Name: Dosages pour étudier le rôle de la vitronectine dans adhésion bactérienne et la résistance au sérum (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez les protocoles de cytométrie en flux et d'ELISA pour étudier l'interaction entre la vitronectine humaine et les protéines membranaires bactériennes. Ces méthodes permettent d'analyser le rôle de la vitronectine dans l'adhésion bactérienne et la résistance au sérum.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation d’Anna et Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. et Edla Johansson Foundation, le Swedish Medical Research Council (accorder numéro K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondation du Cancer à l’Université Hôpital de Malmö, la société physiographiques (de Forssman Fondation) et du Conseil de comté de Skåne Research and Development Foundation.

1. analyse des Vn comme Ligand protéine bactérienne de Surface
<ol><li>
Détection de Vn-fixation à la surface bactérienne à l’aide de cytométrie en flux Remarque : En cytométrie en flux, nous avons utilisé diffusion latérale et forward scatter pour porte des événements positifs. Pour examiner les interactions avec les Vn, Hif clinique isole (n = 10)7 ont été sélectionnés ainsi qu’e. coli BL21 (DE3) comme témoin négatif (Figure 1A).<ol>
<li>La culture Hif clinique isole dans le milieu de perfusion (BHI) de cerveau-cœur additionné de 10 µg/mL NAD et hémine à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min. Utilisez Luria-Bertani moyenne pour la culture d’e. coli14. Récolter le Hif à phase logarithmique (OD600 = 0,3)15et remettre en suspension les bactéries présentes dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2, contenant 1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) (tampon de blocage ; PBS-BSA). Ajuster la suspension à 109 UFC/mL.</li>
		<li>Transférer les aliquotes contenant 5 x 106 UFC et les tubes 5 mL à fond rond en polystyrène (12 x 75 mm2) et ajouter 1 mL de tampon de blocage. Centrifuger la suspension à 3 500 × g à température ambiante (RT),16 , pendant 5 min pour les bactéries de granule, puis Aspirez soigneusement pour enlever le liquide surnageant sans déranger le culot.</li>
		<li>Remettre en suspension les pellets bactériennes avec 50 μL de tampon de blocage contenant 250 nM Vn et incuber les échantillons pendant 1 h à RT sans agiter. Après incubation, les bactéries de granule par centrifugation à 3 500 g pendant 5 min, puis laver les granules trois fois à l’aide de PBS et des étapes de centrifugation similaires.</li>
		<li>Au culot bactérien, ajouter 50 μL de moutons primaires anti-humain Vn des anticorps polyclonaux (ACP) à une dilution au 1/100 de PBS-BSA. Incuber la suspension pendant 1 h à RT, puis lavez les bactéries trois fois avec du PBS pour éliminer les anticorps non fixés (comme indiqué au point 1.1.3).</li>
		<li>Ensuite, ajouter 50 μL de PBS-BSA contenant l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-conjugué âne anti-moutons carnets d’adresses personnels (dilution 1 : 100) et incuber à RT dans l’obscurité pendant 1 heure.</li>
		<li>Préparer un contrôle à blanc en incubant des bactéries avec blocage tampon seulement et carnets d’adresses personnels sans Vn.</li>
		<li>Laver trois fois avec 1 mL de tampon de blocage, les bactéries et la suspension de granule par centrifugation, tel que décrit dans la section 1.1.2. Enfin, resuspendre le culot bactérien avec 300 µL de PBS et d’analyser par écoulement cytometry7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse de l’interaction entre PH recombinante et Vn ELISA Remarque : Les contrôles doivent être inclus pour exclure les liaisons non spécifiques. La protéine humaine facteur H (FH) ou C4b-liaison (C4BP) sont utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement.<ol>
<li>Diluer chacun des protéines humaines (Vn, FH et C4BP) séparément à 50 nM de Tris-HCl, pH 9,0 (tampon de revêtement). Déposer 100 µL de solution protéique dans chaque puits d’une microplaque Polysorp. Fermez les plaques avec le couvercle et stocker à 4 ° C durant la nuit (16 h) pour faciliter l’immobilisation des protéines sur les puits de plaque de microtitration.</li>
