Name: Avancée Modèle animal de colorectal métastatique du foie: Techniques dimagerie et propriétés des métastatiques Clones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Découvrez un modèle animal de colonisation hépatique par clones tumoraux métastatiques du cancer colorectal. Cette technique d'imagerie quantifie l'hétérogénéité métastatique et identifie les gènes associés aux maladies oligométastatiques et polymétastatiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier le Dr Geoffrey L. Greene (Université de Chicago) pour le plasmide luc2-tdTomato et la lignée cellulaire HCT116, M. Ani Solanki (Centre des ressources animales) pour la gestion de la souris, et le Dr Lara Leoni pour l&#39;assistance avec le DLIT. Quantifications des intensités de fluorescence et de luminescence ont été réalisées dans l&#39;imagerie des ressources de recherche intégrée des petits animaux à l&#39;Université de Chicago sur un spectre IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Ce travail a été soutenu par la Virginie et Fonds Ludwig DK for Cancer Research, la Fondation du cancer du poumon de la recherche (LCRF), la Fondation du cancer de la prostate (PCF), et le Centre de soutien Grant Cancer (P30CA014599). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte de données et l&#39;analyse, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

<ol><li>Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+score+for+predicting+recurrence+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+analysis+of+1001+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases.</a> Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).</li>
<li>Pawlik, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surgical+margin+status+on+survival+and+site+of+recurrence+after+hepatic+resection+for+colorectal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases.</a> Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+Cancer%2C+Systemic+Inflammation%2C+and+Outcome%3A+Staging+the+Tumor+and+Staging+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host.</a> Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).</li>
<li>Veen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Follow-Up+and+Survivorship+After+Completing+Systematic+Surveillance+in+Stage+I-III+Colorectal+Cancer%3A+Who+Is+Still+at+Risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastrointest.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk.</a> J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).</li>
<li>Siegel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).</li>
<li>O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer+survival+rates+with+the+new+American+Joint+Committee+on+Cancer+sixth+edition+staging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging.</a> J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).</li>
<li>House, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+trends+in+outcomes+for+1%2C600+patients+during+two+decades+at+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Surg%22%5BJournal%5D)">Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution.</a> J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).</li>
<li>Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+bioluminescence+imaging+of+colorectal+liver+metastases+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse.</a> J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).</li>
<li>Rajendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+bioluminescent+hepatic+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine bioluminescent hepatic tumour model.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Oshima, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+tumor+clones+with+differential+liver+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging of tumor clones with differential liver colonization.</a> Sci. Rep. 5 (10946), (2015).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Wang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analyses+identify+osteopontin%2C+LAMB3+and+ITGB1+as+critical+pro-metastatic+genes+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer.</a> PLoS One. 8 (2), e55714(2013).</li>
<li>Fidler, I. J., Kripke, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+results+from+preexisting+variant+cells+within+a+malignant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.</a> Science. 197 (4306), 893-895 (1977).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821(2009).</li>
<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis%28es%29+patients+is+associated+with+specific+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141(2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis%28es%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650(2011).</li>
<li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li>
<li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metastatic+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li>
<li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways%3A+Interferon%2FStat1+Pathway%3A+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+gene+15+%28ISG15%29+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).</li>
<li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+men%3A+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le modèle animal présenté dans le rapport actuel est basé sur deux grandes approches. Tout d&#39; abord, afin d&#39;assurer la capacité d&#39;observer des clones métastatiques avec des propensions différentes à coloniser et proliférer dans le foie, un panel de lignées très hétérogènes de cellules monoclonaux a été établie, plutôt que d&#39; un cancer non fractionnée lignée cellulaire établie 12,13. L&#39;approche monoclonal pour le développement de métastases est justifiée par des données génomiques récentes ...

