Name: Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez comment utiliser l'anisotropie de fluorescence pour quantifier les interactions protéine-protéine entre SBDS et EFL1. Cette méthode fournit des données quantitatives essentielles pour la biochimie cellulaire.

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Les auteurs remercient le soutien financier des projets CONACyT numéros 167359 et 177138, et du projet DGAPA-UNAM numéro IN201615.

1. SBDS-Flash tag Protein Expression et purification Remarque: Pour les expériences d&#39;anisotropie, un flash-étiquette correspondant à la séquence Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys a été ajouté à l&#39;extrémité C-terminale des séquences codantes humaines SBDS par PCR. Cette construction a été sous - cloné dans le vecteur d&#39;expression présets-A et transformé en cellules C41 Escherichia coli pour exprimer une protéine codant pour une étiquette hexahistidine N-terminal (His-tag), les SBDS humaines séquence et une extrémité C-terminale ÉCLAIR étiquette 10 codage. <ol><li> SBDS-FlAsH expression de la protéine <ol><li> Transformer E. compétente cellules coli C41 avec le plasmide présets-HisSBDS-flash en utilisant un protocole de choc thermique standard 19. Plaque les cellules de Luria-Bertani (LB) milieu solide complété avec 100 pg / ml d&#39;ampicilline. La composition des milieux LB solides est constituée de 10 g de NaCl, 5 g d&#39;extrait de levure, 10 g de tryptone et 20 g d&#39;agar à 1 L de volume. </li><li> La culture des bactéries transformées à 37 ° C jusqu&#39;à ce queabsorbance à 600 nm (600) atteint 0,5 à ,7 dans 1 L de milieu LB liquide additionné de 100 pg / ml d&#39; ampicilline. </li><li> Induire l&#39;expression de la protéine en ajoutant 0,5 mM d&#39;isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside à la culture et poursuivre l&#39;incubation pendant encore 5 heures. </li><li> Recueillir la suspension bactérienne par centrifugation à 3800 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. A ce stade, soit stocker le culot cellulaire à -20 ° C ou à utiliser immédiatement pour la purification des protéines. </li></ol></li><li> SBDS-FlAsH purification des protéines Remarque: Toutes les étapes chromatographiques sont effectuées à l&#39;aide d&#39;un système de chromatographie en phase liquide (FPLC), la protéine rapide ou une pompe péristaltique. La chromatographie de Ni 2+ utilise une colonne à écoulement rapide de 5 ml. chromatographie par échange anionique utilise une colonne échangeuse de cations sulfopropyl forte 5 ml. Un débit de 3 ml / min a été utilisé pour toutes les étapes chromatographiques. <ol><li> Remettre en suspension les cellules dans 35 ml de SBDS b Lysisuffer (50 mM de phosphate tampon à pH 7,5, 300 mM de NaCl, 20 mM d&#39;imidazole) supplémenté avec du fluorure 1 mM de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et Lyse par sonification pendant une durée totale de 4 minutes en utilisant des cycles de 10 s ON et 30 s OFF à 4 ° C. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 9000 xg pendant 50 min à 4 ° C. </li><li> Gardez le surnageant et jeter le culot pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Equilibrer la colonne d&#39;affinité Ni2 + avec 3 volumes de colonne (CV) de tampon de lyse SBDS et introduire l&#39;ensemble de surnageant clarifié sur la colonne. </li><li> Retirer la protéine non liée par lavage avec 3 CV de tampon Lysis SBDS et éluer avec 3 CV de tampon SBDS Elution (tampon phosphate 50 mM pH 7,5, 300 mM de NaCl, 250 mM imidazole). </li><li> Diluer la protéine de 6 fois en éluant avec un tampon phosphate 50 mM pH 6,5 et éliminer les agrégats éventuels, par filtration à travers une membrane de 0,22 um de cellulose. </li><li> Equilibrer la colonne échangeuse de cations de sulfopropyle avec 3 CV de faible sel S colonneun tampon (tampon phosphate 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) et d&#39;introduire l&#39;échantillon de protéine à partir de l&#39;étape précédente. </li><li> Lavage la matière non liée avec 3 CV de tampon de colonne S faible teneur en sel et éluer la protéine en une seule étape avec 50 mM de tampon phosphate pH 6,5, 1 M de NaCl. </li><li> Diluer la protéine de 3,3 fois en éluant avec un tampon phosphate 50 mM pH 6,5. Concentrer la protéine avec des dispositifs d&#39;ultrafiltration par centrifugation à 3 800 xg pendant 15 min. Flash geler la protéine dans de l&#39;azote liquide et le stocker à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Vérifier la pureté de la protéine par l&#39; analyse par SDS-PAGE et coloration au Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 Protein Expression et purification NOTE: EFL1 a été exprimée sous la régulation du Gal 1/10 promoteur divergent 21 et le Saccharomyces cerevisiae MAT A 3&#39;UTR dans le pRS426 vectoriel. La protéine recombinante codant l&#39;isoforme EFL1 humaine 1 fusionné à un virus protease Tobacco Etch (TEV) site de reconnaissance et d&#39;une étiquette hexahistidine à l&#39;extrémité C-terminale. <ol><li> EFL1 expression de la protéine <ol><li> Transformer S. cellules cerevisiae BCY123 avec le plasmide pRS426-EFL1TevHis en utilisant un protocole standard au lithium acétate 22. Plate toutes les cellules transformées dans des milieux à goutte synthétique sans uracile (URA SD) supplémenté avec 2% (p / v) de glucose. Composition du milieu SD-URA est composé de 8 g de base azotée de levure sans acides aminés, 11 g d&#39;acides casamino, 55 mg de sulfate d&#39;adénine, 55 mg de tyrosine, 60 mg de leucine et de