		<li>Jeter la solution de la plaque de microtitrage à l’inclinaison de tête en bas au-dessus de l’évier et laver les puits trois fois avec 300 µL de PBS/puits. Bloquer la microplaque pendant 1 h à RT avec du PBS contenant 2,5 % (p/v) BSA (PBS-BSA).</li>
		<li>Après avoir retiré la solution de saturation, laver les puits trois fois avec 300 µL de PBS contenant 0,05 % (v/v) de Tween 20 (PBST) / puits. Ajouter 100 µL de 50 recombinant nM-le tag son PH de chaque échantillon bien et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Dans les puits de contrôle, ajouter 100 µL de PBS-BSA. Remarque : Le gène lph PH de Hif a été amplifié par PCR et cloné dans le vecteur d’expression pET26b qui ajoute un 6 × His-tag à l’extrémité C-terminale de la protéine exprimée. Le vecteur recombinant a été transformé en e. coli BL21 (DE3) pour l’expression. Ni-NTA résine a été utilisée pour purifier la protéine recombinante15.</li>
		<li>Jeter la solution protéique et supprimer des éléments non fixés par laver les puits trois fois avec 300 µL de PBST / puits. Ajouter 100 µL de la peroxydase de raifort contenant PBS-BSA (PR)-conjugué anti-ses carnets d’adresses personnels (01:10, 000 dilution) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
		<li>Préparer solution 20 mM A en dissolvant tétraméthylbenzidine dans une solution de méthanol acétone et 45 % à 5 %. Pour préparer la solution B, dissoudre à 19,2 g d’acide citrique dans 1 000 mL H2O, ajuster le pH à 4,25 en ajoutant KOH, puis ajoutez 230 µL de 30 % H2O2. Stocker les deux solutions dans l’obscurité à température ambiante. Juste avant l’utilisation, mélanger 500 µL de solution B avec 9,5 mL de solution A pour préparer le réactif de détection ELISA.</li>
		<li>Laver les puits trois fois avec 300 µL de PBST / puits et détecter les complexes antigène-anticorps en ajoutant 100 µL de réactif de détection ELISA à chaque puits.</li>
		<li>Ajouter 50 µL de 1 M H2SO4/well pour arrêter la réaction. Mesurer la densité optique des puits à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Étude de la cinétique de l’interaction des recombinants PH et Vn utilisant BLI
	<ol>
<li>Immobiliser Vn humaine sur les capteurs amine-réactive à l’aide de l’amine couplage méthode, selon lignes directrices11 les directives du fabricant.</li>
		<li>À l’aide de PBS, en série diluer le ligand (recombinant PH) de 0 à 4 µM et transférer les solutions qui en résulte dans une microplaque 96 puits noir, fond plat. Exécutez l’expérience à 30 ° C à l’aide d’un instrument BLI17.</li>
		<li>Charger le dossier de données dans le logiciel d’analyse de données BLI. Sélectionnez l’option « sélection du capteur » . Puis, sélectionnez « référence bien » (capteur de Vn-enduit dans du PBS) pour la soustraction.</li>
		<li>Sélectionnez « Aligner l’axe des ordonnées à base » et « interstep correction et aligner à association ». Appuyez sur « données de processus » qui seront ouvrira automatiquement l’onglet analyse.</li>
		<li>Dans l’onglet analyse, sélectionnez l’option « association et dissociation » sous ajustement de courbe. Sélectionnez le modèle "1:1 liaison et ajustement global". Appuyez sur « ajuster la courbe » et l’exportation montage données17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caractérisation du rôle de Vn en adhérence bactérienne
<ol><li>
Étude de l’adhérence des bactéries aux surfaces de verre enduit de Vn
	<ol>
<li>Préparer une solution de 2 µg/mL de Vn en PBS et ajouter 10 µL de cette solution sur un microscope de verre glissent comme une goutte. Permettre à la baisse à sécher sur la lame pendant 30 min à RT. manteau une diapositive avec l’albumine sérique humaine (Ash) comme témoin négatif.</li>
