Name: Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris Ex Vivo Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez l'administration soutenue de mitogènes aux îlots pancréatiques intacts de souris ex vivo en utilisant des microsphères biodégradables PLGA. Cette méthode permet d'étudier la prolifération des cellules bêta et ouvre des perspectives pour les thérapies contre le diabète.

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Les auteurs tiennent à remercier Bethany Carboneau (Université Vanderbilt) pour la lecture critique de ce manuscrit. Nous remercions également Anastasia Coldren (Centre médical de l’Université Vanderbilt, Approvisionnement et analyse des îlots) pour l’isolement des îlots, ainsi que le Dr Alvin C. Powers (Centre médical de l’Université Vanderbilt) et le Dr David Jacobson (Université Vanderbilt) pour l’utilisation de leur centrifugeuse et de leur installation de culture tissulaire. Cette recherche a impliqué l’utilisation de la carotte d’approvisionnement et d’analyse des îlots du Centre de recherche et de formation sur le diabète Vanderbilt, soutenue par une subvention des NIH DK20593. Ce travail a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’American Heart Association (14POST20380262) à R.C.P., et des subventions de la Fondation de la recherche sur le diabète juvénile (1-2011-592) et du ministère des Anciens Combattants (1BX00090-01A1) à M.A.G.

Toutes les procédures ont été approuvées et effectuées en conformité avec le Comité des soins et l&#39;utilisation des animaux institutionnels Vanderbilt. 1. Étiquetage COI avec fluorophore (Facultatif) <ol><li> Choisir un colorant fluorescent qui réagira avec une amine primaire libre (par exemple, une protéine), tels que des esters de succinimidyle ou des dérivés de la fluorescéine, pour visualiser le fret microsphère. Dissoudre un excès molaire 8x (par rapport aux moles de conflits d&#39;intérêts) de fluorophores dans 200 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO). </li><li> Remettre en suspension 50 mg de CDA jusqu&#39;à un volume final de 800 ul dans une solution de véhicule (concentration finale de 62,5 ng / ul). La solution de véhicule variera en fonction de la source de conflits d&#39;intérêts. REMARQUE: Les solutions de véhicules typiques comprennent une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou du DMSO. </li><li> Ajouter toute la solution fluorophore / DMSO de l&#39;étape 1.1 et resuspendre le COI. Vortex nuit à 4 ° C. En variante, vortexer le mélange réactionnel à la température ambiante(TA) pendant 4 h. </li><li> Après la réaction de marquage, éliminer l&#39;excès de fluorophore en utilisant une colonne de dessalage. <ol><li> Égoutter tampon de stockage de la colonne de dessalage et rincer avec 16 ml d&#39;eau déminéralisée. Jetez tous les flux à travers. </li><li> Ajouter la communauté d&#39;intérêt marqué par fluorescence à la colonne de dessalage. Eluer avec 1,2 ml d&#39;eau déminéralisée et de recueillir l&#39;écoulement à travers. </li><li> l&#39;étape d&#39;élution, une répétition de quatre fois supplémentaires, chaque fois que l&#39;ajout de 1,2 ml d&#39;eau déminéralisée et on collecte l&#39;écoulement à travers un échantillon séparé. </li><li> Geler tous les flux collectés à travers des échantillons à -80 ° C et lyophilisé selon les instructions du fabricant pour 24 heures. </li></ol></li></ol> 2. COI chargé Microsphère Préparation par l&#39;eau d&#39; eau dans l&#39;huile dans l&#39;émulsion de solvant d&#39; évaporation Méthode <ol><li> Ajouter 1 mg de marquage fluorescent CI 100 pi d&#39;eau déminéralisée pour former la première phase aqueuse (W1). </li><li> Dissoudre 65 mg de poly (aci lactique-co-glycoliqued) (50:50 lactide: glycolide, poids moléculaire 54.000 - 69.000) dans 750 ul de dichlorométhane dans un tube à centrifuger. Ultrasonicate pendant 10 - 30 s (à 160 W) pour dissoudre complètement le PLGA. Ceci constitue la phase huileuse (O). </li><li> Ajouter la totalité de la phase W1 générée à l&#39;étape 2.1 vers la phase S d&#39;une manière goutte à goutte. Emulsionner en utilisant un homogénéisateur à main à 20.000 tours par minute pendant 30 secondes pour former la phase W1 / O. </li><li> Ajouter la totalité de la phase d&#39;entrée / sortie W1 d&#39;une manière goutte à goutte à 15 ml d&#39;un mélange 1% (poids / volume) aqueuse de poly (alcool vinylique) (PVA) et émulsionner à l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur à main à 20 000 tpm pendant 30 secondes . </li><li> Transférer la totalité de l&#39;émulsion générée à l&#39;étape 2.4 à 200 ml d&#39;un ballon à fond rond et sous un vide de Hg 635 mm en utilisant un évaporateur rotatif pendant 1 heure pour éliminer le solvant et produire la phase aqueuse. </li><li> Aliquote de 1 ml de la phase aqueuse générée à l&#39;étape 2.5 à quatorze des microtubes. Centrifuger la solution aqueuse dans des tubes à centrifuger à 7500xg pendant 8 min. Remarque: Lors de cette étape, les microsphères sont présentes dans la solution aqueuse restante et on concentre à la partie inférieure du microtube. </li><li> enlever soigneusement 900 ul d&#39;une solution aqueuse à partir des microtubes