tryptophane 60 mg pour 1 litre de volume. </li><li> La culture de levure transformée à 30 ° C jusqu&#39;à A600 atteint 1,8 dans 1 litre de milieu SD-URA supplémenté avec 0,5% (p / v) de glucose. </li><li> Induire l&#39;expression de protéine par addition de 2,8% (p / v) de galactose à la culture et poursuivre l&#39;incubation pendant encore 18 heures à 30 ° C. </li><li> Recueillir la suspension de levure par centrifugation à 3800 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.A ce stade, soit stocker le culot cellulaire à -20 ° C ou à utiliser immédiatement pour la purification des protéines. </li></ol></li><li> EFL1 purification des protéines Remarque: Toutes les étapes chromatographiques sont effectuées à l&#39;aide d&#39;un système FPLC ou une pompe péristaltique. La Chromatographie de Ni 2+ utilise une colonne à écoulement rapide de 5 ml à un débit de 3 ml / min de débit. Chromatographie d&#39;exclusion de taille utilise une colonne de 125 ml préalablement garnie de résine Superdex 200 à un débit de 1 ml / min. <ol><li> Remettre en suspension les cellules dans 50 ml de EFL1 de tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl pH 8, 300 mM de NaCl, 20 mM d&#39; imidazole, 5 mM de MgCl2, 10% de glycerol) supplémenté avec 1 mM de PMSF et 1 mM de benzamidine et de perturber les cellules par frottement sur un batteur à billes utilisant des billes de verre (Ø = 0,5 mm) pour une durée totale de 6 min à l&#39;aide des cycles de 2 min et 15 min OFF, à 4 ° C. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 9000 xg pendant 50 min à 4 ° C. </li><li> Gardez le surnageant et jeter le culot pour éliminer les débris cellulaires. </li&gt; <li> Equilibrer la colonne d&#39;affinité Ni2 + avec 3 CV de tampon Lysis EFL1 et introduire la totalité du surnageant clarifié sur la colonne. </li><li> Éliminer la protéine non liée par lavage avec 3 CV de tampon de lyse EFL1 et éluer avec 3 CV de tampon d&#39; élution EFL1 (50 mM de Tris-HCl , pH 8, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, MgCl2 5 mM, glycerol à 10%). </li><li> Équilibrer la colonne d&#39;exclusion de taille avec 1,5 CV de tampon d&#39; anisotropie (Tris-HCl 50 mM , pH 7,5, 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 10% de glycerol, 5 mM de β-mercaptoéthanol). </li><li> On concentre à 1 ml de la protéine EFL1 élue de la colonne d&#39;affinité Ni2 + avec des dispositifs d&#39;ultrafiltration par centrifugation à 3 800 x g pour le volume désiré. Introduire l&#39;échantillon sur la colonne d&#39;exclusion de taille. </li><li> Recueillir la protéine éluée et on concentre par ultrafiltration à une concentration finale d&#39;environ 30 uM. Flash geler la protéine dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. Vérifiez ee pureté de la protéine par analyse SDS-PAGE et coloration au Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 3. Étiquetage des SBDS-avec le flash Fluorescent Dye 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine <ol><li> Mélanger 3 nmol de la protéine SBDS-FlAsH avec 3 nmol de la 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine dans un volume de 5 pi de tampon anisotropie. </li><li> Laissez la réaction se déroule pendant 8 heures à 4 ° C. Dialyser l&#39;échantillon contre un tampon anisotropie pendant la nuit pour enlever le colorant libre. </li><li> Utilisez la loi de Beer-Lambert pour quantifier le% de protéine marquée. Mesurer l&#39;absorbance à 280 nm et 508 nm dans un spectrophotomètre en utilisant une cuvette en quartz de volume approprié. NOTE: Considérons les coefficients d&#39;absorption molaires suivants (M -1 cm -1): <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li> Calculer la concentration de protéine marquée SBDS Flash en utilisant l&#39;équation 2. <img alt="équation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li> Calculer la concentration de protéine totale SBDS en utilisant l&#39; équation 3 en remplaçant la calculé C SBDS-FlAsH de l&#39; étape précédente. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li> Calculer le pourcentage de protéine marquée en utilisant l&#39;équation 4. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. Les expériences Fluorescence anisotropie REMARQUE: Les expériences ont été effectuées d&#39;anisotropie dans un spectrofluorimètre équipé d&#39;un ensemble de boîtes à outils de polarisation et des données a été effectuée en utilisant le programme d&#39;anisotropie fourni dans le logiciel de l&#39;équipement. La longueur d&#39;onde d&#39;excitation a été réglée à 494 nm avec une largeur de bande spectrale de 8 nm et l&#39;émission a été enregistrée à l&#39;aide d&#39;un filtre passe-bande de 530 ± 25 nm. Les mesures ont été effectuées à 25 ° C dans une cuvette de 200 ul d&#39;une 5 mm de longueur de trajet 10. <ol><li><html> Dans une cuvette de fluorescence, placer 200 pi de 30 nM SBDS clignotements de tampon anisotropie et titrez 2 pl de 30 uM EFL1. Bien mélanger et laisser reposer la réaction pendant 3 minutes avant de mesurer la valeur d&#39;anisotropie. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.1 jusqu&#39;à un volume total de 40 pi de EFL1 a été ajouté. </li></ol> Analyse 5. Données <ol><li> Monter les données sur le modèle de liaison approprié à l&#39;aide d&#39;un algorithme non linéaire des moindres carrés de régression. Les équations pour les modèles de liaison les plus courants sont présentés dans le tableau 1. </li><li> Évaluer le meilleur modèle qui décrit l&#39;interaction entre les protéines en inspectant les résidus de l&#39;ajustement 23. Soutenir le modèle choisi avec des expériences supplémentaires. </li></ol> Tableau 1 : Modèles de liaison commun interaction protéine-protéine et des équations mathématiques qui les décrivent.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table. <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