		<li>Laver les lames de verre enduit de protéine trois fois en plongeant les diapositives pendant deux secondes dans un bécher contenant PBS pour enlever l’excès de protéines non couché. Ajouter 20 mL de culture fraîche de Hif (décrite à l’étape 1.1.1) dans une boîte de petri stérile en plastique et de submerger le Vn- / lames de verre enduit HSA dans le milieu de culture. Incuber les boîtes à 37 ° C pendant 1 h avec agitation à 20 tr/min. NOTE : Hif M10 et Hif M10Δl/h ont été cultivées dans un milieu BHI liquide ou sur plaques de gélose chocolat. Le support pour le mutant l/h a été complété par 10 µg/mL kanamycine15.</li>
		<li>Après l’incubation, retirer toutes les bactéries non liés en immergeant les lames trois fois dans un bécher rempli avec du PBS. Visualiser les bactéries par la coloration de Gram, tel que décrit.<ol>
<li>Enlever excès PBS de chaque diapositive en inclinant et en touchant le bord sur papier de soie. Sécher les diapositives pour les 3-5 min à ta et fixer les bactéries collés en passant chaque diapositive trois fois au-dessus d’une flamme.</li>
			<li>Maintenez la diapositive par les bords avec deux doigts sur un plateau de coloration, puis ajouter 3 à 4 gouttes (200 à 300 µL) de solution de violet de gentiane 2,3 %. Attendre 60 s, puis lavez les diapositives sous un léger courant de robinet d’eau pendant 3-4 s.</li>
			<li>Ajouter 3-4 gouttes de solution d’iode de 0,33 % sur les diapositives. Attendre 1 min, puis rincer la lame sous un léger courant d’eau du robinet. Séchez soigneusement les lames de papier buvard.</li>
			<li>Ajouter 3 à 4 gouttes de solution de décoloration contenant de l’alcool isopropylique 75 % et 25 % acétone sur le toboggan. Après 5 à 10 s, laver la lame sous un léger courant d’eau du robinet.</li>
			<li>Ajouter 3 à 4 gouttes (200 à 300 µL) de solution de base carbolfuchsin. Attendre 1 min, puis rincer les lames sous un léger courant d’eau du robinet. Sécher les lames à l’aide de papier buvard.</li>
			<li>Visualiser les bactéries sous un microscope photonique, en sélectionnant une lentille d’objectif-immersion dans l’huile à 100 X de grossissement18. Comparer l’adhérence des Hif WT et bactéries mutantes sur les surfaces vitrées Vn - et HSA-enduit.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Étude de l’adhésion de Vn-dépendante des bactéries aux cellules épithéliales Remarque : Ce test d’adhérence efficace a été utilisé dans nos études précédentes4,7.<ol>
<li>Cellules A549 culture (cellules épithéliales alvéolaires de type II) dans une fiole de vitroplants de 75 cm2 avec F12 milieu additionné de 10 % de sérum de veau foetal (vol/vol) (FCS) (milieu complet) et de 5 µg/mL gentamicine. Incuber le flacon dans un incubateur avec 5 % de CO2 à 37 ° C pendant 3 jours jusqu'à 80 % anastomosé (confluence peut être estimée en visualisant la surface couverte par les cellules à l’aide de microscope inversé). Les quatre étapes suivantes décrivent comment préparer les cellules épithéliales pour le dosage19,20.<ol>
<li>Laver la monocouche de cellules dans le ballon deux fois avec 20 mL de PBS en agitant doucement. Pour détacher les cellules de la surface du flacon, ajouter 2 mL de solution d’enzyme cellulaire détachement et incuber le ballon pendant 5 min à 37 ° C. Taper le ballon avec votre paume pour détacher toutes les cellules de la surface en plastique. Pipette de haut en bas plusieurs fois à disperser des amas de cellules.</li>
			<li>Ajouter 18 mL de milieu complet F12 dans le ballon et la suspension de toute cellule de transfert dans un tube stérile de Falcon de 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g à RT et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu complet F12.</li>
			<li>Enlever 10 µL de la suspension cellulaire et placez-le dans un tube Eppendorf, puis ajoutez 90 µL de solution de bleu de Trypan. Charger l’échantillon dans un hémocytomètre (profondeur de 0,1 mm) après avoir placé la lamelle.</li>
			<li>Compter toutes les cellules viables dans les zones A, B, C et D (chaque champ se compose de 16 carrés, et chaque carré a une superficie de 0,0025 mm2), puis calculer le nombre moyen de cellules ([A + B + C + D] / 4). Calculer le nombre de cellules par millilitre selon l’équation suivante : Cellules viables/mL = moyenne des cellules comte × 104 × dilution facteur20. NOTE : Ici, le facteur de dilution est de 10.</li>