Les patients présentant des métastases hépatiques de cancers colorectaux primaires (CRC) sont caractérisés par un mauvais pronostic. Le taux de survie à 5 ans pour les primaires non métastatiques CRC (stades I - III) est estimée à 75-88% 3,4, alors que les patients présentant des métastases hépatiques (stade IV) ont un taux de survie à 5 ans de seulement 8 - 12% 5 , 6. Cependant, les patients métastatiques constituent un groupe hétérogène, présentant des nombres différents de métastases et des temps de récurrence. Les observations cliniques indiquent que le nombre de métastases (qui peut être proportionnelle à la capacité de coloniser ou de la fréquence de la colonisation) et la taille d&#39;une métastase unique (proportionnelle au taux de croissance locale) sont des facteurs pronostiques indépendants 1,7. En d&#39;autres termes, le succès des clones métastatiques colonisent le foie dépend de deux propriétés principales: leur capacité à croître et à leur capacité à diffuser et à survivre dans le microenvironnement du foie. La conceptiondes modèles cliniques réussis avec la capacité de capturer et de quantifier les propriétés des clones métastatiques peut considérablement améliorer notre compréhension des métastases hépatiques biologie et de fournir un outil efficace pour la conception d&#39;approches thérapeutiques potentielles. Les modèles de métastases hépatiques expérimentales ont été précédemment rapporté 8,9, mais aucun d&#39;entre eux à condition que la capacité de capturer et de décrire les propriétés des clones individuels métastatiques in vivo et ex vivo quantitativement. Ici, nous présentons un nouveau modèle avancé de métastases hépatiques qui comprend la génération de clones tumoraux avec des efficacités différentes de colonisation du foie et des propriétés de croissance. Nous avons employé une combinaison de double marquage des cellules cancéreuses avec la luciférase et la protéine fluorescente tdTomato avec la génération de lignées cellulaires monoclonales qui ont des différences intrinsèques de la capacité métastatique. Dans ce modèle expérimental, les données indiquent que le développement dedes métastases hépatiques peuvent être décrits en termes de fréquence de la colonisation et le temps de doublement (Td), ce qui est cohérent avec les observations cliniques. La nature quantitative de ce modèle rend facilement adoptable pour la découverte de médicaments et à des fins de diagnostic.

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Système d’imagerie</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>124262</td><td>In Vivo Système d’imagerie</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 Logiciel</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>128165</td><td>Logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>VAD-MGX Appareil d’anesthésie de recherche</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>Appareil d’anesthésie par inhalation</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Réactifs de culture cellulaire</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Réactifs de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine, liquide (10 000 unités de pénicilline ; 10 000 &mu ; g streptomycine)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Réactifs de culture cellulaire</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>Réactifs de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Buprenex Injection (0,3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>Chlorhydrate de buprénorphine</td></tr><tr><td>Gemini Cautery System</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Cautérisation à main pour splénectomie</td></tr><tr><td>Micro Clip ; Droit; pression de 70 grammes ; Largeur du clip de 1,5 mm ; Mâchoire de 10 mm</td><td>Instrument chirurgical Roboz</td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip : Instruments d’hémostase après injection de rate</td></tr><tr><td>D-luciférine, sel de potassium</td><td>Goldbio Technology</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciférine sel de potassium</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum réduit Moyen</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>Sérum réduit Compteur</td></tr> de <tr><td>cellules TC20 Compteur de cellules automatisé</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>Compteur de cellules automatique</td></tr><tr><td>Logiciel JMP10&nbsp ;</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>Logiciel d’analyse de données</td></tr><tr><td>BD FACSAria II trieur de cellules</td><td>BD Biocsiences</td><td></td><td>Trieur de cellules</td></tr></tbody></table>

avancée modèle animal de colorectal métastatique du foie: techniques d&#39;imagerie et propriétés des métastatiques clones

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Les patients ayant un nombre limité de métastases hépatiques et de faibles taux de progression peuvent être traités avec succès avec le traitement local des approches 1,2. Cependant, on sait peu sur l&#39;hétérogénéité des métastases hépatiques, et des modèles animaux capables d&#39;évaluer le développement des colonies métastatiques individuels sont nécessaires. Ici, nous présentons un modèle avancé de métastases hépatiques qui permet de visualiser l&#39;évolution quantitative de clones individuels de la tumeur dans le foie et l&#39;estimation de leur cinétique de croissance et l&#39;efficacité de la colonisation. Nous avons généré un panel de dérivés monoclonaux de HCT116 cellules cancéreuses colorectales humaines stablement marquées avec la luciférase et tdTomato et possédant des propriétés de croissance. Avec une injection splénique suivie d&#39;une splénectomie, la majorité de ces clones sont capables de générer des métastases hépatiques, mais avec des fréquences différentes de la colonisation et les différents taux de croissance. Utilisation du Syste In Vivo Imagingm (IVIS), il est possible de visualiser et de quantifier le développement de métastases avec luminescente in vivo et ex vivo de l&#39; imagerie de fluorescence. En outre, Diffuse luminescentes imagerie par tomographie (en DLIT) fournit une distribution 3D des métastases hépatiques in vivo. Ex vivo imagerie de fluorescence des foies prélevés fournit des mesures quantitatives des colonies métastatiques hépatiques individuels, ce qui permet l&#39;évaluation de la fréquence de la colonisation du foie et de la cinétique de croissance des métastases. Étant donné que le modèle est similaire à des métastases hépatiques cliniquement observés, il peut servir en tant que modalité pour détecter les gènes associés à des métastases du foie et pour tester des traitements ablatifs ou un adjuvant potentiel pour une maladie métastatique du foie.