<ol><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).</li>
<li>Snider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+protein+interaction+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of protein interaction network mapping.</a> Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Structure+and+mechanism+in+protein+science%3A+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein+folding%22">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding</a>. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).</li>
<li>Menne, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shwachman-Bodian-Diamond+syndrome+protein+mediates+translational+activation+of+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast.</a> Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).</li>
<li>Boocock, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SBDS+are+associated+with+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome.</a> Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).</li>
<li>Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Guanine+Nucleotide+Exchange+in+the+Elongation+Factor-like+1+%28EFL1%29+GTPase+by+Mutations+in+the+Shwachman-Diamond+Syndrome+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein.</a> J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).</li>
<li>Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanine+nucleotide+exchange+in+the+ribosomal+GTPase+EFL1+is+modulated+by+the+protein+mutated+in+the+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Third, Springer US. (2010).</li>
<li>Nishigaki, T., Treviño, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishigaki%2C+T+%22Tools+to+understand+protein-protein+interactions%22">Tools to understand protein-protein interactions</a>. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).</li>
<li>Johnson, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).</li>
<li>Sabnis, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabnis%2C+RW+%22Handbook+of+Fluorescent+Dyes+and+Probes%22">Handbook of Fluorescent Dyes and Probes</a>. , Wiley. (2015).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications.</a> J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281 (5374), 269-272 (1998).</li>
<li>Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+labeling+of+proteins%3A+techniques+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches.</a> Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL1-GAL10+divergent+promoter+region+of+Saccharomyces+cerevisiae+contains+negative+control+elements+in+addition+to+functionally+separate+and+possibly+overlapping+upstream+activating+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences.</a> Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Eftink, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+for+studying+equilibrium+macromolecule-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions.</a> Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Substrates+to+the+Central+Pore+of+the+Vps4+ATPase+Is+Autoinhibited+by+the+Microtubule+Interacting+and+Trafficking+%28MIT%29+Domain+and+Activated+by+MIT+Interacting+Motifs+%28MIMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs).</a> J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).</li>
<li>Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+natively+unfolded+HIF-1alpha+ODD+domain+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53.</a> Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).</li>
<li>Trusch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Region+of+the+Ubiquitin+Regulatory+X+%28UBX%29+Domain-containing+Protein+1+%28UBXD1%29+Modulates+Interdomain+Communication+within+the+Valosin-containing+Protein+p97%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97.</a> J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).</li>
<li>Kamp, F., Beyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+alpha-synuclein+affects+the+lipid+packing+in+bilayers+of+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemsitry%22%5BJournal%5D)">Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles.</a> The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).</li>
<li>Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Intensity%2C+Anisotropy%2C+and+Transient+Dynamic+Quenching+Stopped-Flow+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Spectroscopic+Methods+of+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics.</a> Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).</li>
<li>Asano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+EFL1+and+SBDS+is+mediated+by+an+intrinsically+disordered+insertion+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer et ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La plupart des expériences biochimiques avec les protéines ne nécessitent pas de protéine pure, mais aussi de grandes quantités d&#39;entre eux, quelle que soit la technique utilisée. Pour cette raison, les protéines utilisées pour ce type d&#39;expériences sont obtenues par expression hétérologue, comme ce fut le cas présenté ici. La spectroscopie de fluorescence nécessite la présence d&#39;un fluorophore dans la molécule étudiée. des résidus aromatiques constituent les fluorophores intrinsèques d&#39;une protéine, tou...