			<li>Diluer la suspension cellulaire à 5,0 x 103 cellules/mL à l’aide complète moyenne gentamicine contenant de 5 µg/mL. Pipeter 500 μl de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Incuber les plaques à 37 ° C en 5 % CO2 jusqu'à ce que les cellules soient 90 % anastomosé.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Avant l’infection bactérienne, retirer le support des puits et ajoutez F12 moyen (sans FCS), puis incuber une nuit à 37 ° C.</li>
		<li>Laver la monocouche cellulaire trois fois avec 500 µL de PBS à RT. Place la plaque sur la glace et ajouter 100 µL de préalablement réfrigérées F12 milieu contenant 10 µg/mL de Vn. Incuber plaque à 4 ° C pendant 1 h. Pour les puits de contrôle, ajoutez seulement F12 moyen.</li>
		<li>Après incubation, jeter la solution de pipetage et laver deux fois avec 1 mL de PBS, la couche de cellules à remettre en suspension les RT. une culture de fraîchement cultivés Hif M10 (étape 1.1.1) dans un milieu F12 (2 × 108 UFC/mL). Ajouter 100 µL de la suspension bactérienne dans chaque puits et incuber la plaque pendant 2 h à 37 ° C. Remarque : Chacun bien contient environ 2 x 105 A549 cellules. Pour l’infection, 2 x 107 UFC bactérienne ont été ajoutés, correspondant à une multiplicité d’infection de 100.</li>
		<li>Enlever le support de pipetage et laver les cellules épithéliales A549 trois fois avec du PBS. Ajouter 50 µL/puits de la solution de détachement cellulaire et incuber la plaque pendant 5 min à 37 ° C.</li>
		<li>Ensuite, ajouter 50 µL de milieu complet F12 / puits de bloquer la réaction enzymatique. Transférer les cellules épithéliales (≈100 μL [c'est-à-dire, la totalité du volume]) de chaque puits dans un tube de verre de 6 mL contenant quatre perles de verre. Lyse des cellules à RT au Vortex pendant 2 min.</li>
		<li>Diluer 10 µL du lysat cellulaire 100 fois en ajoutant 10 µL de lysat de 990 µL de milieu F12. Plaque de 10 µL de l’échantillon dilué sur une gélose chocolat.</li>
		<li>Incubez la gélose chocolat à 37 ° C durant la nuit, puis compter les colonies. Chaque colonie représente un UFC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analyse de la résistance de Vn-dépendante de l’activité bactéricide du sérum humain
<ol><li>Achat NHS provenant d’une source commerciale. Préparer VDS comme décrit précédemment12. Reconstituer le VDS avec 180 nM Vn qui équivaut à Vn présent dans le NHS.</li>
	<li>Préparer sérum inactivés par la chaleur (HIS) par NHS de chauffage à 56 ° C pendant 30 min afin d’inactiver les protéines du complément. Remarque : La concentration optimale de sérum (5 %) et temps d’incubation (15 min) pour l’essai décrit aux points 3.3 à 3,7 ont été déterminées empiriquement pour Hif15; ces paramètres peuvent varier pour les autres bactéries pathogènes.</li>
	<li>La culture de bactéries (dans ce cas, Hif M10 et le mutant Hif M10Δl/h) à la phase logarithmique (OD600 = 0,3). Bactéries de granule par centrifugation à 3 500 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Resuspendre le culot bactérien et 1 volume de dextrose, gélatine Veronal tampon (DGVB++; pH 7,3) contenant 2,5 % (p/v) de glucose 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2et 0,1 % (wt/vol) de gélatine.</li>
	<li>Ajouter 1,5 x 103 UFC de bactéries à 100 µL de DGVB++ contenant 5 % de sérum (NHS, sien, VDS, ou VDS + 180 nM Vn). Incuber l’échantillon à 37 ° C pendant 15 min avec la secousse à 300 tr/min.</li>
	<li>Supprimer une aliquote de 10 µL du mélange réactionnel à 0 min (échantillon de0 T) et 15 min (échantillon det T) et plaque sur gélose chocolat. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Après incubation, compter les colonies apparaissant sur la plaque. Calculer le pourcentage de bactéries tuées12 selon l’équation suivante : (UFC à T,t) / (UFC à T0) × 100.</li>
</ol>

