Name: Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez la reprogrammation de cellules mononucléées du sang périphérique en cellules souches pluripotentes induites par centrifugation. Cette méthode efficace utilise le virus Sendai et facilite l'adhérence des cellules flottantes pour la médecine régénérative.

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Ce travail a été soutenu par une subvention du Programme de recherche en sciences fondamentales par l’intermédiaire de la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF), financée par le ministère des Sciences, des TIC et de la Planification future (2013R1A1A1076125).

Déclaration éthique: Ce protocole d&#39;étude a été approuvé par le comité d&#39;examen institutionnel de l&#39;Université catholique de Corée (KC12TISI0861). 1. Isolement des cellules monocytaires du sang <ol><li> Isolement des cellules monocytaires (Jour -5) <ol><li> Obtenir au moins 10 ml de sang frais à partir d&#39;un prélèvement de sang dans un tube de préparation de cellules (CPT). </li><li> Transférer le sang dans un nouveau tube conique de 50 ml et dilué avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à un ratio de 1: 4. REMARQUE: Un taux plus élevé de dilution peut être utilisé pour une plus grande pureté. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu à gradient de densité dans un nouveau tube conique de 50 ml et couche avec soin le sang dilué au-dessus du milieu de gradient de densité. Centrifuger à 750 g pendant 30 min à température ambiante (RT) sans frein de centrifugation. </li><li> Soigneusement transférer la couche leucocytaire dans un nouveau tube conique de 50 ml, ajouter 30 ml de PBS dans le tube, et laver les cellules. </li><li> Centrifuger les cellules à 515 g pendant 5 min à température ambiante. &lt;/ Li&gt; <li> Jeter le PBS et remettre les cellules dans 0,5 ml de milieu de cellules sanguines. </li><li> Compter les cellules et la plaque 1 x 10 6 cellules par puits d&#39;une plaque de 24 puits. Ajouter PBS dans les puits environnants pour éviter l&#39;évaporation. </li><li> Stabiliser les cellules pendant 5 jours à 37 ° C dans 5% de CO 2 avant la transduction. Ajouter un 0,5 ml supplémentaires de milieu de cellules de sang frais sur 3-4 jours sans perturber les cellules. </li></ol></li></ol> 2. Transduction de virus Sendai <ol><li> Transduction (jour 0) <ol><li> Recueillir et transférer les cellules du sang dans un tube conique de 15 ml et les compter en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Préparer 3 x 10 5 cellules par transduction et centrifuger les cellules à 515 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant par aspiration et remettre les cellules dans 0,5 ml de milieu de cellules sanguines. </li><li> Transférer les cellules dans un puits d&#39;une plaque non revêtue 24 puits. </li><li> Décongeler le mélange de virus Sendai dans la glace et l&#39;ajouter à la sucellules spended. Ajouter virus Sendai aux cellules basées sur les recommandations du fabricant. </li><li> Sceller la plaque avec un film d&#39;étanchéité et centrifuger à 1.150 xg pendant 30 min à 30 ° C. </li><li> Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant une nuit (O / N). </li></ol></li><li> transfert de la cellule à la matrice nourricière (jour 1) <ol><li> Le lendemain, le manteau, une plaque de 24 puits avec vitronectine. Diluer la solution de vitronectine dans du PBS pour obtenir une concentration finale / ml 5 pg. Ajouter 1 ml de vitronectine à un puits d&#39;une plaque à 24 puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. Retirer la solution de revêtement avant l&#39;utilisation. Les plaques revêtues peuvent être stockées dans la température ambiante pendant 3 jours. </li><li> Transférer tous les médias contenant les cellules et le virus au bien enrobé. </li><li> Recueillir les cellules restantes avec un 0,5 ml supplémentaires de milieu de cellules de sang frais et l&#39;ajouter à la cellule contenant bien. </li><li> Centrifuger la plaque à 1.150 xg pendant 10 min à 35 ° C. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant, ajouter 1 ml de iPSC médias, et de maintenir les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 O / N. </li></ol></li><li> transfert de cellules Second (Jour 2) <ol><li> Enduire les puits d&#39;une nouvelle plaque de 24 puits avec 5 ug / ml de vitronectine, comme décrit à l&#39;étape 2.2.1. Utiliser un puits de la plaque pour chaque transduction. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à partir de la première plaque à la plaque de vitronectine nouvellement revêtu. NOTE: Si non nécessaire, les cellules en suspension peuvent être jetés. La procédure décrite à l&#39;étape 2.3 peut être répétée 2-3 fois avec les cellules en suspension. Si les étapes seront répétées, récolter les cellules. </li><li> Pendant ce temps, ajouter 1 ml de milieux COPSi au puits de la première plaque, pour l&#39; entretien et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 O / N. </li><li> Maintenir les cellules fixées à 37 ° C et 5% de CO 2 et d&#39; effectuer un changement quotidien des médias avec les médias iPSC frais. Colonies apparaîtront sur jours 14-21 après transduction. </li><li> Centrifuge la plaque fraîchement revêtue contenant les cellules en suspension à 1.150 x g et à 35 ° C pendant 10 min. </li><li> Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 O / N. </li><li> Le lendemain, retirer le surnageant et le remplacer par les médias iPSC frais. REMARQUE: La procédure décrite à l&#39;étape 2.3 peut être répétée 2-3 fois avec les cellules en suspension. Si les étapes seront répétées, récolter les cellules dans le surnageant et répéter l&#39;étape 2.3. </li><li> Maintenir les cellules attachées avec des changements de médias quotidiens jusqu&#39;à 80% de confluence est atteinte. </li></ol></li></ol> 3. Reprogrammed Maintenance cellulaire <ol><li> entretien précoce après la culture de la plaque de 24 puits <ol><li> 7-10 jours après la transduction, une fois que les cellules sont confluentes, préparer un, de 60 mm plat vitronectine-enduit. Avec une solution diluée de vitronectine dans du PBS pour obtenir une concentration finale / ml 5 pg. Ajouter 1 ml de vitronectine au plat et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. </li><li> laver lecellules avec du PBS et ajouter 1 ml de PBS / EDTA 1 mM pour détacher les cellules. </li><li> Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 min. </li><li> Récolter les cellules et de les centrifuger à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3 ml de milieu iPSC frais. </li><li> Plate toutes les cellules remises en suspension sur le plat nouvellement revêtue de 60 mm. </li><li> Ajouter un inhibiteur de kinase 10 mM RHO aux cellules et les maintenir à 37 ° C dans 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que les cellules sont confluentes à 80%. </li></ol></li><li> Split pour l&#39;apparence de la colonie (Subcloning Préparation) <ol><li> Préparer un, de 100 mm plat vitronectine revêtu, comme décrit à l&#39;étape 3.1.2. </li><li> Laver les cellules avec du PBS et ajouter 1 ml de PBS / 1 mM d&#39;EDTA pour détacher les cellules. </li><li> Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 min. </li><li> Récolter les cellules et de les centrifuger à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et préparer 1 x 10 4 cellules par boîte.</li><li> Centrifuger les cellules à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min. </li><li> Resuspendre 1 x 10 4 cellules dans 6 ml de iPSC médias, la plaque - les sur le plat revêtu de 100 mm, et d&#39; ajouter un inhibiteur de kinase 10 mM RHO aux médias. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant une semaine jusqu&#39;à ce que les grandes colonies apparaissent. NOTE: Maintenir et élargir les colonies pour le sous-clonage. Le sous-clonage se fait habituellement en moins de 5 passages. </li></ol></li><li> Colony picking en utilisant iPSC colonie solution détachant <ol><li> Une semaine avant la cueillette de la colonie, les graines 1 x 10 4 cellules dans un, de 100 mm plat vitronectine revêtu, comme mentionné à l&#39; étape 3.2.7. </li><li> Préparer une 60 mm Antenne vitronectine revêtu par addition de 2 ml d&#39;une solution de la vitronectine et l&#39;incubation à température ambiante pendant au moins 1 h. </li><li> En observant à travers un microscope (40X ou 100X), marquer des colonies avec des limites claires à l&#39;aide d&#39;un marqueur. Retirer la solution de vitronectine de la nouvelle plaque faite à l&#39;étape 3.3.2 et ajouter 6 mldes iPSC médias supplémenté avec 10 mM RHO kinase. </li><li> Retirez le milieu de culture des cellules et les laver avec 3 ml de PBS. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;une solution de détachement COPSi des colonies et les incuber pendant 30 secondes à température ambiante. </li><li> On élimine la solution de la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 secondes supplémentaires. </li><li> En utilisant une pipette P200, dessiner 200 ul de milieu de la plaque et détacher les colonies ciblées par pipetage. Transférer les colonies dispersées à la nouvelle boîte de 100 mm. </li><li> Incuber et maintenir les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2. NOTE: Après avoir obtenu une colonie iPSC pure, les cellules ont été maintenues jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le passage 10. La caractérisation a été réalisée après au moins 10 passages. Des dilutions d&#39; anticorps et les informations d&#39; amorce sont présentées dans les tableaux 1 et 2. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Puisque les cellules souches embryonnaires (CSE) ont montré plusieurs lacunes, la nécessité d&#39;un outil de remplacement était nécessaire. Par conséquent, le développement des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) par Yamanaka est venu sous les projecteurs internationaux. Il a été depuis près de dix ans Yamanaka a découvert que la pluripotence peut être induite en ajoutant seulement quatre gènes dans des cellules somatiques adultes. Depuis CSPi sont &quot;induites&quot; à partir de cellules somatiques matures...

Les cellules souches ont été l&#39; un des matériaux les plus attrayants de la thérapie clinique depuis plusieurs décennies 1. Les propriétés intéressantes de cellules souches sont pluripotence et la capacité d&#39;auto-renouvellement. En 1981, les premières cellules souches embryonnaires (CSE) ont été isolées à partir de l&#39;embryon de souris 2. Cependant, quand la technique a été appliquée à des embryons humains, il fait face à plusieurs questions éthiques. En 2006, lorsque le Dr Yamanaka et son équipe reprogrammées la première cellule pluripotente à partir de cellules somatiques de souris, le champ de cellules souches a retrouvé sa possibilité et l&#39; intérêt a été ravivé 3. En fournissant plusieurs facteurs définis, les cellules souches pluripotentes ont été avec succès &quot;induits&quot; à partir de cellules somatiques adultes, et ont donc été nommés «cellules souches pluripotentes induites (CSPi).&quot; En 2007, cette technique a été appliquée à des cellules humaines 4, ce qui donne des cellules avec les caractéristiques exactes des CES , mais aucun du débat éthique. Théoriquement, iPSCs peut être générée à partir de tout type de cellule obtenue à partir de tout individu ou patient. CSPi spécifiques des patients sont en hausse comme un outil potentiel qui peut simuler les phénotypes de la maladie et les conditions épigénétiques de chaque patient. En utilisant la modification génétique ou d&#39; autres procédés qui peuvent inverser l&#39;état pathogène, iPSCs spécifiques à un patient peuvent également être utilisés en médecine personnalisée 5. En outre, iPSCs sont moins associée à un rejet immunitaire parce qu&#39;ils ont la même identité immunitaire du donneur, ce qui rend l&#39; auto-transplantation plus réalisable 6. Par conséquent, CSPi sont devenus la plate-forme la plus prometteuse dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues et des thérapies régénératrices. Compte tenu de ces avantages, les protocoles améliorés qui peuvent donner plus purs et des rendements plus élevés dans le moins de temps à partir de la source de cellules plus petites sont constamment en cours de développement. Une considération majeure de trouver le protocole le plus efficace pour l&#39;application future est le type de cellules primaires. La plupart des premières générations proto iPSCcols sont optimisés pour les cellules adhérentes puisque les lignes iPSC originales ont été induites à partir de fibroblastes de la peau 4. Cependant, l&#39;isolement et la préparation de ces cellules sont main-d&#39;œuvre. En outre, l&#39;isolement des fibroblastes de peau comprend des interventions chirurgicales invasives qui peuvent devenir un défaut majeur pour une application plus large. Par conséquent, pour l&#39;utilisation ultérieure de iPSCs, une source de cellules à l&#39;acquisition pratique est nécessaire. Le sang est considéré comme une source de cellules idéale car elle est obtenue par le biais d&#39; une procédure minimalement invasive et non 09/07. Dans cette étude, nous avons développé une simple modification au protocole générant hiPSCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). Sans que le processus d&#39;expansion difficile d&#39;un type cellulaire spécifique, telles que les cellules CD34 +, les cellules du sang entier ou en série PBMC ont été étalées sur des plaques de matrice revêtu par centrifugation après transduction avec le virus Sendai contenant des facteurs Yamanaka. Cette méthode réduit le temps nécessaire à lafixation des cellules flottantes transduites et une diminution de la perte de cellules reprogrammées qui ne sont pas en mesure de joindre leur propre chef.