Le but de cette expérience était d&#39;établir un modèle animal cohérent et facilement reproductible avec le potentiel pour la quantification en série de la charge tumorale in vivo métastatique et pour l&#39;estimation de la fréquence de colonisation et de la cinétique de développement de métastases hépatiques de croissance. Les figures 2 à 6, avec des légendes, sont fournis à partir de notre précédente publication sous une licence Creative Commons CC-BY 10...

La capacité des clones métastatiques à coloniser des sites distants dépend de leur capacité de prolifération et/ou de leur capacité à survivre dans le microenvironnement hôte sans prolifération significative. Ici, nous présentons un modèle animal qui permet une visualisation quantitative des deux types de colonisation hépatique par des clones métastatiques.

Avancée Modèle animal de colorectal métastatique du foie: Techniques d&#39;imagerie et propriétés des métastatiques Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

L'objectif général de cette approche est de modéliser la colonisation hépatique par des clones tumoraux métastatiques provenant de cancers colorectaux, et d'utiliser ce modèle pour améliorer le diagnostic et le traitement des métastases hépatiques. Les observations cliniques indiquent l'hétérogénéité de la maladie métastatique. Notre modèle permet de saisir cette hétérogénéité afin de détecter les gènes associés aux formes oligométastatiques et polymétastatiques de la maladie.Et utiliser ces connaissances pour améliorer la détection précoce et le traitement des métastases. Le principal avantage de notre technique réside dans l'utilisation de lignées cellulaires monoclonales doublement marquées, dérivées de patients atteints d'un cancer colorectal, ce qui permet d'observer le développement de métastases hépatiques à la fois in vivo et ex vivo. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des maladies métastatiques.Il nous permet de tester tout médicament potentiel grâce à une estimation quantitative du nombre de lésions métastatiques et de la cinétique de croissance de chaque lésion. Après avoir généré des cellules HCT116 marquées par la luciférase et le tdTomato et préparé les milieux, réactifs et instruments selon le protocole décrit, ensemencez les cellules transfectées aux densités suivantes par puits, en triplets, dans des plaques de 96 puits. Après une incubation des cellules pendant cinq heures, quantifiez les intensités fluorescentes du tdTomato à l’aide d’un système IVIS en démarrant le logiciel d’imagerie sur le bureau.Cliquez sur le bouton Initialiser pour définir le temps d'acquisition, le regroupement du milieu, deux pour l'ouverture, 535 pour le filtre d'excitation et 580 pour le filtre d'émission. Placez la plaque de 96 puits sur la station d'acquisition et cliquez sur Acquérir pour commencer l'acquisition. Une fois l'image acquise, dans la palette d'outils, cliquez sur les outils de région d'intérêt (ROI) et sélectionnez 12x8 à partir de l'icône de fente.Créer 12x8 fentes pour couvrir la zone du signal sur l'image de la plaque de 96 puits et cliquer sur l'onglet Mesures. Observer une fenêtre contenant le tableau des mesures de ROI avec des unités en photons par seconde, par stéradian, par centimètre carré. Une fois que les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 pour cent, environ une heure avant l'injection dans la rate, ajouter 0,05 pour cent de trypsine et 0,53 millimolaire de EDTA aux cellules pour les dissocier.Après avoir incubé les cellules pendant trois à cinq minutes, utilisez un volume équivalent de C-DMEM pour neutraliser la tripsine. Pipetez soigneusement les cultures afin d'éviter les agrégats, puis comptez les cellules à l'aide d'un compteur cellulaire automatique. Congelez les cellules en suspension dans 1x DBPS à une concentration de 1,2 à 2 x 10⁶ cellules par 100 microlitres, en pipetant soigneusement pour éviter les agrégats.Ensuite, maintenir les cellules sur de la glace jusqu'à l'injection, en les resuspendant occasionnellement