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<li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li>
<li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li>
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<li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financiers.

Bactéries pathogènes recrutent Vn à la surface des cellules et d’utilisent ce régulateur de complément pour éviter les dépôts de facteurs du complément et l’achèvement du complexe membranaire attaque2. VN fonctionne aussi comme une molécule de pont entre les protéines de surface bactériennes et de récepteurs de surface cellulaire hôte, permettant ainsi des agents pathogènes d’adhérer à la surface des cellules épithéliales et par la suite servir de médiateur internalisation. Dans cette étude, les a...

La vitronectine (Vn) est une glycoprotéine humaine importante impliqués dans le maintien de l’homéostasie par l’intermédiaire de la régularisation du système fibrinolytique. VN fonctionne aussi comme un régulateur de complément en inhibant la voie du complément terminal au cours de la formation d’un complexe C5b6-7 et la polymérisation de C9. Plusieurs bactéries pathogènes ont démontré que recruter Vn à la surface cellulaire comme moyen de résistance complément dépôt1,2,3. En outre, Vn fonctionne comme une molécule « sandwich » entre bactéries et récepteurs des cellules épithéliales hôte, favorisant ainsi l’adhérence et l’internalisation des pathogènes2,4,5. Liaison du Vn à la surface de la cellule bactérienne est véhiculée par d’autres protéines actuellement non identifiés. Élucider pleinement le rôle fonctionnel de Vn-liaison à l’évasion de la réponse immunitaire de tuyau exigera donc identification de protéines Vn-recrutement.
La première étape dans l’identification des protéines liant Vn est pour tester si un agent pathogène d’intérêt peut lier purifiée Vn. cytométrie en flux est une méthode pratique et simple pour déterminer si Vn est lié aux cellules de l’agent pathogène. Dans cette étude, nous avons évalué la liaison du Vn à divers Haemophilus influenzae type f (Hif) isolats cliniques6. La méthode décrite ici est quantitative et peut être utilisée pour distinguer la capacité de liaison d’une grande variété de souches bactériennes. Dans une étude précédente, nous avons caractérisé protéine H (PH) de Hif comme un liant Vn protéine7. Par conséquent, dans la présente étude, le potentiel de liaison Vn de mutants de type sauvage (WT) Hif et Hif M10Δ del/h ont été comparées en utilisant les protocoles décrits.
Lorsqu’il est déterminé qu’un pathogène lie Vn, la deuxième étape est de caractériser la surface proteome afin d’identifier des protéines liant le Vn potentiels. Une variété d’approches peut être utilisée pour ce but8,9, mais ces méthodes ne sont pas décrits dans le présent rapport. La méthode plus appropriée pour l’examen des interactions protéine-protéine est d’inoculation exprimer certaines protéines de surface bactériennes chez e. coli et purification par chromatographie d’affinité. Ici, nous utilisons des PH et ses interactions moléculaires Vn pour illustrer la méthode. Interactions entre recombinant PH et Vn furent caractérisées par une enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 et une technique récemment développée d’exempte d’étiquette appelée bio-couche interférométrie (BLI)10,11. Alors que les tests ELISA peuvent servir à confirmer les interactions protéine-protéine, BLI fournit des données détaillées sur les paramètres cinétiques des interactions.
Afin d’étudier le rôle fonctionnel de Vn en adhérence bactérienne, deux dosages différents peuvent être utilisés. Le premier test décrit ici est une mesure directe de l’adhérence des bactéries sur des surfaces de verre enduit de Vn, tandis que le deuxième test examine l’adhérence à la surface des cellules épithéliales. Pour le premier test, lames de verre ont été revêtus de Vn, et la liaison du WT ou souches mutantes de Hif a été évaluée par microscopie et coloration de Gram. Cette technique permet de distinguer facilement bactéries basés sur la capacité de lier Vn12. Adhérence bactérienne aux cellules de mammifères a été analysée puis en ajoutant des bactéries cultivées sur une monocouche de cellules épithéliales alvéolaires de la type II ; attachement des bactéries a été évaluée en comptant le nombre de formatrices unités (UFC). Collés et intériorisées de bactéries peuvent être distinguées en présence ou en absence de Vn4,13.
Le rôle de l’acquisition de Vn en résistance au sérum bactérienne a été évalué par dosage sérique meurtre (c'est-à-dire, l’activité bactéricide de sérum). Afin d’évaluer l’importance de l’acquisition de Vn dans la résistance au sérum, l’activité bactéricide du sérum appauvris en Vn (VDS) a été comparée à celle du sérum humain normal (NHS). La méthode utilisée facilement distingue liant Vn contre bactéries non contraignant basés sur la résistance au sérum. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier le rôle de Vn dans la résistance au sérum de plusieurs bactéries pathogènes4,12.
De nombreuses méthodes ont été rapportés pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Nous décrivons ici un ensemble de protocoles qui peuvent être facilement adaptés à l’étude de tout agent pathogène afin d’évaluer le rôle de Vn dans la pathogenèse. Nous avons testé ces protocoles à l’aide de différents agents pathogènes, et Hif a été choisi comme exemple pour ce rapport.

