symétriques, avec NBD-PC répartis également dans les dépliants extérieurs et intérieurs. Dithionite (S 2 O 4 2-) réduit chimiquement le groupe nitro du NBD à un groupe amino non fluorescent. Traitement des liposomes sans protéines avec du dithionite (B, en haut) provoque une réduction de la fluorescence de 50% depuis que les molécules NBD-PC dans le feuillet externe sont réduits: dithionite est chargé négativement et ne peut pas traverser la membrane pour réagir avec des molécules NBD-PC dans le feuillet interne. Traitement dithionite de protéoliposomes contenant opsin-(B, bas), à savoir, protéoliposomes de scramblase-actif, entraîne la perte de f 100%luorescence comme opsin facilite le mouvement de NBD-PC entre l&#39;intérieur et l&#39;feuillet externe. (C) montre des traces de fluorescence idéalisées obtenus sur le traitement des liposomes dépourvus de protéine et protéoliposomes contenant opsin-dithionite. Le taux de perte de fluorescence est le même dans les deux cas, ce qui indique que la réduction chimique du NBD par le dithionite est le taux limitatif, et que le brouillage se produit à une vitesse égale ou supérieure à la vitesse de la réaction chimique. Des traces obtenues à partir d&#39; une expérience réelle sont présentés dans la figure 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Les procédés que nous décrivons peuvent être utilisées pour reconstituer et doser d&#39; autres protéines purifiées, ainsi que des mélanges de protéines membranaires obtenues, par exemple, par extraction avec un détergent 22 microsomes.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-rac-(1-glycérol) (sel de sodium)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycéro-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipéraziineacide éthananesulfonique</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&beta ;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorimètre</td><td>cuvettes sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>cuvettes</td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorimètre</td><td></td></tr><tr><td>Hydrosulfite de sodium de qualité technique, 85 %</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>dithionite</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 logiciel</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml extrudeuse&nbsp ;</td><td>Lipides du Nord, Inc.</td><td></td><td>Extrudeuse</td></tr><tr><td>Whatman, Disque de drainage, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243 Support de</td><td>disque</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Membranes gravées sur chenilles, 0.4 &micro ; m, 25 mm de diamètre</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm</td></tr> membrane <tr><td>Whatman Nucleopore Track-Etcher Membranes, 0,2 & micro ; m, 25 mm de diamètre</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm membrane</td></tr><tr><td>phosphate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR Tubes de culture, jetables, verre borosilicaté, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>tubes en verre</td></tr><tr><td>Acide perchlorique</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Molybdate d’ammonium Tétrahydraté</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>molybdate d’ammonium</td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>ascorbate de sodium</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbants</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>billes de polystyrène</td></tr><tr><td>&nbsp ; 2.0 ml Microtubes transparents</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Tubes</td></tr> de <tr><td>reconstitution Tube en verre de reconstitution</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Tubes de reconstitution</td></tr><tr><td>en verre Zetasizer&nbsp ;</td><td>Malvern&nbsp ;</td><td></td><td>Dls</td></tr></tbody></table>

un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase activité

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases phospholipides translocation à travers la membrane bicouche bidirectionnellement de façon ATP-indépendant. La première scramblase à identifier et biochimiquement vérifiée a été Opsin le apoprotéine du rhodopsine photorécepteur. Rhodopsine est un récepteur couplé aux protéines G localisée dans les membranes de disque tige photoréceptrices de la rétine, où il est responsable de la perception de la lumière. L&#39;activité de scramblase de rhodopsine ne dépend pas de son ligand 11- cis -retinal, à savoir, l&#39;opsine apoprotéine est également actif en tant que scramblase. Bien phospholipides constitutive et régulée de brouillage jouent un rôle important dans la physiologie cellulaire, seulement quelques scramblases phospholipides ont été identifiés à ce jour plus de opsin. Nous décrivons ici un dosage basé sur la fluorescence de l&#39;activité de scramblase opsine. Opsine est reconstitué dans de grands liposomes unilamellaires composés de phosphatidylcholine, phosphatidylglycérol et une quantité trace de fluorescence NBD-PC marqué (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl) amino] hexanoyl} - sn - glycéro-3-phosphocholine). scramblase activité est déterminée en mesurant la mesure dans laquelle les molécules NBD-PC situé dans le feuillet interne de la vésicule sont en mesure d&#39;accéder au feuillet externe où leur fluorescence est éliminé par voie chimique d&#39;un agent réducteur qui ne peut pas traverser la membrane. Les procédés décrits ici ont une applicabilité générale et peuvent être utilisées pour identifier et caractériser les activités de scramblase d&#39;autres protéines membranaires.