dans le tube. Après administration d'analgésiques et anesthésie d'une souris nue athymique femelle âgée de six à huit semaines selon le protocole décrit, identifier la rate comme une zone violette visible extérieurement à travers la peau sur le flanc gauche, puis pratiquer une incision de huit millimètres sur la peau du flanc gauche juste au-dessus de l'organe. Ensuite, soulever la paroi abdominale et pratiquer une petite incision.Laisser entrer de l'air dans la cavité abdominale afin que les organes internes s'éloignent du site de l'incision. Ensuite, élargir l'incision de la paroi abdominale à environ cinq millimètres. Les étapes démontrées pour l'injection sont essentielles pour la procédure.La fuite de cellules tumorales pendant l'injection peut entraîner des métastases extra-hépatiques. L'injection doit être réalisée lentement, sur une durée de 30 à 60 secondes, avec pas plus de 1,5 million de cellules afin de prévenir une thrombose de la veine porte. Exposer la rate en utilisant un coton-tige pour appliquer doucement une pression autour de l'incision.Si nécessaire, la graisse pancréatique peut être manipulée délicatement afin de faciliter l'exposition, sans endommager la rate. À l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de 27 g, injecter 100 microlitres de cellules dans l’extrémité de la rate exposée sur une période de 30 à 60 secondes. À la fin de l’injection, poser un clip microchirurgical sur la rate avant de retirer l’aiguille, afin d’éviter toute fuite de la suspension cellulaire injectée, et le laisser en place pendant cinq minutes.Cinq minutes après l'injection, utilisez un dispositif de cautérisation manuel pour effectuer une splénectomie afin d'assurer l'hémostase. Commencez par le hile splénique sur la face antérieure en pré-coagulant le côté proximal des vaisseaux avec le tissu adipeux adjacent. Un saignement splénique peut survenir au site d'injection.Le micro-clip est appliqué sur la rate afin d'éviter toute fuite de cellules tumorales et de contrôler le saignement splénique. Les méthodes d'hémostase peuvent inclure la cautérisation, l'application d'une pression pendant trois à cinq minutes, et la ligature par suture si nécessaire. Fermer la paroi abdominale à l'aide d'une suture tressée absorbable 5,0 et d'un seul point horizontal.Ensuite, utilisez un fil non résorbable monofilament de calibre 4,0 pour fermer la peau, également par un seul point horizontal. Surveillez l'animal après l'intervention conformément au protocole décrit dans le texte. Pour réaliser l'imagerie bioluminescente, après avoir anesthésié les souris selon le protocole décrit dans le texte, injectez intrapéritonéalement aux animaux 150 microlitres de luciférine de luciole préalablement préparée.Placer les souris dans un IVIS en position supine, avec des entretoises entre les animaux afin de minimiser le signal vers les souris adjacentes. Trois minutes après l'injection de luciférine, après avoir initialisé l'IVIS, sélectionner la modalité luminescente, un temps d'exposition d'une seconde et un regroupement moyen. Cliquer sur le bouton Acquérir pour démarrer l'acquisition, en veillant à ce que celle-ci soit systématiquement effectuée trois minutes après l'injection de luciférine.Une fois l'image acquise, et une fenêtre d'image et une palette d'outils apparues, cliquez sur les outils de région d'intérêt (ROI) et sélectionnez un nombre allant de un à cinq sur l'icône circulaire, correspondant au nombre de souris imagées. Pour définir les régions d'intérêt, entourez la zone de signal du signal luminescent dans la cavité abdominale de la souris, puis cliquez sur les mesures de la ROI comme unité arbitraire de radiant flux. Incluez un cercle de ROI supplémentaire pour le fond.Quatre semaines après l'injection, pour effectuer une tomographie d'imagerie luminescente diffuse, ou DLIT, après avoir initialisé l'IVIS, sélectionnez l'Assistant d'imagerie, Bioluminescence, puis cliquez sur Suivant. Sélectionnez DLIT et cliquez sur Suivant. Sélectionnez les sondes Firefly et