Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

L’objectif global de cette expérience est d’isoler des cellules dendritiques plasmacytoïdes, ou PDC, d’une grande pureté dans la moelle osseuse de souris sujettes au lupus pour l’étude de leur fonction. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées aux caractéristiques d’une population de cellules immunitaires particulière, telles que la production d’interféron alpha PDC au cours de la phase tardive du développement du lupus. Le principal avantage de cette technique est qu’une à plusieurs populations cibles peuvent être enrichies à une pureté supérieure à celle du tri par billes magnétiques.

Après la récolte, transférez les os des membres postérieurs et quatre millilitres de milieu complet dans un mortier. Ajoutez six millilitres de milieu complet frais pour porter le volume total à 10 millilitres. Et cassez doucement les os avec un pilon.

Remuez doucement le pilon pour libérer la moelle osseuse. Ensuite, transférez tout le fluide à travers une passoire de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Ajouter 10 millilitres de milieu complet frais au mortier.

Et filtrez le surnageant deux fois de plus jusqu’à ce que les os apparaissent blancs. Ensuite, centrifugez les cellules de la moelle osseuse et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu complet frais. Ensuite, superposez les cellules sur cinq millilitres de milieu à gradient de densité fraîchement préparé dans un tube conique de 15 millilitres, en prenant soin de ne pas perturber les couches.

Et séparez les cellules par centrifugation. Ensuite, retirez soigneusement les huit premiers millilitres de la solution et récupérez les deux millilitres de couche leucocytaire à l’interphase. Ajoutez 12 millilitres de milieu complet glacé aux cellules mononucléées isolées et bouchez le tube pour le mélanger par inversion.

Ensuite, granulez les cellules par centrifugation. Pour colorer les cellules pour le FACS, mettez-les en suspension dans 100 microlitres d’anticorps bloquant CD1632FC à quatre degrés Celsius. Après 10 minutes, lavez les cellules dans quatre millilitres de tampon de tri à froid glacé et étiquetez les cellules avec 100 microlitres du cocktail d’anticorps de coloration de surface cellulaire approprié.

Pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Lavez les cellules dans quatre millilitres de tampon de tri à froid glacé pour éliminer tout anticorps conjugué à fluorescence non lié. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de solution de chargement FACS et transférez l’échantillon dans un tube FACS sur de la glace.

Pour colorer les contrôles de compensation, aliquote une fois 10 à six splénocytes par tube. Lavez les cellules avec quatre millilitres de tampon de tri et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de tampon de tri. Ensuite, ajoutez l’anticorps conjugué à fluorescence approprié du cocktail d’anticorps de surface de la cellule mère dans chaque tube de compensation correspondant et agitez les tubes pour mélanger.

Après 15 minutes dans l’obscurité, à quatre degrés Celsius, lavez tous les échantillons avec un tampon de tri et remettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de tampon de tri glacé. À l’exception du tube DAPI, qui est remis en suspension dans 500 microlitres de solution de chargement FACS. Pour purifier la population cellulaire cible par tri cellulaire activé par fluorescence, chargez des tubes de collecte contenant 500 microlitres de FBS complétés par des antibiotiques sous les vannes de tri.

Ensuite, chargez le tube non coloré et collectez 10 000 événements pour régler la porte négative pour chaque intensité fluorescente. Et 10 000 événements dans les tubes de compensation de coloration unique pour régler la porte positive pour chaque intensité fluorescente. Collectez 3 000 événements de l’échantillon expérimental pour définir les portes de la population cellulaire triée.

Utiliser les intensités de fluorescence comme paramètres du graphique d’accès X et Y pour contrôler manuellement la population de cellules cibles. Ensuite, triez la population cellulaire cible dans le tube de collecte. À la fin du tri, ajoutez jusqu’à quatre millilitres de milieu complet de glace cole dans les cellules.

Ensuite, bouchez le tube et mélangez les cellules par inversion. Granulez les cellules purifiées par centrifugation, en aspirant tous les microlitres du surnageant, sauf les 200 derniers litres. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet glacé et transférez les cellules dans un microtube de centrifugation de 1,5 millilitre pour une deuxième centrifugation.

Enfin, aspirez tous les microlitres du surnageant, sauf les 100 derniers, et stockez la population cellulaire triée sur de la glace jusqu’à utilisation. Le tri cellulaire activé magnétique des cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris sujettes au lupus n’aboutit qu’à une pureté de 7,75 % après l’enrichissement. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes enrichies en FACS présentent toutefois une pureté aussi élevée que 96,4 % après le tri.

Pour garantir une grande pureté, les cellules mononucléaires de la moelle osseuse sont d’abord fermées et séparées des débris par des paramètres de diffusion directe et latérale. En utilisant la largeur de diffusion vers l’avant en fonction de la hauteur de diffusion vers l’avant et la largeur de diffusion latérale en fonction de la hauteur de diffusion latérale, les cellules individuelles sont en outre fermées pour éviter les signaux faussement positifs produits par les agrégats. Les cellules DAPI DAPI simples vivantes sont ensuite contrôlées par leur expression de surface cellulaire CD11c positive et CD11B négative, ce qui permet une stimulation supplémentaire de la population de cellules dendritiques plasmacytoïdes plasmacytoïdes de la moelle osseuse cible B220 positive et PDCA-1.

La population de CPD triée est non seulement d’une grande pureté, mais aussi fonctionnellement normale avec la capacité de produire de l’IFNalpha lors d’une stimulation CPG in vitro. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de fissurer les os et de remuer doucement la moelle osseuse libérée pour préserver la viabilité cellulaire. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que le séquençage de l’ARN ou la culture et la stimulation in vitro, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’expression génique ou la fonction des populations cellulaires enrichies.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs de PDC pour explorer le rôle de cette cellule puissante dans le développement du lupus et des modèles murins sujets au lupus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une population de PDC hautement purifiée de la moelle osseuse de souris sujettes au lupus.