Les cellules contiennent une multitude de macromolécules biologiques qui interagissent en permanence les uns avec les autres. Cette association donne naissance à des complexes qui participent aux mécanismes cellulaires responsables de leur fonctionnement dans la transduction du signal, la régulation de l&#39;expression génique et la migration cellulaire, entre autres. Toutes les interactions protéine-protéine qui se produisent dans une cellule comprennent un réseau connu sous le nom intéractome. Dans Saccharomyces cerevisiae plus de 70% de ses protéines se sont révélées avoir des partenaires qui interagissent 1. Comprendre l&#39;interactome d&#39;une cellule et leurs fonctions de fournir des informations pertinentes sur la complexité et la diversité des organismes vivants. Plusieurs méthodes ont été décrites pour identifier et caractériser les interactions protéine-protéine. Différent haute grâce à des méthodes telles que mettre deux hybrides de levure 2, protéine fragment complémentation essais 3, la purification par affinité 4 couplée à la spectrométrie de masse et de protéines microarrays sont utilisés pour identifier une interaction 5,6. Une fois identifié, il est nécessaire de le valider et cela peut varier au cas par cas. En règle générale, ces essais impliquent perturber l&#39;interaction elle - même au niveau des membres individuels de la paire d&#39;interaction, par exemple par délétion du gène ou de la surexpression d&#39;une des protéines, puis la recherche de changements dans les propriétés ou la fonction de l&#39;autre élément à la niveau cellulaire. Par la suite, des techniques biophysiques 7 sont utilisées pour caractériser les interactions protéine-protéine au niveau moléculaire. A cet effet, la structure des complexes de protéines sont déterminées par cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire et de cryo-microscopie électronique tandis que la calorimétrie et la spectroscopie de fluorescence sont utilisés pour décrire quantitativement et mécaniquement entre eux. Dans ce travail, l&#39;anisotropie de fluorescence a été utilisé comme une technique pour caractériser l&#39;interaction entre la GTPase EFL1 et le SBDprotéine S. Ces protéines participent à la synthèse des ribosomes en favorisant la libération du facteur d&#39;initiation eucaryote 6 à partir de la surface de la sous - unité 60S du ribosome 8. La protéine SBDS est muté dans la maladie connue sous le nom maladie de shwachman 9 et agit comme un facteur d&#39;échange de nucléotide guanine pour EFL1 diminuant son affinité pour le guanosine diphosphate 10,11. mutations de la maladie dans SBDS abolissent l&#39;interaction avec EFL1 et empêchent ainsi son activation. L&#39;anisotropie de fluorescence est couramment utilisé dans des applications biologiques pour étudier les interactions protéine-acide nucléique-protéine ou un peptide. Elle est basée sur le principe selon lequel un fluorophore excité avec les résultats de la lumière polarisée dans une émission polarisée partiellement. L&#39;anisotropie de fluorescence est définie par l&#39;équation 1: <img alt="équation1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> où je VV et je VH sont laintensités de fluorescence de la verticale (VV) et horizontalement (VH) polarisés émission lorsque l&#39;échantillon est excité par la lumière polarisée verticalement 12. L&#39;anisotropie de fluorescence est sensible à des facteurs qui affectent la vitesse de diffusion du fluorophore de rotation et dépend de la température, la viscosité de la solution et la taille moléculaire apparent du fluorophore ainsi. La taille apparente d&#39;une protéine contenant un fluorophore augmente quand il interagit avec une autre protéine et un tel changement peut alors être évalué en tant que changement dans l&#39;anisotropie. Plus précisément, un fluorophore qui tourne lentement dans la solution par rapport à sa durée de vie de fluorescence aura une grande valeur I VV et une petite valeur I VH et ne seront donc présenter une anisotropie relativement importante. Pour fluorophores qui dégringolent rapidement par rapport à leur durée de vie de fluorescence, je VV et je VH serai semblable et leur valeur d&#39;anisotropie sera faible 12 </sup&gt; (Figure 1). En outre, pour un bon signal d&#39;anisotropie à la mesure du bruit, il est nécessaire d&#39;avoir un fluorophore avec une durée de vie de fluorescence similaire au temps de corrélation de rotation de la molécule d&#39;intérêt. Dans le cas contraire, il est impossible d&#39;enregistrer avec précision la différence entre l&#39;anisotropie de la protéine libre et que, dans le complexe. Par exemple, l&#39;anisotropie d&#39;une sonde fluorescente à une durée de vie proche de 4 nsec tels que la fluorescéine ou la rhodamine attachés à un composé de faible masse moléculaire de 100 Da est de 0,05. La liaison à une molécule de 160 kDa va augmenter sa valeur d&#39;anisotropie à 0,29; une différence qui peut être mesuré avec précision. En revanche, la même sonde fluorescente impliquée dans une réaction de liaison dont l&#39;augmentation de la taille moléculaire varie de 65 à 1000 kDa ne permettra d&#39;obtenir un changement d&#39;anisotropie de 0,28 à 0,3, ce qui est trop faible pour être mesurée avec précision. Dans ce scénario, une sonde avec une durée de vie de 400 nanosecondes serait plus approprié 12. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique de l&#39;équipement utilisé pour mesurer l&#39; anisotropie de fluorescence et de la procédure. Représentation schématique de l&#39;équipement utilisé pour effectuer une anisotropie de fluorescence expérience d&#39;interaction protéine-protéine de mesure. Fluorophores qui dégringolent rapide petit écran anisotropie qui augmente lors de la liaison à un partenaire d&#39;interaction. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> les applications de fluorescence nécessitent la présence d&#39;un fluorophore dans une quelconque des molécules étudiées. Pour étudier les interactions protéine-protéine, il existe trois types de fluorophores: 1) les résidus tryptophane présents dans les protéines, 2) des fluorophores attachés chimiquement et 3) les partenaires de fusion fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses derivatives. La plupart des protéines ont des résidus de tryptophane dans sa structure, donc la meilleure façon de mesurer l&#39;interaction est en surveillant les changements dans les spectres de fluorescence correspondants ou par la surveillance des changements dans l&#39;intensité de fluorescence des résidus tryptophane. Cependant, les résidus tryptophane peuvent être présents dans les deux protéines qui compliquent l&#39;analyse. D&#39;autre part, pour un fluorophore pour modifier ses propriétés de fluorescence due à une interaction dont il a besoin d&#39;être situé sur ou à proximité du site de liaison et il pourrait interférer avec l&#39;interaction elle-même. Cela nécessite une attention particulière lors de l&#39;utilisation de fluorophores volumineux tels que la GFP. Si aucune de ces fluorophores peut être utilisé pour des études de liaison, il est donc nécessaire d&#39;introduire des fluorophores extrinsèques à l&#39;une des protéines impliquées. De nombreux fluorophores synthétisés chimiquement existent et peuvent être fixés de manière covalente à des protéines par l&#39;intermédiaire de leurs groupes réactifs tels que les groupes amine (chaîne latérale de résidus lysine ou N-terminale) et les groupes thiol dans la cystéine. Fles dérivés de luorophore avec de l&#39; isothiocyanate et des esters de succinimidyle réagissent avec des groupes amide tandis que l&#39; iodoacétamide et le maléimide sont des groupes thiol réactifs 13. Les colorants les plus courants utilisés dans les applications de fluorescence sont des dérivés de la fluorescéine et les colorants verts rhodamine, les coumarines, les fluorophores BODIPY et colorants Alexa Fluor. Une liste détaillée des fluorophores disponibles dans le commerce et leur utilisation peut être trouvé dans les références 14,15. Pour le marquage avec succès, le groupe réactif doit être exposée sur la surface de la protéine, mais en raison du grand nombre de groupes fonctionnels réactifs présents dans les polypeptides en général, il est très difficile d&#39;obtenir une modification spécifique d&#39;un site. La protéine d&#39;intérêt dans cette étude, SBDS, contient 5 cysteines libres et 33 lysines qui peuvent résulter dans l&#39;étiquetage des sites multiples. étiquetage non uniforme peut affecter la liaison et va compliquer l&#39;analyse des données différentes molécules fluorophores peuvent provoquer différents signaux d&#39;intensité fluorescente lors de la liaison. Pour overcome ce problème, nous avons utilisé le fluorophore FlAsH, 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine à l&#39;étiquette du site directement la protéine SBDS. Ceci est un colorant arsenoxide avec une forte affinité pour les quatre cysteines espacées dans un motif connu sous Flash tag comprenant le CCXXCC de séquence où X est un acide aminé autre que la cystéine 16,17. Ce motif tétracystéine est ajouté à l&#39;extrémité N- ou C-terminale de la protéine par génie génétique conjointement avec un agent de liaison approprié pour empêcher la rupture du pli général de la protéine. La paire composée de FlAsH colorant et FlAsH-tag a été initialement conçu pour les protéines d&#39;étiquettes spécifiques au site dans les cellules 17 vivant , mais il peut aussi être utilisé pour marquer des protéines purifiées in vitro comme il est illustré ici. En outre, les stratégies enzymatiques ont également été mis au point pour permettre la fonctionnalisation spécifique au site des protéines 18. Dans ce manuscrit, nous décrivons l&#39;utilité de l&#39;anisotropie de fluorescence d&#39;unoutil sa pour étudier les interactions protéine-protéine. Reliure peut être évaluée par une simple inspection de la forme de liaison de la courbe tandis que l&#39;information quantitative peut être obtenue à partir de l&#39;ajustement des données expérimentales.