<table><tbody><tr><td>Thermomixeur de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td>Shaker de chauffage et de refroidissement à bloc sec</td></tr><tr><td>Tube à fond rond en polystyrène de 5 mL.</td><td>BD Falcon</td><td>60819-138</td><td>12 &times ; 75 mm style</td></tr><tr><td>5 % CO2 incubateur fourni&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>BBD6220</tr><tr><td>tube à fond rond en polystyrène de 6 ml.</td><td>VWR</td><td>89000-478</td><td>12 &times ; 75 mm style avec capuchon</td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>BD Falcon</td><td>08-772-1H</td><td>Qualité de culture cellulaire</td></tr><tr><td>30 % Peroxyde d’hydrogène (H2O2) solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Qualité d’analyse en laboratoire</td></tr><tr><td>75 cm2 flacon de culture tissulaire</td><td>BD Falcon</td><td>BD353136</td><td>Vented</td></tr><tr><td>96 puits noir plaque à fond plat</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Culture tissulaire traitée & micro ; Plaques noires transparentes</td></tr><tr><td>A549 Cell Line human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86012804-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de décollement de cellules (Accutase)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ML</td><td>Capteurs</td></tr><tr><td>AR2G</td> de qualité culture cellulaire <td>Pall Life Science</td><td>18-5095</td><td>Capteur à protéine immobilisée par couplage aminologique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR</td><td>97064-786</td><td>Qualité d’analyse</td></tr><tr><td>Albumines sériques bovines (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>Convient pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Papier bibuleux&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>28511-007</td><td></td></tr><tr><td>Interféromètre de biocouche</td><td>Pall Life Science</td><td>FB-50258</td><td>Équipement de mesure d’interférométrie bicouche</td></tr><tr><td>Solution de violet cristallin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>C4BP (protéine de liaison C4b)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Acheté sous forme liquide congelée</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solution de carbol-fuchsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT8018-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500G</td> Solution décolorante <td>de qualité American Chemical Society (ACS)</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>E. coli hôte (E. coli BL21)</td><td>Novagen</td><td>69450-3</td><td>Expression protéique hôte</td></tr><tr><td>F12 milieu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td> Cytomètre en flux de <td>qualité de culture cellulaire</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>651154</td><td>Grade d’analyse cellulaire pour les applications de recherche&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>Convient à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum humain normal (NHS)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>NHS</td><td>Pooled human serum</td></tr><tr><td>FITC-conjugué anti-anticorps anti-mouton d’âne&nbsp ;</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR88F</td><td>Gentamicine polyclonale</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Qualité de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Convient pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Marienfeld</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-His tag conjugués HRP</td><td>Abcam</td><td>ab1269</td><td>Polyclonal</td></tr><tr><td>Facteur humain H</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A137</td><td>Acheté sous forme liquide congelée</td></tr><tr><td>C4BP</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Solution congelée</td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1653-10G</td><td>Poudre lyophilisée</td></tr><tr><td>Colonne de résine d’affinité à l’histidine (HisTrap HP)</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>17-5247-01</td><td>Colonnes préemballées avec du Ni Sepharose</td></tr><tr><td>His-étiqueté PH</td><td></td><td></td><td>Exprimé et purifié de manière recombinante dans notre laboratoire</td></tr><tr><td>Solution d’iode</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT902-8FOZ</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-1LP</td><td>Grade d’analyse</td></tr><tr><td>&nbsp ; Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Microscope inversé</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>plain, taille 25 mm & fois 75 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide contenant C terminal 6x His-tag sur le squelette (pET26(b))</td><td>Novagen</td><td>69862-3</td><td>Vecteur d’ADN</td></tr><tr><td>Plaques de microtitre Polysorb&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9410</td><td>Pour ELISA</td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6009</td> American <td>Chemical Society (ACS) grade</td></tr><tr><td>Mouton anti-anticorps Vn humains</td><td>AbD Serotec</td><td>AHP396</td> Agitateur <td>polyclonal</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Stuart Scientific</td><td>STR6</td><td>Agitateur à plate-forme</td></tr><tr><td>Flacon de culture tissulaire</td><td>BD Falcon</td><td>3175167</td><td>75 cm2</td></tr><tr><td>&nbsp ; Thermomixeur&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3317</td><td>Agitateur de chauffage et de refroidissement à bloc sec</td></tr><tr><td>Tétraméthylbenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860336-100MG</td><td>Grade ELISA</td></tr><tr><td>Vitronectine (Vn) à partir de plasma humain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V8379-50UG</td> grade de <td>culture cellulaire</td></tr></tbody></table>

