Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Les interactions protéiques sont au cœur de la fonction d'une cellule. techniques calorimétriques et spectroscopiques sont couramment utilisés pour les caractériser. Nous décrivons ici anisotropie de fluorescence comme un outil pour étudier l'interaction entre la protéine mutée dans le syndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) et le facteur Allongement-like 1 GTPase (EFL1).

L’objectif général de cette expérience est d’évaluer et de quantifier l’interaction entre deux protéines d’intérêt en utilisant l’anisotropie de fluorescence. Ces mesures peuvent aider à répondre à des questions clés. Le domaine de la biochimie et de la biophysique des protéines, comme les protéines dont les interactions sont importantes pour la fonction cellulaire.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir des informations quantitatives et qualitatives sur l’interaction protéine-protéine. Pour préparer la protéine SBDS-FlAsH purifiée, préparez d’abord un litre de milieu liquide LB complété par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Et dans celui-ci, la culture a transformé les bactéries à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,5 à 0,7.

Induire l’expression de la protéine SBDS-FlAsH en ajoutant 0,5 millimolaire d’IPTG à la culture et poursuivre l’incubation pendant cinq heures supplémentaires. Ensuite, collectez la suspension bactérienne par centrifugation à 3800 fois G pendant dix minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant.

Remettre les cellules en suspension dans 35 millilitres de beurre de lyse SBDS complété par un PMSF millimolaire. Lyse par sonication pendant une durée totale de quatre minutes en utilisant des cycles de dix secondes de marche et 30 secondes d’arrêt à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 9 000 fois G pendant 50 minutes à quatre degrés Celsius.

Conservez le surnageant et jetez la palette pour enlever les débris cellulaires. Après avoir équilibré la colonne d’affinité de nickel avec trois volumes de colonne de tampon de lyse SBDS, introduisez l’ensemble du surnageant clarifié sur la colonne. Éliminer la protéine non liée en la lavant avec trois volumes de colonne de tampon de lyse SBDS.

Après le lavage de la colonne, éluer la protéine liée avec trois volumes de colonne de tampon d’élution SBDS. Pour purifier davantage la protéine, équilibrez la colonne de l’échangeur de cations sulfopropylique avec trois volumes de colonne tampon à faible teneur en sel S. Diluez la protéine six fois avec un tampon de phosphate de 50 millimolaires PH 6,5 et introduisez-la dans la colonne.

Lavez le matériau non lié avec trois volumes de colonne de tampon de colonne S à faible teneur en sel. Ensuite, éluez la protéine en une seule étape en ajoutant 50 millimolaires de tampon de phosphate PH 6,5, une molaire de chlorure de sodium sur la colonne. Diluez l’éluat trois fois avec un tampon phosphate de 50 millimolaires PH 6,5.

Ensuite, concentrez la protéine avec des dispositifs d’ultrafiltration par centrifugation à 3800 fois G pendant quinze minutes. La qualité des protéines utilisées dans ce type d’expérience est très puissante. L’interprétation des données se complique si les échantillons de protéines utilisés ne sont pas d’une grande pureté.

Vérifier la pureté de la protéine SBDS-FlAsH par analyse SDS-PAGE et coloration de Coomassie. Congelez la protéine dans de l’azote liquide et stockez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement. Pour préparer la protéine EFL1 purifiée, la première culture a transformé la levure à 30 degrés Celsius dans un litre de milieu synthétique sans uracile, complété par 0,5 % de glucose jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 1,8.

Induire l’expression des protéines en ajoutant 2,8 pour cent de galactose à la culture et poursuivre l’incubation pendant 18 heures à 30 degrés Celsius. Recueillir la suspension de levure par centrifugation à 3800 fois G pendant dix minutes à quatre degrés Celsius. Retirer le surnageant après la centrifugation.

Remettre les cellules en suspension dans 50 millilitres de tampon de lyse EFL1 complété par un PMSF millimolaire et un millimolaire de benzamidine. Perturbez les cellules par friction sur un batteur à billes à l’aide de billes de verre pendant une durée totale de six minutes en utilisant des cycles de deux minutes de marche et quinze minutes d’arrêt à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 9 000 fois G pendant 50 minutes à quatre degrés Celsius.

