Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation
21 décembre 2016
Nous proposons un protocole de reprogrammation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en cellules souches pluripotentes induites (iPSC). En plaquant les cellules sanguines transduites sur des plaques recouvertes de matrice avec centrifugation, les iPSC sont induites avec succès à partir de cellules flottantes. Cette technique suggère un protocole de reprogrammation simple et efficace pour des cellules telles que les PBMC et les CBMC.
L’objectif global de cette étude est de reprogrammer les cellules mononucléées du sang périphérique en cellules souches pluripotentes induites, en utilisant le placage en série par centrifugation. À l’origine, les iPSC étaient générées par la reprogrammation des fibroblastes. Aujourd’hui, divers sont utilisés pour la reprogrammation.
Cependant, en raison de l’accessibilité du sang, les PBMC peuvent être une source cellulaire non acceptée pour l’application ultérieure des iPSC, dans le criblage de médicaments, la modélisation de thèses et le développement de la médecine régénérative. Dans le cadre de l’étude, nous partagerons un protocole sur la reprogrammation des iPSC à l’aide de PBMC en ajoutant de la force centrifuge. Ce protocole offrira une autre option lors de la reprogrammation des cellules flottantes.
Pour faire la démonstration de la procédure, nous utiliserons Nam, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour isoler les cellules monocytaires, prélevez d’abord au moins dix millilitres de sang frais à partir d’une prise de sang dans un tube de préparation cellulaire. Ensuite, transférez le sang dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et diluez-le avec du PBS stérile dans un rapport de un à quatre.
Ensuite, ajoutez dix millilitres de milieu à gradient de densité dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et superposez soigneusement le sang dilué sur le milieu à gradient de densité. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 750 fois g pendant 30 minutes à température ambiante, sans rupture de centrifugation. Après 30 minutes, transférez soigneusement la couche leucocytaire dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.
Ajoutez 30 millilitres de PBS et lavez les cellules. Ensuite, centrifugez les cellules à 515 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le PBS et mettez les cellules en suspension dans 0,5 millilitre de milieu cellulaire sanguin.
Ensuite, comptez les cellules et placez-les dans une plaque à 24 puits. Ajoutez du PBS aux puits environnants pour éviter l’évaporation. Ensuite, stabilisez les cellules pendant cinq jours à 37 degrés Celsius avant la transduction.
Ajoutez en outre 0,5 millilitre de milieu cellulaire sanguin frais le troisième au quatrième jour, sans perturber les cellules. Dans cette procédure, transférez les cellules sanguines dans un tube conique de 15 millilitres et comptez-les à l’aide d’un hémacytomètre. Ensuite, préparez trois fois dix à cinquième cellules pour la transduction, et centrifugez les cellules à 515 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, jetez le surnageant par aspiration et remettez les cellules en suspension dans 0,5 millilitre de milieu cellulaire sanguin. Ensuite, transférez les cellules dans un puits d’une plaque non revêtue de 24 puits. Décongelez le mélange de virus Sendai dans de la glace et ajoutez-le aux cellules en suspension.
Scellez la plaque avec un film d’étanchéité et centrifugez-la à 1, 150 fois g pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius. Après la centrifugation, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Pour enduire une plaque de 24 puits de vitronectine, le lendemain, diluez la solution de vitronectine dans du PBS pour obtenir une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre.
Ensuite, ajoutez un millilitre de vitronectine dans un puits et incubez-le à température ambiante, pendant au moins une heure. Ensuite, retirez la solution d’enrobage et transférez tous les milieux contenant les cellules et le virus dans le puits enrobé. Ensuite, collectez les cellules restantes avec 0,5 millilitre supplémentaire de milieu de cellules sanguines fraîches et ajoutez-les dans le puits contenant les cellules.
Ensuite, centrifugez la plaque à 1, 150 fois g pendant dix minutes à 35 degrés Celsius, puis maintenez les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Pour le transfert de la deuxième cellule, enduisez le puits de cinq microgrammes par millilitre de vitronectine comme décrit précédemment. Utilisez un puits de la plaque pour chaque transduction et transférez la suspension cellulaire de la première plaque à la plaque de vitronectine nouvellement enrobée.
Pendant ce temps, ajoutez un millilitre de média iPSC dans un puits de la première plaque pour l’entretien, et incubez-le à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone, avec un changement quotidien de média avec des milieux iPSC frais. Les colonies apparaîtront du jour 14 au 21, après la transduction. Centrifugez la plaque nouvellement revêtue, contenant les cellules en suspension, à 1 150 fois g à 35 degrés Celsius pendant dix minutes.
