Avancée Modèle animal de colorectal métastatique du foie: Techniques d'imagerie et propriétés des métastatiques Clones

L’objectif global de cette approche est de modéliser la colonisation hépatique par des clones tumoraux métastatiques générés par des cancers colorectaux, et d’utiliser ce modèle pour améliorer le diagnostic et le traitement des métastases hépatiques. Les observations cliniques indiquent l’hétérogénéité de la maladie métastatique. Notre modèle offre la possibilité de capturer cette hétérogénéité pour détecter les gènes associés aux maladies oligométastatiques et polymétastatiques.

Et d’utiliser ces connaissances pour améliorer la détection précoce et le traitement des métastases. Le principal avantage de notre technique est que nous utilisons des lignées cellulaires monoclonales doublement marquées dérivées de patients atteints de cancer colorectal, et que nous pouvons observer le développement de métastases hépatiques à la fois in vivo et ex vivo. Les implications de cette technique s’étendent à une thérapie de la maladie métastatique.

Il nous donne la possibilité de tester n’importe quel médicament potentiel avec une estimation quantitative du nombre de lésions métastatiques et de la cinétique de croissance de chaque lésion. Après avoir généré des cellules HCT116 marquées par luciférase tdTomato et préparé des milieux, des réactifs et des instruments, conformément au protocole de texte, plaquez les cellules transspectées aux densités suivantes par puits, en triple, dans des plaques à 96 puits. Après l’incubation des cellules pendant cinq heures, quantifiez les intensités fluorescentes du tdTomato à l’aide d’un système IVIS en démarrant le logiciel d’imagerie sur le bureau.

Cliquez sur le bouton Initialiser pour initialiser le temps d’imagerie, le binning moyen, deux pour F/Stop, 535 pour le filtre d’excitation et 580 pour le filtre d’émission. Placez la plaque à 96 puits sur la station d’imagerie et cliquez sur Acquérir pour lancer l’imagerie. Une fois l’image acquise, dans la palette d’outils, cliquez sur Outils de retour d’intérêt et sélectionnez 12x8 dans l’icône de fente.

Créez des fentes de 12x8 pour couvrir la zone du signal sur l’image de la plaque de 96 puits et cliquez sur l’onglet Mesures. Observez une fenêtre avec le tableau des mesures de retour sur investissement avec des unités de photons par seconde, par stéradian, par centimètre carré. Une fois que les cellules atteignent 70 à 80 % de confluence, environ une heure avant l’injection de la rate, ajoutez 0,05 % de tripsine et 0,53 millimolaire d’EDTA aux cellules pour les dissocier.

Après avoir incubé les cellules pendant trois à cinq minutes, utilisez un volume égal de C-DMEM pour neutraliser la tripsine. Pipetez soigneusement les cultures pour éviter qu’elles ne s’agglutinent, puis utilisez un compteur automatique de cellules pour compter les cellules. Congelez les cellules en suspension dans 1x DBPS à une concentration de 1,2 à 2 x 10 à 6 cellules par 100 microlitres, en pipetant soigneusement pour éviter l’agglutination.

Ensuite, gardez les cellules sur de la glace jusqu’à l’injection, en les remettant parfois en suspension dans le tube. Après avoir administré des analgésiques et anesthésié une souris nue athymique femelle âgée de six à huit semaines selon le protocole textuel, identifiez la rate comme une zone violette visible extérieurement à travers la peau sur le flanc gauche, et faites une incision de huit millimètres sur le flanc gauche sur la peau juste au-dessus de l’organe. Ensuite, soulevez la paroi abdominale et faites une petite incision.

Laissez l’air entrer dans la cavité abdominale afin que les organes internes s’éloignent du site d’incision. Élargissez ensuite l’incision de la paroi abdominale à environ cinq millimètres. Les étapes démontrées pour l’injection sont essentielles pour la procédure.

La fuite de cellules tumorales lors de l’injection peut entraîner des métastases extra-hépatiques. L’injection doit être effectuée lentement, sur une période de 30 à 60 secondes, avec un maximum de 1,5 million de cellules pour prévenir la thrombose veineuse porte. Exposez la rate à l’aide d’un coton-tige pour appliquer doucement une pression autour de l’incision.

Si nécessaire, la graisse pancréatique peut être manipulée doucement pour aider à l’exposition, afin de ne pas blesser la rate. À l’aide d’une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 27, sur une période de 30 à 60 secondes, injectez 100 microlitres de cellules dans l’extrémité de la rate exposée. À la fin de l’injection, placez un micro-clip sur la rate avant de retirer l’aiguille, pour éviter la fuite de la suspension cellulaire injectée, et laissez-la en place pendant cinq minutes.

Cinq minutes après l’injection, utilisez un appareil de cautérisation portatif pour effectuer une splénectomie pour l’hémostase. Commencez par le hile splénique sur la face antérieure en précoagulant la face proximale des vaisseaux avec le tissu adipeux adjacent. Un saignement splénique peut se produire au site d’injection.

Le micro-clip est appliqué sur la rate pour prévenir la fuite de cellules tumorales et pour contrôler les saignements spléniques. Les méthodes d’hémostase peuvent inclure la cautérisation, le maintien de la pression pendant trois à cinq minutes et la ligature par suture si nécessaire. Fermez la paroi abdominale à l’aide d’une suture tressée résorbable 5.0 et d’un seul point horizontal.