Conservez le surnageant et jetez le palais pour éliminer les débris cellulaires. Ensuite, équilibrez la colonne d’affinité de nickel avec trois volumes de colonne de tampon de lyse EFL1. Introduire tout le surnageant clarifié sur la colonne équilibrée.

Après avoir éliminé la protéine non liée en lavant la colonne avec trois volumes de colonne de tampon de lyse EFL1, éluez la protéine liée avec trois volumes de colonne de tampon d’élution EFL1. Pour purifier davantage la protéine EFL1, équilibrez la colonne d’exclusion de taille avec 1,5 volume de colonne de tampon d’anisotropie. Concentrez la protéine EFL1 éludée de la colonne d’affinité nickel à un millilitre avec des dispositifs d’ultrafiltration par centrifugation à 3800 fois G. Ensuite, introduisez l’échantillon concentré dans la colonne d’exclusion de taille.

Recueillir la protéine éludée et la concentrer par ultrafiltration jusqu’à une concentration finale d’environ 30 micromolaires. Vérifiez la pureté de la protéine EFL1 par analyse SDS-PAGE et coloration de Coomassie. Congelez rapidement la protéine dans de l’azote liquide et stockez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement.

Mélangez trois nanomoles de la protéine SBDS-FlAsH avec trois nanomoles du colorant vert lumio dans un volume de cinq micromètres de tampon d’anisotropie. Laissez la réaction se poursuivre pendant huit heures à quatre degrés Celsius. Après huit heures, dialysez l’échantillon contre le tampon d’anisotropie pendant la nuit pour éliminer le colorant libre.

Mesurez les absorbants à 280 nanomètres et 508 nanomètres dans un spectrophotomètre à l’aide d’une cuvette à quartz. Ensuite, utilisez la loi de Lambert-Beer pour quantifier le pourcentage de protéines étiquetées comme décrit dans le protocole textuel. Avant de mesurer la valeur d’anisotrophie, chaque étape de filtration de la légion de protéines doit être effectuée avec soin, en veillant à ce que l’ensemble de l’échantillon soit distribué dans la solution et devienne homogène.

Dans une cuvette de fluorescence, placez 200 microlitres de SBDS-FlAsH nanomolaire dans un tampon d’anisotrophie et titrez deux microlitres de 30 micromolaires EFL1. Mélangez soigneusement et laissez la réaction reposer pendant trois minutes avant de mesurer l’anisotrophie et la valeur de fluorescence. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’un volume total de 40 microlitres d’EFL1 ait été ajouté.

Comme dernière étape, ajustez les données à un modèle de liaison présumée tel que décrit dans le protocole texte. Pour réaliser une expérience d’anisotrophie, il est important d’exclure les changements importants de l’intensité de la fluorescence. Comme le montre ici, la fluorescence de SBDS-FlAsH ne change pas sensiblement lors de la liaison à EFL1.

Le titrage d’EFL1 dans une cuvette en quartz contenant du SBDS-FlAsH entraîne une augmentation de l’anisotrophie initiale observée. Plusieurs ajouts de EFL1 décrivent la courbe de liaison correspondante qui peut être ajustée à l’aide d’une régression des moindres carrés non linéaire à un modèle de liaison présumé. Dans ce cas, un modèle à un site de liaison ne décrit pas correctement les données expérimentales.

Au lieu de cela, un modèle à deux sites de liaison non identiques décrit correctement les données expérimentales. Une fois maîtrisée, l’expérience de liaison à l’anisotrophie de fluorescence peut être réalisée en trois heures si elle est réalisée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’avoir des protéines purifiées en grande quantité.

Parallèlement à cette procédure, d’autres méthodes comme celle-ci avec le test de complémentation basé sur les fragments, ou l’anisotrophie de fluorescence avec différents domaines de la protéine étudiée peuvent être réalisées afin de soutenir le modèle de liaison approprié. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser une expérience de liaison suivie d’une anisotrophie de fluorescence.