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Perles de verre</td><td>Biospec Produits</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td> ultra pur <td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>colorant 4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Ce kit contient le colorant pour étiqueter un tag FlAsH</td></tr><tr><td>Ampiciline</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose anhydre</td><td>pour le</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Galactose</td><td>pour le moyen</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>pour</td> le <td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>le L-tryptofan.</td><td>Formedium</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de bézamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Chlorure</td></tr><tr><td>de magnésium Imidazole Sigma-Aldrich</td><td></td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Phosphate de potassium dibasique</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Phosphate de sodium monobasique</td></tr><tr><td>Base azotée de levure sans acides aminés</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Micro granulé</td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate</td> <td>d’adénineFormedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp ; Filtre à membrane kDa</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Filtre à membrane, esters de cellulose mixtes, hydrophile, 0,22 et micro ; m, 47&nbsp ; mm, blanc, uni</td></tr><tr><td>Ni2+ colonne d’affinité</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Cartouche pré-remplie de 5&nbsp ; ml Ni-NTA Superflow</td></tr><tr><td>Strong Sulfopropyl cation cation exchanger</td> column <td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Colonne d’exclusion de taille</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Cellule de fluorescence</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Cary 60 Agitateur UV-Vis</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Plage de température de paillasse Ambiant-15&deg ; à 60&deg ; C</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Conductivité</td> du <td>système FPLC abandonné Moniteur UV-MM II P500</td></tr> Fraction de pompe <tr><td>Spectrofluorimètre</td><td>Olis</td><td>Non applicable</td><td>Olis DM 45 avec boîte à outils de polarisation</td></tr></tbody></table>

fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

interactions protéine-protéine jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement d&#39;un organisme vivant. Une fois que l&#39;interaction a été identifié et validé, il est nécessaire de caractériser au niveau structurel et mécaniste. Plusieurs méthodes biochimiques et biophysiques existent à cette fin. Parmi eux, l&#39;anisotropie de fluorescence est une technique puissante utilisée notamment lorsque l&#39;intensité de la fluorescence d&#39;une protéine marqué par un fluorophore reste constant lors d&#39;une interaction protéine-protéine. Dans cette technique, une protéine marqué par un fluorophore est excité avec une lumière polarisée verticalement, d&#39;une longueur d&#39;onde appropriée qui excite sélectivement un sous-ensemble des fluorophores en fonction de leur orientation par rapport au faisceau entrant. L&#39;émission résultant a également une directivité dont la relation dans les plans verticaux et horizontaux définit anisotropie (r) comme suit: r = (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), où je VV et je <sub&gt; VH sont les intensités de fluorescence des composantes verticales et horizontales, respectivement. L&#39;anisotropie de fluorescence est sensible à la diffusion d&#39;un fluorophore, à savoir la taille moléculaire apparente d&#39;un fluorophore attaché à une protéine, qui est modifiée lors de l&#39;interaction protéine-protéine de rotation. Dans le présent texte, l&#39;utilisation de l&#39;anisotropie de fluorescence comme un outil pour étudier les interactions protéine-protéine a été illustrée pour traiter la liaison entre la protéine mutée dans le syndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) et le facteur de Allongement like-1 GTPase (EFL1). De façon classique, le marquage d&#39;une protéine avec un fluorophore est réalisée sur les groupes thiol (cystéine) ou dans les groupes amino (extrémité N-terminale amine ou lysine) de la protéine. Cependant, SBDS possède plusieurs cysteines et lysines qui ne permettent pas le site d&#39;étiquetage dirigé de celui-ci. Comme alternative, le colorant 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine a été utilisé pour marquer spécifiquement un motif tétracystéine, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys modifié par génie génétique dans l&#39;extrémité C-terminale de la protéine recombinante SBDS. Montage des données expérimentales ont fourni des informations quantitatives et mécaniste sur le mode de liaison entre ces protéines.