Ensuite, utilisez une suture mono-filament non résorbable 4.0 pour fermer la peau, également avec un seul point horizontal. Surveiller l’animal en post-opératoire, selon le protocole textuel. Pour effectuer une imagerie bioluminescente, après avoir anesthésié les souris selon le protocole de texte, injectez par voie intrapéritonéale aux animaux 150 microlitres de luciférine préalablement préparée.

Placez les souris dans un IVIS en position couchée avec des entretoises entre les animaux pour minimiser le signal aux souris adjacentes. Trois minutes après l’injection de luciférine, après avoir initialisé l’IVIS, sélectionnez le luminescent, le temps d’exposition d’une seconde et le binning moyen. Cliquez sur le bouton Acquérir pour démarrer l’imagerie, en vous assurant que l’imagerie est systématiquement effectuée trois minutes après l’injection de luciférine.

Une fois l’image acquise et qu’une fenêtre d’image et une palette d’outils s’affichent, cliquez sur Outils de retour d’intérêt et sélectionnez un nombre compris entre un et cinq dans l’icône circulaire qui correspond au nombre de souris imagées. Pour définir les ROI, encerclez la zone du signal luminescent sur la cavité abdominale de la souris, puis cliquez sur les mesures du ROI en tant qu’unité arbitraire de radiance. Incluez un cercle de retour sur investissement supplémentaire pour l’arrière-plan.

Quatre semaines après l’injection, pour effectuer une tomographie d’imagerie luminescente diffuse, ou DLIT, après avoir initialisé l’IVIS, sélectionnez Assistant d’imagerie, Bioluminescence, et cliquez sur Suivant. Sélectionnez DLIT et cliquez sur Suivant. Sélectionnez Sondes Firefly, puis cliquez sur Suivant.

Sélectionnez Souris pour le sujet de l’image, Auto pour le paramètre d’exposition C-13 centimètres pour le champ de vision et 0,5 centimètre comme type de sujet, puis cliquez sur Suivant. Cliquez ensuite sur le bouton Acquérir pour démarrer l’imagerie. Après avoir acquis une image, sélectionnez l’onglet Reconstruction 3D DLIT, dans l’onglet Analyser, puis cliquez sur Construire pour générer l’image de reconstruction 3D.

Cliquez sur Outils et animation 3D. Ensuite, dans la fenêtre Animation 3D, sélectionnez Spin CCW sur l’axe Y. Cliquez sur Enregistrer et enregistrer pour enregistrer le fichier au format mov.

Pour réaliser une imagerie fluorescente ex vivo, après avoir récolté et disséqué des foies de souris selon le protocole textuel, mesurez les intensités fluorescentes pour chaque colonie tumorale à l’aide de l’IVIS. En sélectionnant Fluorescence, quatre secondes de temps d’exposition, Medium Binning, 2 pour F/Stop, 535 pour le filtre d’excitation et 580 pour le filtre d’émission. Cliquez sur le bouton Acquérir pour démarrer la création d’images.

Après avoir acquis l’image, localisez la fenêtre Image dans la palette d’outils. Cliquez sur Outils de retour sur investissement, puis sélectionnez 1 dans l’icône en forme de cercle. Pour définir les ROI, encerclez la zone de signal des colonies tumorales individuelles sur l’image.

Acquérez un cercle de ROI supplémentaire de l’arrière-plan, puis cliquez sur Mesures de la ROI en tant qu’unité de rayonnement arbitraire. Acquérez un cercle de retour sur investissement supplémentaire de l’arrière-plan. Enfin, effectuez les calculs selon le protocole texte.

Comme le montre ici la bioluminescence, trois semaines après l’injection dans la rate, les clones P1 et P2 de HCT116 L2T présentaient une charge tumorale plus importante, par rapport aux clones O1 et O2. Ces données ont indiqué que les clones O1 et O2 peuvent imiter les maladies oligométastatiques, tandis que P1 et P2 représentent une colonisation métastatique agressive et généralisée du foie. La quantification de la fluorescence ex vivo du foie, à partir de quatre semaines après l’injection dans la rate, a confirmé que P1 et P2 avaient des intensités fluorescentes plus élevées que les foies O1 et O2. Le marquage fluorescent de clones tumoraux a permis d’identifier le nombre et la taille des colonies métastatiques individuelles dans le foie.

Dans l’ensemble, les images fluorescentes ex vivo étaient cohérentes avec les résultats macroscopiques, mais les petites colonies cachées sous la surface ont été mieux détectées par l’imagerie fluorescente. Comme illustré ici, le nombre et la taille des colonies métastatiques ont été comptés et mesurés dans chaque foie, et une imagerie par fluorescence ex vivo a été réalisée sur chaque colonie métastatique pour chaque monoclone. Comme le montrent ces graphiques, le nombre total de métastases dans P1 était plus élevé que dans P2, O1 et O2, tandis que la taille moyenne des colonies individuelles était plus grande dans P2 que dans P1, O1 et O2. Notre modèle fournit une approche pour identifier de nouveaux gènes de persuasion associés à l’hétérogénéité moléculaire des métastases.

Ces gènes peuvent être utilisés comme cibles pour de nouvelles approches de traitement des métastases. Notre modèle peut également être utilisé pour la validation de différents gènes codants et non codants de protéines qui émergent des grandes bases de données cliniques actuelles mais qui ne sont pas encore définis fonctionnellement dans le contexte d’une maladie métastatique. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal, en raison de la délicatesse de la chirurgie animale.

Cependant, avec de la pratique, de bons résultats sont réalisables en peu de temps. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre les directives de la chirurgie animale, de contrôler soigneusement les saignements et d’éviter la fuite de suspension de cellules tumorales.