cliquez sur Suivant.Sélectionnez Souris comme sujet de l'image, Auto pour les paramètres d'exposition, 13 centimètres pour le champ de vision et 0,5 centimètre comme type de sujet, puis cliquez sur Suivant. Ensuite, cliquez sur le bouton Acquérir pour démarrer l'acquisition d'image. Après avoir acquis une image, sélectionnez l'onglet Reconstruction 3D DLIT, dans l'onglet Analyser, puis cliquez sur Reconstruire pour générer l'image de reconstruction 3D.Cliquez sur Outils et Animation 3D. Ensuite, dans la fenêtre Animation 3D, sélectionnez Rotation antihoraire autour de l'axe Y. Cliquez sur Enregistrer et Enregistrer sous pour sauvegarder le fichier au format mov.Pour réaliser un examen d'imagerie fluorescente ex vivo, après avoir prélevé et disséqué les foies de souris conformément au protocole décrit dans le texte, mesurez les intensités fluorescentes de chaque colonie tumorale à l'aide de l'IVIS. Pour ce faire, sélectionnez Fluorescence, un temps d'exposition de quatre secondes, un binning moyen, un F/Stop de 2, un filtre d'excitation à 535 et un filtre d'émission à 580. Cliquez sur le bouton Acquérir pour démarrer l'imagerie.Après avoir acquis l'image, localisez la fenêtre Image dans la palette d'outils. Cliquez sur Outils de région d'intérêt (ROI), puis sélectionnez 1 à partir de l'icône circulaire. Pour définir les régions d'intérêt, entourez la zone de signal de chaque colonie tumorale individuelle sur l'image.Acquérir un cercle supplémentaire de ROI pour le fond, puis cliquer sur Mesures de la ROI comme unité arbitraire de luminance. Acquérir un autre cercle de ROI pour le fond. Enfin, effectuer les calculs conformément au protocole décrit dans le texte.Comme le montre la bioluminescence, trois semaines après l'injection splénique, les clones P1 et P2 de HCT116 L2T présentaient une charge tumorale plus importante par rapport aux clones O1 et O2. Ces données indiquent que les clones O1 et O2 peuvent imiter une maladie oligométastatique, tandis que P1 et P2 représentent une colonisation métastatique hépatique agressive et généralisée. La quantification de la fluorescence *ex vivo* du foie, quatre semaines après l'injection splénique, a confirmé que les foies des clones P1 et P2 présentaient des intensités fluorescentes plus élevées que celles des clones O1 et O2. Le marquage fluorescent des clones tumoraux a permis d'identifier le nombre et la taille des colonies métastatiques individuelles dans le foie.Dans l'ensemble, les images fluorescentes ex vivo étaient cohérentes avec les observations macroscopiques, mais de petites colonies dissimulées sous la surface ont été mieux détectées par imagerie fluorescente. Comme illustré ici, le nombre et la taille des colonies métastatiques ont été comptés et mesurés dans chaque foie, et une imagerie fluorescente ex vivo a été réalisée sur chaque colonie métastatique pour chaque monoclone. Comme le montrent ces graphiques, le nombre total de métastases était plus élevé dans P1 par rapport à P2, O1 et O2, tandis que la taille moyenne des colonies individuelles était plus grande dans P2 que dans P1, O1 et O2. Notre modèle fournit une approche permettant d'identifier de nouveaux gènes de persuasion associés à l'hétérogénéité moléculaire des métastases.Ces gènes peuvent être utilisés comme cibles pour de nouvelles approches thérapeutiques contre les métastases. Notre modèle peut également servir à valider différents gènes codant des protéines et des gènes non codants qui émergent des vastes bases de données cliniques actuelles, mais qui ne sont pas encore fonctionnellement définis dans le contexte des maladies métastatiques. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la délicatesse de la chirurgie animale.Cependant, avec de la pratique, de bons résultats peuvent être obtenus en peu de temps. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se conformer aux directives relatives à la chirurgie animale, de contrôler soigneusement les saignements et de prévenir toute fuite de la suspension de cellules tumorales.