Nous décrivons la reconstitution de opsin en LUV pour caractériser son activité scramblase en utilisant un test basé sur la fluorescence. Nous analysons les résultats pour placer une limite inférieure du taux de phospholipides opsin médiation de brouillage et de déterminer l&#39;état oligomérique dans lequel opsin reconstitue fonctionnellement dans les vésicules. Pour déterminer les conditions optimales de reconstitution, il e...

Nous décrivons un test basé sur la fluorescence pour mesurer le brouillage des phospholipides dans de grands liposomes unilamellaires reconstitués avec de l’opsine.

Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

L'objectif général de cette procédure est de réconstituer un récepteur couplé à une protéine G typique dans des vésicules unilamellaires géantes, et de mesurer sa capacité à effectuer un translocation indépendante de 80p de phospholipides à travers une bicouche lipidique à l’aide d’un dosage basé sur la fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du transport intercellulaire des lipides, telles que l’identité moléculaire des protéines capables de mélanger les lipides et leur mécanisme d’action. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très fiable et robuste.Une fois que votre procédure de reconstitution est établie pour une composition lipidique donnée et un détergent choisi. Pour commencer cette procédure, utilisez une seringue en verre pour ajouter 1435 microlitres d'une solution de POPC à 25 milligrammes par millilitre dans le chloroforme dans un ballon à fond rond. Ajoutez 160 microlitres d'une solution de POPG à 25 milligrammes par millilitre dans le chloroforme afin d'obtenir 52,5 micromoles de lipides totaux dans un rapport molaire de neuf pour un de POPC par rapport à POPG.Ensuite, séchez les lipides pendant 30 minutes à l'aide d'un évaporateur rotatif réglé à 145 tr/min. Une fois le séchage terminé, transférez le flacon dans un dessiccateur sous vide pendant trois heures à température ambiante. Puis, ajoutez 10 millilitres de tampon A pour hydrater le film lipidique desséché.Agiter doucement le flacon jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène et trouble. Soniquer la suspension à une fréquence de 40 kilohertz dans un bain d'eau à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, à l'aide d'un extrudeur, faire passer l'échantillon à travers une membrane de 400 nanomètres de taille de pore, 10 fois.Suivez cela par un deuxième cycle d’extrusion, en faisant passer l’échantillon à travers une membrane de 200 nanomètres de taille de pore, quatre fois. Mettez de côté la suspension devenant visiblement plus claire, qui contient des vésicules unilamellaires de phospholipides d’environ 175 nanomètres de diamètre. Une fois l’extrusion terminée, préparez les étalons dans des tubes en verre de 13 par 100 millimètres comme indiqué dans le protocole écrit.Ensuite, ajouter 10 microlitres de chaque échantillon de VUG et de protéoliposome dans un tube en verre distinct et diluer avec 40 microlitres d'eau distillée désionisée. Ajouter 300 microlitres d'acide perchlorique dans chaque tube, puis chauffer pendant une heure à 145 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Placer un petit bouchon sphérique sur chaque tube afin d'éviter l'évaporation.Ensuite, laissez refroidir les tubes à température ambiante et ajoutez un millilitre d'eau distillée désionisée à chacun. Ajoutez 400 microlitres d'une solution fraîchement préparée contenant 12 grammes par litre de molybdate d'ammonium et 50 grammes par litre d'ascorbate de sodium à chacun, puis vortexez pour homogénéiser. Chauffez les tubes pendant 10 minutes à 100 degrés Celsius en utilisant des billes pour éviter l'évaporation.Ensuite, retirez les tubes du bloc chauffant et laissez-les refroidir à température ambiante. À l'aide d'un spectromètre réglé sur 797 nanomètres, établissez une courbe de calibration en utilisant les étalons. Puis, mesurez l'absorbance des échantillons par rapport au témoin et déterminez la teneur en phosphate.Commencez par pipeter 800 microlitres de chaque suspension de VUG extrudées dans un tube microfus de deux millilitres unique. Ajoutez 5,3 microlitres du tampon A et 34,7 microlitres de DDM à 10 % masse par volume, dissous dans le tampon A, à chaque tube. Incubez ensuite les échantillons pendant trois heures à température ambiante avec un mélange bout à bout.Pendant l'incubation des échantillons, peser 400 milligrammes par échantillon de billes dans un bécher en verre. Laver les billes avec cinq millilitres par échantillon de méthanol, en agitant doucement pendant 10 minutes. Répéter ce lavage une fois avec du méthanol, trois fois avec de l'eau et une fois avec le tampon A. Pendant les 30 dernières minutes d'incubation des échantillons, sécher 9,5 microlitres par échantillon de phospholipide marqué au NBD dans un tube en verre à bouchon vissé sous un courant d'azote.Ensuite, ajoutez 45 microlitres par échantillon de DDM à 0,1 % en masse par volume dans le tampon A pour dissoudre le phospholipide séché. Une