Microglies comme un biocapteur Surrogate pour déterminer Nanoparticules neurotoxicité

L’objectif général de ce protocole est de décrire un biocapteur de substitution in vitro pour tester la réponse microgliale aux nanoparticules. Nous déterminerons ensuite la neurotoxicité suite à une exposition à des milieux conditionnés à partir de microglies stimulées par des nanoparticules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont les nanoparticules sont activement dépistées pour la neurotoxicité.

Le principal avantage de cette technique est que notre modèle offre la possibilité d’activer directement la microglie et de déterminer si les facteurs secrets sont des neurotoxines sans utiliser d’études coûteuses à long terme sur les rongeurs. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la mort cellulaire induite par les microglies après l’exposition aux microparticules. Il peut également être appliqué à d’autres modèles de maladies neurodégénératives dans le cadre de tests de polluants environnementaux neurotoxiques potentiels.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à s’adapter à l’étape de filtration du média. Parce que l’efficacité de la filtration peut différer en fonction de la taille, de la forme et de la concentration des nanoparticules. En préparation, réchauffez le DMEM complété par 10 % FBS et 1 % PSN à 37 degrés Celsius.

Ensuite, prenez des cellules microgliales BV2 congelées obtenues à partir des passages 18 à 25 et décongelez-les rapidement à 37 degrés Celsius. Ensuite, transférez délicatement les cellules décongelées dans une fiole ventilée de 75 centimètres carrés contenant 10 millilitres de milieu et incubez la fiole. Après 24 heures, remplacez le milieu et continuez à faire croître les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 70-80 %À ce stade, aspirez le milieu et ajoutez 500 microlitres de solution chaude de 1 ex trypsine EDTA.

Après avoir laissé le flacon incuber pendant quelques minutes de plus, utilisez un grattoir pour recueillir les cellules en 5 millilitres de DMEM chaud. Filtrez ensuite les cellules du ballon à l’aide d’une passoire de 70 microns. Répétez cette filtration trois fois à l’aide de la même passoire et collectez les cellules dans un tube de 50 millilitres.

Une fois filtrées, comptez les cellules, puis ensemencez une plaque inférieure transparente à paroi noire avec 8000 cellules par puits dans 200 microlitres de DMEM supplémenté. Après 24 heures d’incubation, remplacez le milieu dans les puits par du DMEM sans sérum pour affamer la microglie. Après 24 heures supplémentaires d’incubation, procédez à l’activation de la microglie.

Pour ce faire, diluez d’abord les nanoparticules d’argent dans du DMEM sans sérum à la concentration de travail souhaitée. Remplacez ensuite 100 microlitres de milieu par le composé de traitement. Assurez-vous d’inclure un témoin négatif de la solution diluée du véhicule sans les nanoparticules.

Poursuivez maintenant l’incubation pendant 24 heures et procédez à l’analyse. Pour commencer, prélevez 200 microlitres de milieu surnageant dans chaque puits de plaque et chargez-le sur un filtre qui éliminera les nanoparticules placées sur un micro tube de centrifugation. Il est important de se rappeler que lors de la filtration des nanoparticules, leur taille, leur forme et leur concentration sont un facteur d’efficacité de fusion.

Il est donc conseillé de tester la filtration au préalable. Maintenant, faites tourner les tubes à 14000g à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, jetez le flux qui contient les nanoparticules et placez les filtres à l’envers dans de nouveaux tubes de collecte.

Faites tourner les filtres à l’envers à 1000 g pendant deux minutes pour recueillir un milieu concentré conditionné contenant des cytokines. Ensuite, augmentez le volume de la collection à 400 microlitres avec du DMEM supplémentaire fraîchement préparé et stockez les tubes sur de la glace. Pour s’assurer que les nanoparticules de soufre résiduelles sont éliminées des médias filtrés, préparez des étalons de nanoparticules non filtrées à une gamme de concentration allant d’un blanc à 0,2 microgramme par millilitre dans du DMEM sans sérum.

Ensuite, aliquote 50 millilitres des échantillons filtrés et de chaque étalon dans une plaque inférieure transparente à paroi noire et mesure l’absorbance de 390 à 410 nanomètres. Pour mesurer la concentration de TNF-alpha dans les échantillons, utilisez la moitié de leur volume restant dans un kit disponible dans le commerce. Pour ce test, établissez des cellules hypothalamiques à partir de stocks congelés.

En utilisant les mêmes méthodes que celles décrites pour l’établissement des cultures microgliales. En fin de compte, utilisez-les pour ensemencer des plaques à fond transparent à parois noires avec 5000 cellules par puits dans 200 microlitres de DMEM supplémenté. Après 24 heures de culture, prélever 100 microlitres de milieu et le remplacer par 100 microlitres de milieu filtré et concentré prélevé sur les cultures de cellules microgliales activées, puis incuber la plaque pendant 24 heures dans des conditions standard.

Le lendemain, ajoutez 22 microlitres de réactif de résazurine dans chaque puits et poursuivez l’incubation pendant 20 minutes. Ensuite, à l’aide d’un spectrophotomètre multimode, effectuez une mesure de fluorescence pour estimer la viabilité des cellules en termes d’unités de fluorescence relatives. Avec le protocole décrit, la fonction microgliale peut être utilisée comme biocapteur de substitution pour la réponse du cerveau aux nanoparticules.

sécrétion de TNF-alfa par la microglie a été significativement augmentée après l’exposition à des nanoparticules de ruban adhésif. Lorsque les neurones hypothalamiques ont été exposés à un milieu conditionné à partir de la microglie activée par des nanoparticules d’argent, la viabilité des neurones a été considérablement réduite. En principe, l’exposition aux nanoparticules d’argent a activé la microglie à un état pro-inflammatoire M1.

Ensuite, les cytokines pro-inflammatoires libérées contribuent à la mort cellulaire environnante. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microglie comme biocapteur de substitution pour tester la réponse aux nanoparticules et si cette réponse est neurotoxique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois ou quatre jours si elle est bien exécutée.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage d’autres cytokines sécrétées suite à l’activation microgliale peuvent être effectuées afin de phénotyper les états d’activation microgliale.