advanced-animal-model-colorectal-metastasis-liver-imaging-techniques

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Deux techniques peuvent être utilisées pour établir ce modèle: l'injection d'une suspension de cellules cancéreuses dans le mur caecal ou la transplantation d'un morceau de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Ce modèle est utile pour étudier l'évolution naturelle du cancer colorectal et le test de nouveaux agents thérapeutiques contre le cancer colorectal.

Modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Cet article décrit une procédure pour l'induction de tumeurs du foie orthotopique chez des souris bioluminescentes, et l'analyse ultérieure de la croissance tumorale limitées au foie en utilisant l'imagerie en direct toute la luminescence du corps.

Modèle murin Bioluminescent tumeurs hépatiques

Les modèles animaux sont fréquemment utilisés pour étudier la métastase du cancer de l'os. Dans ce protocole, nous allons décrire deux méthodes courantes de inoculation de la tumeur pour les études de métastases osseuses et décrire brièvement quelques-unes des analyses utilisés pour surveiller et quantifier ces modèles.

Modèles de métastases osseuses

Cette vidéo décrit le protocole permettant d’établir un modèle murin de métastases spontanées de xénogreffes dérivées de patients atteints de cancer colorectal ou PDX. Ces modèles de xénogreffes imitent partiellement les caractéristiques des carcinomes humains et comprennent les aspects critiques des tumeurs malignes humaines, y compris l’invasion et les métastases.

Modèles murins de métastases spontanées : une plateforme pour étudier le potentiel métastatique des cellules cancéreuses colorectales injectées orthotopiquement

Un modèle murin de métastases hépatiques préclinique réalisée par une technique d'injection de hemispleen.

Un préclinique modèle murin de métastases hépatiques

Une procédure chirurgicale a été mise au point pour délivrer des cellules tumorales mammaires au foie murin par injection dans la veine porte. Ce modèle permet d’étudier les stades tardifs des métastases hépatiques chez un hôte entièrement immunisé, y compris l’extravasation des cellules tumorales, l’ensemencement, la survie et la croissance métastatique dans le foie.

Une injection Modèle Portal Vein pour étudier le foie Métastases du cancer du sein

Nous décrivons l'établissement de tumeurs colorectales orthotopiques par injection de cellules tumorales ou organoïdes dans le cécum des souris et l'isolement subséquent des cellules tumorales circulantes (CTC) de ce modèle.

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Ce protocole décrit la génération des modèles de xénogreffe orthotopic-dérivés du patient en inculquant intra-vesically les cellules de carcinome urothelial de haut grade ou les cellules de cancer colorectal intra-rectally injectant dans le diabétique non-obèse/grave combiné Souris d'immunodéficience (NOD/SCID) pour la croissance primaire de tumeur et les métastases spontanées sous l'influence des cellules stromal de ganglion lymphatique, qui imite la progression des maladies métastatiques...

Modèles de xénogreffe orthopiques dérivés du patient pour le carcinome humain de cellules urotheliales et la croissance de tumeur de cancer colorectal et la métastasie spontanée

Nous décrivons en détail un modèle de tumeur de métastases de foie de cancer côlorectal médicalement pertinent (CRLM) et l'influence de la reperfusion d'ischémie de foie (I/R) dans la croissance de tumeur et la métastase. Ce modèle peut aider à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la promotion induite par la chirurgie de la croissance métastatique du foie.

Modèle de Murine des tumeurs métastatiques de foie dans le cadre des dommages de reperfusion d'ischémie

L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

L’injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal (CCR) génère des métastases hépatiques riches en stroma. Ce modèle murin de métastases hépatiques du CCR représente un outil utile pour étudier les interactions tumeur-stroma et développer de nouvelles thérapies dirigées par le stroma telles que les thérapies géniques médiées par le virus adéno-associé.

Injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal pour étudier la métastase hépatique Stroma

Découvrez un modèle animal de colonisation hépatique par clones tumoraux métastatiques du cancer colorectal. Cette technique d'imagerie quantifie l'hétérogénéité métastatique et identifie les gènes associés aux maladies oligométastatiques et polymétastatiques.

Avancée Modèle animal de colorectal métastatique du foie: Techniques d'imagerie et propriétés des métastatiques Clones

Explorer plus de vidéos