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Dish</td><td>TPP&nbsp ;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube cornical</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tube cornical</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipette jetable</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipette jetable</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC Isolation Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>Milieux de cellules sanguines</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>Sang Supplément de milieux cellulaires (100x)</td></tr><tr><td colspan="4">iPSC Generation and Culture Materials</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 Media</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td>Milieux iPSC</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Solution de détachement de</td></tr><tr> colonie<td colspan="4">Quality Control Materials</td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin Albumine&nbsp ;</td><td>Laboratoire vectoriel</td><td>SP-5050°</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-TRA-1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H+L)</td><td>anticorps Sonde moléculaire</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Sonde moléculaire</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAPI Sonde moléculaire</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold réactif anti-décoloration</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass, Coated&nbsp ;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcool</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand Kit de synthèse d’ADNc</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TBE i-Taq DNA polymérase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>Chargement étoile</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) Marqueur d’échelle d’ADN</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Tampon</td></tr> <tr>de rinçage<td>Chlorure de sodium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>Tampon de rinçage</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>Tampon de rinçage</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>Tampon de rinçage</td></tr></tbody></table>

induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant sendai virus et centrifugation

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Le développement récent de cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs) a prouvé que les cellules somatiques matures peuvent revenir à un état pluripotent indifférenciée. Maintenant, la reprogrammation est effectuée avec divers types de cellules somatiques adultes: kératinocytes, cellules de l&#39; urine, des fibroblastes, etc. Les premières expériences ont été généralement fait avec des fibroblastes dermiques. Cependant, cela nécessitait une intervention chirurgicale invasive pour obtenir les fibroblastes des patients. Par conséquent, les cellules de la suspension, telles que des cellules de sang et d&#39;urine ont été considérées comme idéales pour la reprogrammation en raison de la facilité d&#39;obtention des cellules primaires. Ici, nous rapportons un protocole efficace pour la génération COPSi à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). En étalant les CMSP transduites en série à une nouvelle plaque à l&#39;aide de la matrice centrifugation revêtu, ce protocole peut facilement fournir des colonies iPSC. Cette méthode est également applicable à des cellules mononucléées du sang du cordon ombilical (CBMCs). Cette étude présente une prot simple et efficaceocol pour la reprogrammation de CMSP et CBMCs.

Ce protocole présente une méthode simple pour reprogrammer CMSP isolées à partir du sang. En utilisant la combinaison de placage série et la centrifugation, iPSCs ont été produites avec succès. Avec cette méthode, iPSCs pourraient être générés avec une petite quantité de cellules du sang total sans isoler ou de développer un type de cellule spécifique. Nous avons généré avec succès à partir iPSCs seulement 1x10 4 cellules dans une petite plaque de culture cellulaire. <p cl...

Nous proposons un protocole de reprogrammation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en cellules souches pluripotentes induites (iPSC). En plaquant les cellules sanguines transduites sur des plaques recouvertes de matrice avec centrifugation, les iPSC sont induites avec succès à partir de cellules flottantes. Cette technique suggère un protocole de reprogrammation simple et efficace pour des cellules telles que les PBMC et les CBMC.

Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

L'objectif général de cette étude est de reprogrammer des cellules mononucléées du sang périphérique en cellules souches pluripotentes induites, en utilisant un ensemencement sériel par centrifugation. Initialement, les CIPSc ont été obtenues par reprogrammation de fibroblastes. Aujourd'hui, diverses cellules sont utilisées pour la reprogrammation.Cependant, en raison de l'accessibilité du sang, les PBMC peuvent ne pas être une source cellulaire acceptable pour des applications ultérieures des iPSC, notamment dans le criblage de médicaments, la modélisation de maladies et le développement de la médecine régénérative. Dans cette étude, nous présenterons un protocole de reprogrammation des iPSC à partir de PBMC en utilisant une force centrifuge. Ce protocole offrira une option supplémentaire lors de la reprogrammation de cellules en suspension.En illustrant la procédure, nous utiliserons Nam, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour isoler les cellules monocytaires, commencez par obtenir au moins dix millilitres de sang frais à partir d'un prélèvement sanguin dans un tube de préparation cellulaire. Ensuite, transférez le sang dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et diluez-le avec du PBS stérile selon un rapport de un à quatre.Ensuite, ajoutez dix millilitres de milieu de gradient de densité dans un nouveau tube conique de 50 millilitres, puis déposez soigneusement le sang dilué au-dessus du milieu de gradient de densité. Centrifugez ensuite l'échantillon à 750 × g pendant 30 minutes à température ambiante, sans frein de centrifugation. Après 30 minutes, transférez soigneusement la couche buffy dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.Ajouter 30 millilitres de PBS et laver les cellules. Ensuite, centrifuger les cellules à 515 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Puis, éliminer le PBS et resuspendre les cellules dans 0,5 millilitre de milieu pour cellules sanguines.Ensuite, compter les cellules et les mettre en culture dans une plaque 24 puits. Ajouter du PBS dans les puits environnants pour éviter l'évaporation. Ensuite, stabiliser les cellules pendant cinq jours à 37 degrés Celsius avant la transduction.Ajoutez un volume supplémentaire de 0,5 millilitre de milieu frais pour cellules sanguines entre le jour trois et le jour quatre, sans perturber les cellules. Dans cette procédure, transférez les cellules sanguines dans un tube conique de 15 millilitres et comptez-les à l’aide d’un hématimètre. Ensuite, préparez trois fois dix à la puissance cinq cellules pour la transduction, puis centrifugez les cellules à 515 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, éliminer le surnageant par aspiration et resuspendre les cellules dans 0,5 millilitre de milieu pour cellules sanguines. Puis, transférer les cellules dans une cavité d'une plaque 24 puits non revêtue. Décongeler le mélange de virus Sendai sur glace et l'ajouter aux cellules en suspension.Scellez la plaque avec un film d'étanchéité et centrifugez-la à 1 150 ×g pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius. Après la centrifugation, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Pour recouvrir une plaque de 24 puits avec de la vitronectine, le lendemain, diluez la solution de vitronectine dans du PBS afin d'obtenir une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre.Ensuite, ajoutez un millilitre de vitronectine dans un puits et incubez-le à température ambiante pendant au moins une heure. Par la suite, retirez la solution d'ensemencement et transférez tout le milieu contenant les cellules et le virus dans le puits revêtu. Puis, récupérez les cellules restantes avec 0,5 millilitre supplémentaire de milieu frais pour cellules sanguines et ajoutez-les au puits contenant les cellules.Ensuite, centrifuger la plaque à 1 150 × g pendant dix minutes à 35 °C, puis maintenir les cellules à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Pour le deuxième transfert cellulaire, recouvrir la cavité avec de la vitronectine à cinq microgrammes par millilitre, comme décrit précédemment. Utiliser une cavité de la plaque pour chaque transduction, et transférer la suspension cellulaire de la première plaque vers la nouvelle plaque recouverte de vitronectine.Entre-temps, ajouter un millilitre de milieu pour iPSC dans un puits de la première plaque pour l'entretien, puis