Pour effectuer toutes les expériences d&#39;anisotropie, il est important d&#39;éliminer les fortes variations dans l&#39;intensité de fluorescence du fluorophore étant donné que l&#39;anisotropie observée d&#39;un mélange d&#39;espèces est représenté par l&#39;équation 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> où F i re...

Les interactions protéiques sont au cœur de la fonction d&#39;une cellule. techniques calorimétriques et spectroscopiques sont couramment utilisés pour les caractériser. Nous décrivons ici anisotropie de fluorescence comme un outil pour étudier l&#39;interaction entre la protéine mutée dans le syndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) et le facteur Allongement-like 1 GTPase (EFL1).

Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

L'objectif général de cette expérience est d'évaluer et de quantifier l'interaction entre deux protéines d'intérêt à l'aide de l'anisotropie de fluorescence. Ces mesures peuvent aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biochimie et de la biophysique des protéines, notamment concernant les protéines dont les interactions sont importantes pour la fonction cellulaire.Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir des informations quantitatives et qualitatives sur l'interaction entre protéines. Pour préparer la protéine SBDS-FlAsH purifiée, préparez d'abord un litre de milieu liquide LB supplémenté en ampicilline à 100 microgrammes par millilitre. Incubez-y les bactéries transformées à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,5 à 0,7.Induire l'expression de la protéine SBDS-FlAsH en ajoutant 0,5 millimolaire d'IPTG à la culture et poursuivre l'incubation pendant cinq heures supplémentaires. Ensuite, récupérer la suspension bactérienne par centrifugation à 3800 ×g pendant dix minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant.Resuspendre les cellules dans 35 millilitres de tampon de lyse SBDS supplémenté avec un millimolaire de PMSF. Lysat par sonication pendant un temps total de quatre minutes en utilisant des cycles de dix secondes activés et 30 secondes désactivés à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifuger l'échantillon à 9 000 ×g pendant 50 minutes à quatre degrés Celsius.Conservez le surnageant et jetez le culot pour éliminer les débris cellulaires. Après avoir équilibré la colonne d'affinité au nickel avec trois volumes de colonne de tampon de lyse SBDS, appliquez l'ensemble du surnageant clarifié sur la colonne. Éliminez les protéines non liées en lavant avec trois volumes de colonne de tampon de lyse SBDS.Après le lavage de la colonne, éluer la protéine liée avec trois volumes de colonne de tampon d'élution SBDS. Pour purifier davantage la protéine, équilibrer la colonne échangeuse de cations sulfopropyle avec trois volumes de colonne de tampon S à faible concentration saline. Diluer la protéine six fois avec un tampon phosphate 50 millimolaire, pH 6,5, puis l'appliquer sur la colonne.Lavez les matériaux non liés avec trois volumes de colonne de tampon S à faible concentration saline. Ensuite, éluerez la protéine en une seule étape en ajoutant sur la colonne du tampon phosphate 50 millimolaire, pH 6,5, contenant un molaire de chlorure de sodium. Diluez l'éluat au tiers avec du tampon phosphate 50 millimolaire, pH 6,5.Ensuite, concentrer la protéine à l'aide de dispositifs de filtration ultra-concentrative par centrifugation à 3800 × g pendant quinze minutes. La qualité des protéines utilisées dans ce type d'expérience est très importante. L'interprétation des données devient compliquée si les échantillons de protéines utilisés ne sont pas d'une haute pureté.Vérifiez la pureté de la protéine SBDS-FlAsH par analyse SDS-PAGE et coloration au Coomassie. Congelez rapidement la protéine à l'azote liquide et stockez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure. Pour préparer la protéine EFL1 purifiée, commencez par cultiver la levure transformée à 30 degrés Celsius dans un litre de milieu synthétique de privation sans uracile, supplémenté avec 0,5 pour cent de glucose, jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 1,8.Induire l'expression protéique en ajoutant 2,8 pour cent de galactose à la culture et poursuivre l'incubation pendant 18 heures à 30 degrés Celsius. Récupérer la suspension de levure par centrifugation à 3800 ×g pendant dix minutes à 4 degrés Celsius. Éliminer le surnageant après la centrifugation.Resuspendre les