fois l'incubation terminée, ajoutez la solution de phospholipide marquée au MBD dissoute à chaque échantillon. Puis, ajoutez 0,1 % de DDM, le tampon A, puis la rhodopsine solubilisée dans le DDM en quantité souhaitée, dans cet ordre, afin d'obtenir un volume final d'un millilitre avec une concentration de sept millimolaire en DDM.La reconstitution d'une protéine membranaire est réalisée en traitant des vésicules avec un détergent en quantité suffisante pour que le gonflement n'entraîne pas la dissolution. Dans ces conditions, qui doivent être déterminées empiriquement pour chaque composition lipidique et chaque détergent, la protéine s'intègrera dans les liposomes. Mélanger les échantillons pendant une heure à température ambiante.Ensuite, ajoutez 80 milligrammes des billes de polystyrène préparées dans chaque tube, puis incubez à nouveau pendant une heure à température ambiante avec un mélange bout à bout. Ajoutez 160 milligrammes supplémentaires de billes de polystyrène à chaque échantillon, puis incubez pendant deux heures à température ambiante avec un mélange bout à bout. Une fois l'incubation terminée, transférez les échantillons, en laissant les billes derrière, vers des tubes propres en verre, chacun contenant 160 milligrammes de billes fraîches.Mélanger bout à bout toute la nuit à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Ensuite, transférer les échantillons, sans les billes, dans des tubes microfuse distincts. Placer les tubes sur de la glace en prévision du dosage de l’activité de la scramblase.Commencez par ajouter 1950 microlitres du tampon A dans une cuvette en plastique contenant une barre d'agitation en plastique. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de l'échantillon de protéoliposomes préparé. Laissez l'échantillon s'équilibrer dans le spectromètre de fluorescence avec agitation constante pendant cinq secondes.Pendant que l'échantillon s'équilibre, préparez une solution de dithionite un molaire dans du tris non tamponné 0,5 molaire. Commencez la surveillance de la fluorescence avec une excitation à 470 nanomètres, une émission à 530 nanomètres et une largeur de fente de 0,5 nanomètre. Enregistrez pendant 50 secondes afin d'obtenir un signal stable.Ensuite, ajoutez 40 microlitres de solution de dithionite un molaire à la cuvette. Enregistrez la fluorescence pendant au moins 500 secondes. Enfin, analysez les données comme décrit dans le protocole textuel.Pour une analyse complète des données de fluorescence, notamment afin de déterminer la fraction de vésicules qui ne peuvent pas être reconstituées, le rendement de récupération des protéines et des lipides dans les vésicules reconstituées, ainsi que la distribution de taille des vésicules. Dans cette étude, l'opsine est reconstituée dans des vésicules unilamellaires de grande taille afin de caractériser son activité de scramblase à l'aide d'un dosage fondé sur la fluorescence.Les vésicules sont reconstituées avec du NBD-PC, qui se répartit également entre les feuillets externe et interne. Le dithionite réduit le groupe nitro du NBD situé à l'extérieur de la vésicule en un groupe amino non fluorescent, entraînant une réduction de 50 % de la fluorescence dans les liposomes sans protéine. Toutefois, lorsque l'opsine facilite le déplacement du NBD entre le feuillet interne et externe, une disparition complète de la fluorescence est observée.Les résultats représentatifs de cette approche à différents rapports protéine sur phospholipide peuvent être observés ici. Le degré de réduction de la fluorescence augmente avec la quantité d'opsine réintégrée dans les vésicules, qui varie de zéro à 4,95 microgrammes. Le dithionite a été ajouté au moment indiqué, et la fluorescence du NBD a été suivie pendant 400 secondes.La réduction de la fluorescence est plus marquée à des rapports protéine sur phospholipide plus élevés, la réduction maximale étant de 85 %. La réduction de fluorescence en point final est ensuite utilisée pour déterminer la probabilité d'une activité de scramblase, c'est-à-dire la probabilité qu'une vésicule possède au moins une scramblase, en utilisant les statistiques de Polson. La courbe rouge représente un ajustement mono-exponentiel pour l'opsine. Les lignes grises en pointillés représentent des ajustements mono-exponentiels pour la réintégration de l'opsine dans les vésicules sous forme de monomères, de dimères préformés ou de tétramères préformés.La méthode que nous décrivons peut facilement être adaptée à différents besoins. Les procédures sont polyvalentes et pourront être utilisées à l'avenir pour identifier et caractériser l'activité de scramblase des phospholipides d'autres protéines membranaires. La procédure de réconstitution peut être appliquée à toute protéine membranaire.Cette technique nous a permis d'identifier l'opsine comme la première scramblase de phospholipides vérifiée sur le plan biochimique et de caractériser, par la suite, l'activité de différents états conformationnels de la protéine, ainsi que sa capacité à transporter divers lipides.

