Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser des microsphères de poly(acide lactique-co-glycolique) ou PLGA pour délivrer des composés d'intérêt à des îlots pancréatiques entiers en culture, afin d'étudier les effets de composés individuels sur la prolifération des cellules bêta pancréatiques adultes. Cette méthode peut être utilisée pour tester une variété de composés délivrés localement de manière continue à des îlots entiers. Le principal avantage de cette méthode est qu'elle peut être facilement adaptée à d'autres biomatériaux de délivrance, composés d'intérêt et tests d'aboutissement.

Cette méthode présente également un potentiel pour la délivrance de composés d'intérêt en association avec le transfert adoptif d'îlots in vivo. La réalisation des microsphères de PLGA sera démontrée par Taylor Kavanaugh, étudiant diplômé de mon laboratoire. Commencez par ajouter un milligramme du composé d'intérêt marqué de manière fluorescente à 100 microlitres d'eau déionisée afin de former la première phase aqueuse.

Ensuite, dissolvez 65 milligrammes de PLGA dans 750 microlitres de dichlorométhane dans un flacon scintillation, puis soumettez le mélange à une ultrasonication pendant 10 à 30 secondes à 160 watts afin de dissoudre complètement le PLGA. Cela forme la phase huileuse. Ajoutez toute la première phase aqueuse à la phase huileuse de manière goutte à goutte.

Ensuite, utilisez un homogénéisateur portatif pour émulsifier la solution à 20 000 tr/min pendant 30 secondes, formant ainsi la première phase eau-huile. Ajoutez ensuite toute la première phase eau-huile goutte à goutte dans 15 millilitres de solution de PVA à 1 % et émulsifiez comme précédemment indiqué. Transférez ensuite le volume total de l'émulsion dans un ballon à fond rond de 200 millilitres et utilisez un évaporateur rotatif pour éliminer le solvant afin de générer la phase aqueuse sous une pression réduite de 635 millimètres de mercure pendant une heure.

Prélevez un millilitre de la phase aqueuse dans chacun des 14 tubes de microcentrifugation, puis mettez en pellet les microsphères par centrifugation. À la fin de la centrifugation, utilisez une micropipette pour éliminer 900 microlitres de solution aqueuse de chaque tube, en prenant soin de ne pas perturber les pellets. Lavez les microsphères avec un millilitre d’eau désionisée, puis retirez soigneusement 900 microlitres du surnageant.

Ensuite, ajouter 900 microlitres d'eau déionisée aux 100 microlitres restants des surnageants. Ensuite, vortexer brièvement et soniquer pour resuspendre les culots. Après avoir isolé les îlots des animaux expérimentaux d'intérêt, ensemencer 40 îlots appariés visuellement par taille dans un puits d'une plaque de culture tissulaire de 96 puits contenant 200 microlitres de milieu de culture d'îlots.

Le lendemain matin, resuspendre un aliquot de microsphères dans le milieu pré-test de manière à obtenir une concentration finale du composé d'intérêt dans le tube de 10 nanogrammes par microlitre, puis soniquer les microsphères dans un bain d’eau glacée pendant 10 minutes à 160 watts avec des impulsions de 10 secondes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirer soigneusement 100 microlitres de milieu de culture d’îlots de chaque puits sans déloger les îlots, puis incuber les cultures avec 100 microlitres de milieu d’essai contenant les microsphères. Après trois jours, éliminer soigneusement le milieu d’essai de tous les puits sans perturber les îlots, puis laver doucement les îlots deux fois avec 200 microlitres de PBS.

Les îlots adhèrent faiblement à une plaque de 96 puits. Il est donc essentiel de retirer délicatement le milieu et le PBS de chaque puits afin de ne pas déloger accidentellement et jeter les îlots. Après le deuxième lavage, immergez délicatement les îlots dans 100 microlitres de solution de trypsine-EDTA pendant trois minutes à température ambiante, en pipetant doucement après deux minutes.