dosages pour étudier le rôle de la vitronectine dans adhésion bactérienne et la résistance au sérum

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bactéries utilisent le complément régulateurs comme un moyen d’échapper à la réponse immunitaire hôte. Nous décrivons ici les protocoles d’évaluation de l’acquisition de vitronectine de rôle aux fois surface de cellule bactérienne dans la résistance pour le système immunitaire. Expériences de cytométrie de flux identifié la vitronectine plasma humain comme ligand pour la protéine de membrane externe du récepteur bactérien H d’Haemophilus influenzae type f. Un dosage immuno-enzymatique a été utilisé pour caractériser les interactions protéine-protéine purifiée de la protéine recombinante H mettant aux prises la vitronectine et affinité a été évaluée en utilisant l’interférométrie bio-couche. L’importance biologique de la liaison de la vitronectine à H la protéine à la surface des cellules bactériennes à l’évasion de la réponse immunitaire hôte a été confirmée à l’aide d’un test de résistance de sérum avec sérum humain normal et appauvri la vitronectine. L’importance de la vitronectine dans l’adhérence bactérienne a été analysée à l’aide de lames de verre, avec ou sans revêtement de vitronectine, suivie par la coloration de Gram. Enfin, l’adhérence bactérienne aux monocouches de cellules épithéliales alvéolaires humains a été étudiée. Les protocoles décrits ici peuvent être facilement adaptés à l’étude de toutes les espèces bactériennes d’intérêt.

VN-fixation à la surface des bactéries a été déterminée par cytométrie en flux. Hif tous les isolats cliniques testés dans cette étude a recruté Vn à la surface des cellules. Aucune interaction de Vn avec la surface cellulaire a été observée pour la souche de contrôle négatif d’e. coli (Figure 1A). Comme illustré à la Figure 1B, le PH est une protéine liant Vn majeure sur la surface des ...

Ce rapport décrit les protocoles pour caractériser les interactions entre les protéines de membrane externe bactérienne et la vitronectine régulateur de complément humain. Les protocoles peuvent être utilisés pour étudier les réactions de la liaison et la fonction biologique de la vitronectine dans n’importe quelle espèce bactérienne.

Dosages pour étudier le rôle de la vitronectine dans adhésion bactérienne et la résistance au sérum

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’interaction hôte-pathogène, comme la façon dont les pathogènes bactériens causent la maladie chez l’homme en utilisant des protéines humaines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut répondre si un agent pathogène peut utiliser vitronectin pour établir l’infection de l’hôte. Nous nous concentrerons sur vitronectin, une protéine hôte qui prend part à la matrice extracellulaire, mais fonctionne également comme un inhibiteur de complément dans la voie déterminante de l’activation de complément.Ces faits sont très importants et très attrayants pour les agents pathogènes causant des maladies chez l’homme. Pour se préparer à la cytométrie d’écoulement, résuspendez les granulés bactériens avec 50 microlitres de tampon bloquant contenant 250 nanomolaire vitronectin. Ensuite, incuber les échantillons pendant une heure à température ambiante sans trembler.Après l’incubation, pelleter les bactéries par centrifugation à 3500 g pendant cinq minutes. Ensuite, lavez les granulés trois fois à l’aide de PBS et d’étapes de centrifugation similaires. Après le lavage, ajouter 50 microlitres d’anticorps poly

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce protocole est un test simple adhésion bactérienne consistant à compter le nombre de colonies bactériennes formant des unités qui sont collées sur des cellules cultivées. Le test est robuste, indépendante de l'adhésine étudié, et de nombreuses variations sont utilisés dans la plupart des laboratoires travaillant sur la pathogenèse bactérienne.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

Cette vidéo décrit une technique basée sur ELISA qui détecte les interactions protéine-protéine entre deux protéines en mesurant la liaison de la deuxième protéine à la première protéine immobilisée. La deuxième protéine liée est détectée à l’aide d’anticorps spécifiques marqués avec une enzyme, comme la peroxydase de raifort.

