Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

L'objectif général de cette expérience est d'isoler des cellules dendritiques plasmacytoïdes, ou PDC, avec une grande pureté à partir de la moelle osseuse de souris prédisposées au lupus afin d'étudier leurs fonctions. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés relatives aux caractéristiques d'une population cellulaire immunitaire particulière, comme les PDC productrices d'interféron alpha au stade avancé du développement du lupus. Le principal avantage de cette technique est qu'une à plusieurs populations cibles peuvent être enrichies avec une pureté supérieure à celle obtenue par tri magnétique à billes.

Après la récolte, transférez les os des membres postérieurs et quatre millilitres de milieu complet dans un mortier. Ajoutez six millilitres de milieu complet frais afin d'obtenir un volume total de 10 millilitres. Puis broyez délicatement les os à l’aide d’un pilon.

Agiter doucement le pilon pour libérer la moelle osseuse. Ensuite, transférer tout le milieu à travers un tamis de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres placé sur de la glace. Ajouter 10 millilitres de milieu complet frais au mortier.

Et filtrer le surnageant deux fois supplémentaires jusqu'à ce que les os apparaissent blancs. Ensuite, centrifuger les cellules de la moelle osseuse et resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu complet frais. Puis, déposer délicatement les cellules sur 5 millilitres de milieu de gradient de densité fraîchement préparé dans un tube conique de 15 millilitres, en prenant soin de ne pas perturber les couches.

Et séparer les cellules par centrifugation. Ensuite, retirer soigneusement les huit millilitres supérieurs de la solution, et recueillir la couche blanche de deux millilitres située à l'interface. Ajouter 12 millilitres de milieu complet glacé aux cellules mononucléées isolées, puis boucher le tube et mélanger par retournement.

Ensuite, former un culot cellulaire par centrifugation. Pour colorer les cellules en vue de la cytométrie en flux, les resuspendre dans 100 microlitres d'anticorps bloquant CD1632FC à quatre degrés Celsius. Après 10 minutes, laver les cellules dans quatre millilitres de tampon de tri glacé et marquer les cellules avec 100 microlitres du mélange d'anticorps approprié pour la coloration de surface cellulaire.

Pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius à l’obscur. Laver les cellules dans quatre millilitres de tampon de tri glacé pour éliminer tout anticorps conjugué à une fluorochrome non lié. Ensuite, reprendre le culot dans 500 microlitres de solution de chargement FACS et transférer l’échantillon dans un tube FACS placé sur de la glace.

Pour colorer les témoins de compensation, aliquoter un fois 10 à la puissance six splénocytes par tube. Laver les cellules avec quatre millilitres de tampon de tri et reprendre les culots dans 100 microlitres de tampon de tri. Ensuite, ajouter l'anticorps conjugué à la fluorescence approprié provenant du cocktail maître d'anticorps dirigés contre les antigènes de surface cellulaire à chaque tube de compensation correspondant, puis agiter les tubes pour homogénéiser.

Après 15 minutes à l'obscurité, à quatre degrés Celsius, laver tous les échantillons avec du tampon de tri et re-suspendre les culots dans 500 microlitres de tampon de tri glacé. À l'exception du tube DAPI, qui est re-suspendu dans 500 microlitres de solution de chargement FACS. Pour purifier la population cellulaire cible par tri cellulaire activé par fluorescence, charger des tubes de collecte contenant 500 microlitres de FBS supplémentés avec des antibiotiques sous les valves de tri.

Ensuite, chargez le tube non coloré et collectez 10 000 événements pour définir le seuil négatif pour chaque intensité fluorescente. Et 10 000 événements dans les tubes de compensation monocoloration pour définir le seuil positif pour chaque intensité fluorescente. Collectez 3 000 événements à partir de l'échantillon expérimental pour définir les seuils de la population cellulaire triée.

Utiliser les intensités de fluorescence comme paramètres des axes X et Y du graphique pour délimiter manuellement la population cellulaire cible. Ensuite, trier la population cellulaire cible dans le tube de collecte. À la fin du tri, ajouter jusqu'à quatre millilitres de milieu complet glacé aux cellules.

Ensuite, fermer le tube et mélanger les cellules par retournement. Récupérer les cellules purifiées par centrifugation, en aspirant tout sauf les derniers 200 microlitres du surnageant. Puis, resuspendre le culot dans un millilitre de milieu complet glacé et transférer les cellules dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre pour une seconde centrifugation.

Enfin, aspirez tout le surnageant sauf les derniers 100 microlitres et conservez la population cellulaire triée sur glace jusqu'à utilisation. Le tri cellulaire activé par aimant de cellules dendritiques plasmacytoïdes de moelle osseuse provenant de souris prédisposées au lupus donne une pureté de seulement 7,75 % après enrichissement. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes enrichies par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), en revanche, présentent une pureté pouvant atteindre 96,4 % après tri.

Pour garantir une haute pureté, les cellules mononucléées de la moelle osseuse sont d'abord sélectionnées et séparées des débris à l'aide des paramètres de diffusion avant et latérale. En utilisant la largeur de diffusion avant par rapport à la hauteur de diffusion avant et la largeur de diffusion latérale par rapport à la hauteur de diffusion latérale, les cellules uniques sont davantage sélectionnées afin d'éviter les signaux faussement positifs produits par les agrégats. Les cellules uniques vivantes négatives pour le DAPI sont ensuite sélectionnées selon leur expression membranaire positive pour CD11c et négative pour CD11B, permettant ainsi une sélection supplémentaire de la population cible de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse positives pour B220 et PDCA-1.

La population de PDC triée est non seulement d'une pureté élevée, mais également fonctionnellement normale, avec la capacité de produire de l'IFNalpha après une stimulation par CPG in vitro. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien broyer les os et d'agiter doucement la moelle osseuse libérée afin de préserver la viabilité cellulaire. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage de l'ARN ou la culture et la stimulation in vitro peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant l'expression génique ou la fonction des populations cellulaires enrichies.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en PDC pour explorer le rôle de cette cellule puissante dans le développement du lupus et des modèles murins prédisposés au lupus. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler une population de PDC hautement purifiée à partir de la moelle osseuse de souris prédisposées au lupus.