Transférez le volume total de chaque puits dans des tubes microcentrifuge individuels et ajoutez 400 microlitres de milieu de culture d'îlots à chaque tube pour arrêter la dissociation. Après avoir récupéré les îlots traités par microsphères par centrifugation, utilisez une micropipette pour éliminer délicatement les surnageants et resuspendre les culots dans 200 microlitres de milieu de culture d'îlots frais. Ensuite, centrifugez les îlots dissociés sur des lames de microscope chargées à l’aide d’un cytocentrifugeur.

Après séchage à l'air, dessinez une boîte autour des îlots à l’aide d’un stylo hydrophobe et fixez les cellules dans 75 µL de paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 10 minutes, suivies de deux lavages avec 75 µL de PBS. Après le deuxième lavage, perméabilisez les cellules avec 75 µL de Triton X-100 à 0,2 % dans le PBS pendant 10 minutes, puis effectuez un lavage final avec 75 µL de PBS seul. Pour immunomarquer les îlots, commencez par placer les lames côté cellules vers le haut dans une chambre humide et retirez le PBS.

Ensuite, bloquez la liaison non spécifique avec 75 microlitres de sérum de âne normal à température ambiante. Après une heure, remplacez le sérum par 75 microlitres de l'anticorps primaire d'intérêt pendant une autre heure à température ambiante. À la fin de l'incubation, aspirez soigneusement la solution d'anticorps primaire et lavez les échantillons avec des lavages au PBS de 375 microlitres.

Incubez ensuite les îlots avec 75 microlitres d'anticorps secondaire marqué par immunofluorescence approprié pendant une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, remplacez la solution d'anticorps secondaire par 75 microlitres de Dappy pendant trois minutes, suivis d'un rinçage de cinq minutes dans de l'eau déionisée. À la fin du lavage, déposez une goutte de 100 microlitres de solution de montage à séchage rapide contenant un réactif anti-décoloration sur un couvre-objet en verre, puis retournez une lame de microscope, côté échantillon vers le bas, sur la solution de montage.

La fraction la plus importante de microsphères aura un diamètre compris entre 1 et 10 micromètres, bien que certaines microsphères puissent être plus grandes. Après la dispersion des îlots traités par microsphères intactes de PLGA et leur immunomarquage ultérieur, il est fréquent d'observer des régions de l'échantillon dépourvues de tout marquage entre les cellules, causées par des microsphères intactes qui n'ont pas été complètement éliminées lors des étapes de lavage. Après l'acquisition des images, le pourcentage de cellules positives à l'insuline et à Ki67 peut être quantifié à l'aide d'une analyse d'image par logiciel ou en comptant manuellement le nombre total de cellules marquées.

Le traitement des îlots intacts par des microsphères de facteur de croissance du tissu conjonctif humain recombinant PLGA pendant trois jours, comme vient de l'être démontré, entraîne une augmentation de la prolifération des cellules bêta, ce qui montre que la protéine ne perd aucune de ses fonctions au cours de la fabrication des microsphères. Une fois maîtrisée, cette technique peut produire des résultats en moins d'une semaine si elle est correctement réalisée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que l'effet sur la prolifération des cellules bêta dans votre expérience variera selon le composé d'intérêt et les cinétiques exactes de libération des microsphères produites.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, telles que la cotransplantation de microsphères chargées en composés avec des îlots pancréatiques intacts, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, par exemple si le composé d'intérêt peut induire la prolifération des cellules bêta in vivo. Le PLGA a fait l'objet d'une utilisation antérieure dans des dispositifs et des systèmes de délivrance de médicaments approuvés par la FDA, ce qui en fait un choix judicieux pour les chercheurs et les cliniciens souhaitant délivrer un agent thérapeutique à des tissus ciblés sur une période prolongée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment produire des microsphères en PLGA chargées en composés et comment les administrer à des îlots intacts en culture.

N'oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle appropriés, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.