Méthode ELISA d’analyse des interactions entre les protéines d’appât et de proie

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test pour étudier le rôle de la vitronectine dans l’adhésion d’Haemophilus influenzae aux cellules épithéliales de l’hôte.

Un test pour étudier le rôle de la vitronectine dans l’adhésion bactérienne aux cellules épithéliales de l’hôte

Cette vidéo démontre le rôle de la vitronectine, une glycoprotéine sérique humaine, sur la résistance bactérienne. Les anticorps présents dans le sérum interagissent avec les protéines de surface bactériennes, activant les protéines du complément et formant le complexe d’attaque membranaire, provoquant la lyse des cellules bactériennes. La liaison de la vitronectine sur la protéine membranaire bactérienne empêche la formation du complexe d’attaque membranaire, ce qui entraîne la survie...

Détermination du rôle de la vitronectine dans la résistance bactérienne à l’activité bactéricide du sérum humain

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test utilisant la microscopie à fluorescence pour détecter l’adhésion des cellules cancéreuses aux pièges extracellulaires des neutrophiles (TNE). Dans les puits d’essai, il y a une augmentation notable du nombre de cellules cancéreuses marquées par fluorescence adhérant aux TNE, tandis que les puits traités avec de la DNase présentent une adhésion réduite des cellules cancéreuses aux TNE.

Essai d’adhésion in vitro pour détecter l’adhérence des cellules cancéreuses aux pièges extracellulaires des neutrophiles

Cette vidéo démontre la détection de l'interaction de la vitronectine avec les protéines de surface bactériennes. L’analyse par cytométrie en flux mesure le signal de fluorescence des anticorps marqués par fluorescence liés à la vitronectine, confirmant sa présence à la surface de la bactérie. Cette technique donne un aperçu des interactions hôte-pathogène et des thérapies potentielles contre les infections bactériennes.

Détection de la liaison de la vitronectine aux surfaces bactériennes à l’aide de la cytométrie en flux

L'adhésion des neutrophiles à l'endothélium activé sur les sites d'infection est une partie intégrante de la réponse inflammatoire de l'hôte. Décrite dans le présent rapport est une analyse de liaison des neutrophiles qui permet...

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

Pour étudier l’interaction des bactéries avec les vaisseaux sanguins sous contrainte de cisaillement, une chambre d’écoulement et un modèle de microscopie intravitale mésentérique in vivo sont décrits qui permettent de disséquer les facteurs bactériens et hôtes contribuant à l’adhésion vasculaire.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

L’attachement bactérien aux cellules hôtes est une étape clé lors de la colonisation et de l’infection de l’hôte. Ce protocole décrit la génération d’adhésines recombinantes couplées à des polymères en tant que matériaux biomimétiques qui permettent d’analyser la contribution des adhésines individuelles à ces processus, indépendamment d’autres facteurs bactériens.

Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

Une méthode est décrite ici pour déterminer l’association et la compétition interrègnes (bactériennes et fongiques) pour l’adhérence aux monocouches de cellules HeLa infectées par le virus. Ce protocole peut être étendu à plusieurs combinaisons de procaryotes, d’eucaryotes et de virus.

Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons

Un protocole détaillé pour l’imagerie de plaquettes migrantes uniques à l’aide de sattaches avidine-biotine fonctionnalisées par RGD avec une densité ajustable est fourni, révélant que les plaquettes génèrent suffisamment de force pour rompre la liaison avidine-biotine.

Un test in vitro pour étudier la migration plaquettaire à l’aide de câbles avidine-biotine fonctionnalisés par RGD

Découvrez les protocoles de cytométrie en flux et d'ELISA pour étudier l'interaction entre la vitronectine humaine et les protéines membranaires bactériennes. Ces méthodes permettent d'analyser le rôle de la vitronectine dans l'adhésion bactérienne et la résistance au sérum.

Dosages pour étudier le rôle de la vitronectine dans adhésion bactérienne et la résistance au sérum

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