incuber à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone, avec un changement de milieu quotidien par du milieu frais pour iPSC. Des colonies apparaîtront entre le jour 14 et le jour 21 après la transduction. Centrifuger la plaque nouvellement enrobée, contenant les cellules en suspension, à 1 150 ×g à 35 degrés Celsius pendant dix minutes.Après la centrifugation, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit. Le jour suivant, retirer le surnageant et le remplacer par un milieu frais pour cellules souches pluripotentes induites. Maintenir les cellules attachées avec un changement quotidien de milieu, jusqu'à ce qu'une confluence de 80 % soit atteinte.Une semaine avant la sélection des colonies, ensemencer un fois dix puissance quatre cellules dans une plaque de 100 millimètres revêtue de vitronectine. Ensuite, préparer une plaque de 60 millimètres revêtue de vitronectine en ajoutant deux millilitres de solution de vitronectine, puis incuber à température ambiante pendant au moins une heure. En observant au microscope, marquer les colonies présentant des limites bien définies sur le fond de la plaque à l’aide d’un stylo-feutre.Retirer la solution de vitronectine de la nouvelle plaque et ajouter six millilitres de milieu pour cellules souches pluripotentes induites, complété par dix millimolaire de RHO kinase. Ensuite, retirer le milieu de culture des cellules et les laver avec trois millilitres de PBS. Puis, ajouter un millilitre de solution de détachement des colonies de cellules souches pluripotentes induites et les incuber pendant 30 secondes à température ambiante.Ensuite, retirez la solution de la plaque et incubez-la à température ambiante pendant encore 30 secondes. Après 30 minutes, prélevez 200 microlitres de milieu à partir de la plaque et détachez les colonies ciblées par pipetage. Puis, transférez les colonies dispersées vers une nouvelle boîte de 60 millimètres.Incuber et maintenir les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone jusqu'à ce qu'elles atteignent le dixième passage. Au stade précoce de la reprogrammation, les iPSC étaient mélangées aux cellules différenciées non reprogrammées attachées. Avant l'expansion, il était difficile de distinguer les iPSC des autres cellules.En semant les cellules à faible densité, des colonies suffisamment grandes pour être prélevées ont été obtenues. Après l'isolement de la colonie, les agrégats cellulaires ont été dissociés en cellules individuelles et mis en culture. Des colonies d'iPS pures ont été observées par la suite.Après l'expansion des cellules souches pluripotentes induites pures, la qualité des cellules a été testée. Les cellules ont été colorées à la phosphatase alcaline afin de confirmer l'état indifférencié des cellules souches pluripotentes induites. Toutes les colonies issues des cellules souches pluripotentes induites isolées ont montré une coloration positive.Les marqueurs de pluripotence ont été confirmés par coloration immunofluorescente. Les cellules reprogrammées exprimaient fortement des marqueurs de pluripotence, tels que SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4, et surtout TRA-1-60 ; l'expression des marqueurs de pluripotence a été confirmée par RT-PCR. À l’aide d’un plaquage en série par centrifugation, l’attachement des PBMC en transit sur une plaque revêtue de matrice a été réalisé.Les attaches sont effectuées comme prévues, et les colonies de CIP sont soumises à une purification. À l’aide de ce protocole, des CIP peuvent être générées à partir de PBMC en un mois. Ce protocole réduit le temps nécessaire à l’attachement des cellules transduites et empêche la perte des cellules reprogrammées qui n’ont pas pu s’attacher spontanément.Cependant, la purification de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) entièrement reprogrammées formant des colonies peut être cruciale lors de la réalisation de cette procédure. Précédemment, nous avons réussi à reprogrammer des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et des cellules mononucléées à l’aide de ce protocole. Les cellules iPS dérivées de cellules sanguines ainsi obtenues peuvent être largement utilisées dans divers domaines de recherche.Ce protocole peut faciliter le processus de reprogrammation d'autres types de cellules en suspension flottantes, pour des applications et des études ultérieures.

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