cellules dans 50 millilitres de tampon de lyse EFL1 supplémenté avec un millimolaire de PMSF et un millimolaire de benzamidine. Rompre les cellules par friction sur un broyeur à billes en utilisant des billes de verre pendant une durée totale de six minutes selon des cycles de deux minutes de traitement suivis de quinze minutes d'arrêt à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifuger l'échantillon à 9 000 ×g pendant 50 minutes à quatre degrés Celsius.Conservez le surnageant et éliminez le culot pour éliminer les débris cellulaires. Ensuite, équilibrez la colonne d'affinité au nickel avec trois volumes de colonne de tampon de lyse EFL1. Appliquez tout le surnageant clarifié sur la colonne équilibrée.Après avoir éliminé les protéines non liées en lavant la colonne avec trois volumes de colonne de tampon de lyse EFL1, éluer la protéine liée avec trois volumes de colonne de tampon d'élution EFL1. Pour purifier davantage la protéine EFL1, équilibrer la colonne de chromatographie d'exclusion stérique avec 1,5 volume de colonne de tampon d'anisotropie. Concentrer la protéine EFL1 élue de la colonne d'affinité au nickel jusqu'à un millilitre à l'aide de dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation à 3800 × g. Ensuite, charger l'échantillon concentré sur la colonne de chromatographie d'exclusion stérique.Recueillir la protéine éluée et la concentrer par ultrafiltration jusqu'à une concentration finale d'environ 30 micromolaire. Vérifier la pureté de la protéine EFL1 par analyse en SDS-PAGE et coloration au Comassie. Congeler rapidement la protéine dans de l'azote liquide et la conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure.Mélangez trois nanomoles de la protéine SBDS-FlAsH avec trois nanomoles de la teinture lumio verte dans un volume de cinq micromètres d’un tampon d’anisotropie. Laissez la réaction se dérouler pendant huit heures à quatre degrés Celsius. Après huit heures, dialysez l’échantillon contre le tampon d’anisotropie toute la nuit pour éliminer la teinture libre.Mesurez les absorbances à 280 nanomètres et à 508 nanomètres dans un spectrophotomètre en utilisant une cuvette en quartz. Ensuite, utilisez la loi de Lambert-Beer pour quantifier le pourcentage de protéine marquée, comme décrit dans le protocole textuel. Avant de mesurer la valeur d'anisotropie, chaque étape de filtration à partir de la solution protéique doit être effectuée soigneusement, en veillant à ce que tout l'échantillon soit dispensé dans la solution et devienne homogène.Dans une cuvette de fluorescence, placer 200 microlitres de SBDS-FlAsH à 30 nanomolaire dans un tampon d'anisotropie et effectuer un titrage avec 2 microlitres d'EFL1 à 30 micromolaire. Mélanger soigneusement, puis laisser la réaction reposer pendant trois minutes avant de mesurer les valeurs d'anisotropie et de fluorescence. Répéter ce processus jusqu'à ce qu'un volume total de 40 microlitres d'EFL1 ait été ajouté.Comme étape finale, ajuster les données à un modèle de liaison présupposé, tel que décrit dans le protocole textuel. Pour réaliser toute expérience d'anisotropie, il est important d'exclure de grands changements de l'intensité de fluorescence. Comme illustré ici, l'intensité de fluorescence de SBDS-FlAsH ne change pas de manière notable lors de la liaison à EFL1.La titration de l'EFL1 dans une cuvette en quartz contenant le SBDS-FlAsH entraîne une augmentation de l'anisotropie initialement observée. Plusieurs ajouts d'EFL1 permettent de tracer la courbe de liaison correspondante, qui peut être ajustée par régression non linéaire des moindres carrés à un modèle de liaison supposé. Dans ce cas, un modèle à un seul site de liaison ne décrit pas adéquatement les données expérimentales.En revanche, un modèle à deux sites de liaison non identiques décrit correctement les données expérimentales. Une fois maîtrisée, l'expérience de liaison par anisotropie de fluorescence peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de disposer de protéine purifiée en grandes quantités.Parallèlement à cette procédure, d'autres méthodes telles que le test de complémentation basé sur des fragments ou l'anisotropie de fluorescence avec différents domaines de la protéine étudiée peuvent être réalisées afin de valider le modèle de liaison approprié. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une expérience de liaison suivie d'une mesure d'anisotropie de fluorescence.

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