Après la centrifugation, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit. Le lendemain, retirez le surnageant et remplacez-le par un milieu de cellules souches pluripotentes induites fraîches. Maintenez les cellules attachées avec un changement de milieu quotidien, jusqu’à ce que la confluence de 80 % soit atteinte.
Une semaine avant la cueillette de la colonie, ensemencez une fois dix à la quatrième cellules dans une boîte de 100 millimètres enrobée de vitronectine. Ensuite, préparez un plat de 60 millimètres enrobé de vitronectine, en ajoutant deux millilitres de solution de vitronectine, et incubez-le à température ambiante pendant au moins une heure. En observant au microscope, marquez les colonies au bas de la plaque avec des limites claires à l’aide d’un marqueur.
Retirez la solution de vitronectine de la nouvelle plaque et ajoutez six millilitres de milieu de cellules souches pluripotentes induites, complétées par dix millimolaires de RHO kinase. Ensuite, retirez le milieu de culture des cellules et lavez-les avec trois millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de détachement de colonies iPSC et incubez-les pendant 30 secondes à température ambiante.
Après cela, retirez la solution de la plaque et incubez-la à température ambiante pendant 30 secondes supplémentaires. Après 30 minutes, prélevez 200 microlitres de milieu de la plaque et détachez les colonies ciblées par pipetage. Ensuite, transférez les colonies dispersées dans une nouvelle parabole de 60 millimètres.
Incuber et maintenir les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles atteignent le passage dix. Au stade précoce de la reprogrammation, les iPSC ont été mélangées aux cellules différenciées non reprogrammées attachées. Avant l’expansion, les iPSC et les autres cellules étaient différentes à discriminer.
En ensemencant les cellules dans une faible densité, on a obtenu des colonies suffisamment grandes pour être cueillies. Après avoir isolé la colonie, les amas de cellules ont été dissociés en cellules uniques et en culture. Des colonies d’iPSC pures ont été observées par la suite.
Après l’expansion des cellules souches pluripotentes induites pures, la qualité des cellules a été testée. Les cellules ont été colorées à la phosphatase alcaline pour confirmer l’état indifférencié des cellules souches pluripotentes induites. Les colonies dérivées des cellules souches pluripotentes induites isolées ont toutes montré une coloration positive.
Les marqueurs pluripotents ont été confirmés par coloration immunofluorescente. Les cellules ont reprogrammé des marqueurs pluripotents hautement exprimés, tels que SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4, et surtout, TRA-1-60, l’expression des marqueurs pluripotents a été confirmée par RTPCR. En utilisant le placage en série par centrifugation, la fixation du transit utilise PBMC sur une plaque revêtue métrique.
Les attaches y sont comme suspendues, et les colonies d’iPSC sont répétées pour une purification. À l’aide de ce protocole, les iPSC peuvent être générés à partir de PBMC en un mois. Ce protocole réduit le temps nécessaire à la fixation des cellules transduites et évite la perte de cellules reprogrammées qui n’étaient pas en mesure de se fixer par elles-mêmes.
Cependant, la purification des iPSC formant des colonies entièrement reprogrammées peut être critique lors de cette procédure. Auparavant, nous avons reprogrammé avec succès des PBMC et des cellules mononucléées à l’aide de ce protocole. Les iPC dérivés de cellules sanguines peuvent être largement utilisés dans divers domaines de recherche.
Ce protocole peut aider au processus de reprogrammation d’autres types de cellules en suspension flottantes, pour d’autres applications et études.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole permettant de reprogrammer des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs) en cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) à l'aide de la centrifugation. La méthode améliore l'accessibilité des PBMCs comme source viable d'iPSCs, qui peuvent être utilisées dans diverses applications telles que le criblage de médicaments et la médecine régénérative.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Reprogrammation cellulaire
- Médecine régénérative
Contexte
- Les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) ont été initialement générées à partir de fibroblastes.
- Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs) constituent une source cellulaire plus accessible.
- Les iPSCs présentent des applications dans le criblage de médicaments et la modélisation des maladies.
- Les méthodes actuelles de reprogrammation des PBMCs sont limitées.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole simple et efficace pour reprogrammer les PBMCs en iPSCs.
- Utiliser la force centrifuge afin d'améliorer le processus de reprogrammation.
- Proposer une méthode alternative pour travailler avec des cellules en suspension.
Méthodes utilisées
- Reprogrammation de PBMC en iPSC.
- Ensemencement des cellules sanguines transduites dans des plaques revêtues de matrice.
- Application d'une centrifugation pour faciliter l'adhérence cellulaire.