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PI (4,5) P2 régule diverses fonctions cellulaires, mais son organisation à l' échelle nanométrique dans la membrane plasmique de la cellule est mal comprise. Par étiquetage PI (4,5) P 2 avec une sonde fluorescente à double couleur fusionnée au domaine Pleckstrin Homology, nous décrivons une nouvelle approche pour étudier la PI (4,5) P2 distribution spatiale dans la membrane plasmatique à l'échelle du nanomètre .

Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

Nous présentons ici une bicouche lipidique supportée dans le contexte d'une plate-forme microfluidique pour étudier les interactions protéines-phosphoinositides en utilisant une méthode sans étiquette basée sur la modulation du pH.

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Ce protocole décrit la fabrication de liposomes et comment ceux-ci peuvent être immobilisés sur une surface et représentés individuellement d'une manière parallèle massive à l'aide de la microscopie fluorescence. Cela permet de quantifier la taille et l'inhomogénéité compositionnelle entre les liposomes simples de la population.

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Le test de fuite de fluorescence est une méthode simple qui permet d’enquêter sur les interactions peptide/membrane afin de comprendre leur implication dans plusieurs processus biologiques et en particulier la capacité des peptides pénétrants dans les cellules à perturber les bicouches de phospholipides lors d’un processus de translocation cellulaire directe.

Test de fuite fluorescente pour étudier la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules

Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Nous présentons une méthode rentable pour évaluer la perméabilité de la membrane liposomale avec une sensibilité et une résolution supérieures aux techniques conventionnelles. À l’aide d’une nouvelle réaction de substitution de ligand encapsulé, cette technique détecte les changements induits par la phospholipase A2 dans les membranes modèles. Facilement intégrée aux analyses standard, cette approche accessible améliore la résolution pour l’étude de la biophysique membranaire et des...

Essai de perméabilité de la membrane des liposomes pour étudier les effets des groupes phosphate de phosphatidylinositol sur l’action membranotrope du venin PLA2

Découvrez un test de fluorescence pour mesurer l'activité scramblase des phospholipides dans des liposomes reconstitués avec l'opsine. Cette méthode robuste permet d'étudier le transport lipidique intercellulaire et d'identifier les protéines impliquées.

Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

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