- Induction d'iPSC à partir de cellules en suspension.
Résultats principaux
- Induction réussie de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en utilisant le protocole proposé.
- Démonstration de l'efficacité de la centrifugation dans le processus de reprogrammation.
- Potentiel d'applications plus larges des iPSC dérivées de PBMC.
- Mise à disposition d'une nouvelle option pour les chercheurs en biologie des cellules souches.
Conclusions
- Le protocole propose une approche simple pour reprogrammer les PBMC en iPSC.
- Cette méthode pourrait améliorer l'utilisation des PBMC dans diverses applications biomédicales.
- Des études supplémentaires pourraient élargir l'utilité de cette technique en médecine régénérative.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet une génération efficace de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique, offrant ainsi une source non invasive et facilement reproductible pour la modélisation des maladies et le criblage de médicaments. En exploitant la centrifugation pour améliorer l'adhérence cellulaire, il augmente l'efficacité du reprogrammation et réduit la perte cellulaire durant les premiers stades. La méthode soutient la validation de cibles thérapeutiques et le développement de modèles précliniques à l'aide de cellules dérivées de patients, accélérant ainsi la recherche translationnelle en médecine régénérative.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques à l'aide de cellules iPSC humaines génétiquement appariées, dérivées de sources sanguines accessibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit une source cellulaire renouvelable pour l'élucidation des voies biologiques et la validation fonctionnelle des cibles, sans prélèvements biopsiques invasifs.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des populations normalisées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pour des criblages de composés et des développements de tests phénotypiques cohérents.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à un ensemencement en série par centrifugation, réduisant la variabilité de l'attachement cellulaire et de l'efficacité du réprogrammation.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la modélisation liée aux maladies en produisant des cellules pluripotentes capables de se différencier en lignées pertinentes pour les tests de toxicité et d'efficacité des médicaments.
- Valeur opérationnelle : Permet l'expansion et le stockage à grande échelle de colonies de CIPs pour des études précliniques longitudinales et l'atténuation des risques liés au mécanisme d'action.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase initiale de découverte en fournissant une source fiable de cellules souches pluripotentes induites en amont, destinée à des applications en aval telles que la validation de cibles, le développement de tests et les essais précliniques.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses grâce à la génération de CIP spécifiques aux patients, qui conservent le fonds génétique du donneur, permettant ainsi des études mécanistiques.
- Criblage : Produit des colonies de CIP adhérentes et prolifératives, adaptées aux criblages à haut contenu et aux tests de réponse dose-dépendante après transduction et sélection.
- Analytique : Permet une évaluation quantitative de l'efficacité du réprogrammation à l’aide de paramètres de formation des colonies et de l’expression des marqueurs de pluripotence (par exemple, SSEA4, Oct4, TRA-1-60) pour des décisions d’aller ou de ne pas aller plus loin.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité entre la découverte et la validation préclinique en fournissant des cellules capables de se différencier pour des tests spécifiques aux tissus et pour la pharmacologie de sécurité.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable de génération de CIP pour plusieurs projets, réduisant la dépendance vis-à-vis du réprogrammation de fibroblastes et permettant des flux de travail parallèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en utilisant des iPSC d'origine humaine, génétiquement stables et reflétant la variabilité des patients.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité de la production d'iPSC grâce à des étapes définies de centrifugation et à un ensemencement sur matrices revêtues, réduisant ainsi la variabilité manuelle.
- Valeur stratégique : Réduit le risque biologique lors de l'identification des candidats prometteurs en permettant une détection précoce de phénotypes liés à la cible dans des contextes cellulaires humains.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en fournissant des lectures mécanistiques issues de modèles dérivés d'iPSC qui éclairent les décisions d'avancement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches, transduction virale et techniques de manipulation cellulaire basées sur la centrifugation.
- Dépend de l'accès à des centrifugeuses réfrigérées, des revêtements matriciels (par exemple, la vitronectine) et des milieux spécialisés pour le maintien des cellules sanguines et l'expansion des iPSC.
- Exige une standardisation entre les équipes concernant les forces g, les durées et les températures durant les étapes de repiquage en série afin d'assurer la reproductibilité.
- Implique des ajustements spécifiques lors de l'application à différentes sources de cellules dérivées du sang (par exemple, sang de cordon ombilical par rapport à sang périphérique) en raison de la variabilité de la viabilité cellulaire et de l'efficacité de transduction.
- Les limites pratiques incluent la nécessité d'une technique aseptique lors de multiples transferts, ainsi que la variabilité potentielle de l'efficacité de reprogrammation selon la qualité des cellules donneuses et leur historique de passages.