avec une micropipette, de pipetage de manière à ne pas perturber les microsphères sur le fond du tube à centrifuger. <ol><li> Laver les microsphères d&#39;excès PVA en ajoutant 1 ml d&#39;eau déminéralisée à chaque tube de microcentrifugeuse. Centrifuger à 7500 g pendant 8 min, puis à nouveau retirer avec soin 900 ul d&#39;une solution aqueuse à partir des microtubes avec une micropipette, pipetage de manière à ne pas perturber les microsphères sur le fond du tube à centrifuger. NOTE: La 100 solution aqueuse ul restante contient les microsphères produites. </li></ol></li><li> Congeler la solution aqueuse de microsphère générée à l&#39;étape 2.7 à -80 ° C. </li><li> lyophiliser les microsphères en utilisant un lyophilisateur selon fabricantinstructions et conserver à -20 ° C. REMARQUE: mesurer l&#39; efficacité du chargement du CI en dissolvant totalement microsphères de PLGA et la détermination de la concentration en protéine par rapport à une courbe standard de la protéine libre 7. </li><li> Comme témoin négatif, générer un lot de microsphères &quot;blanc&quot; (ci-après sous forme de microsphères de contrôle). REMARQUE: La production de microsphères de contrôle est identique à la génération de microsphères hydrophiles CI chargées, sans ajout de conflits d&#39;intérêts 800 ul de la solution de véhicule à l&#39;étape 1.2. particules de contrôle du match en concentration massique de PLGA par rapport à des microsphères de PLGA COI-chargées pour le dosage de mitogène β-cellulaire. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;Islet Milieux de culture et médias pré-test <ol><li> Préparer 200 ml de milieu pour la culture des îlots de souris intactes: milieu RPMI 1640 supplémenté avec du glucose 11 mM, du sérum de cheval à 10%, 100 U / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de streptomycine (appelé ci-après estlaisser les milieux de culture). NOTE 1: A la différence de sérum bovin fœtal (FBS), du sérum de cheval n&#39;a pas lactogène placentaire, un inducteur de la prolifération des cellules β, qui confond l&#39;analyse dans le test de prolifération. NOTE 2: Comme les microsphères de PLGA ne sont pas stérilisés avant l&#39;utilisation, l&#39;ajout d&#39;antibiotiques pour les milieux de culture est essentielle pour éviter la contamination microbiologique. </li><li> Retirer 25 ml d&#39;îlots milieux de culture avec une pipette électronique et dans un tube conique de 50 ml. Supplément de 25 ml de milieux de culture des îlots dans le 50 ml tube conique avec une concentration finale de 0,2 mM EGTA pour générer les médias pré-test. REMARQUE: L&#39;ajout d&#39;EGTA desserre légèrement contacts cellule-cellule des îlots sans modifier l&#39;architecture des îlots. Cela permet d&#39;assurer la COI peut atteindre les cellules internes de l&#39;îlot et aide à prévenir la nécrose de l&#39;îlot central. </li></ol> 4. Ensemencement de Intact Islets Souris <ol><li> Isoler îlots intacts d&#39;une souche pré-sélectionnée, le sexe, age, et le génotype de souris après une digestion de collagénase de routine du 8,9 du pancréas. Piscine îlots ensemble à partir comme des échantillons. </li><li> Aliquoter 40 îlots dans un puits d&#39;une plaque à 96 puits de culture de tissu dans 200 ul de milieu de culture des îlots. Visuellement îlots taille-match par puits (une évaluation précise de l&#39;îlot d&#39;équivalence (IEQ) entre les échantillons ne sont pas nécessaires). Remplir les puits vides immédiatement adjacents à des puits avec des îlots avec 200 pi d&#39;eau stérile pour fournir un tampon d&#39;évaporation. Culture d&#39; îlots dans les médias durant la nuit à 37 ° C sous une atmosphère de 95% d&#39; air et 5% de CO 2. </li></ol> 5. Re-suspension de COI-chargés et Microsphères contrôle PLGA <ol><li> Après la récupération des îlots du jour au lendemain, remettre les microsphères en ajoutant un support pré-test à une aliquote de lyophilisés microsphères de PLGA COI chargées de telle sorte que la concentration finale du COI dans le tube à centrifuger est de 10 ng / pl (la quantité de COI présent dans une quantité donnée de les micros générésPhérès a été déterminée à l&#39;étape 2.9). Soniquer les microsphères COI-chargées remises en suspension dans un bain d&#39;eau glacée pendant 10 min à 160 W avec 10 sec impulsions longues à 4 ° C. </li><li> contrôle de Resuspendre microsphères de PLGA en ajoutant le même volume de milieu de pré-test pour une masse égale de contrôle lyophilisé microsphères de PLGA. Soniquer les remises en suspension des microsphères de contrôle PLGA dans un bain d&#39;eau glacée pendant 10 min à 160 W avec 10 sec impulsions longues à 4 ° C. </li><li> Visuellement confirment les microsphères sont dispersées par pipetage 2 pi de microsphères remises en suspension entre deux lamelles de verre. Visualisez les microsphères en utilisant un objectif 40X sur un épifluorescence ou fond clair microscope. </li><li> Si agrégation significative de microsphères est encore visible, sonication dans un bain d&#39;eau glacée pendant 10 min supplémentaires à 160 W avec 10 sec impulsions longues à 4 ° C et répéter la visualisation des microsphères remises en suspension. </li></ol> 6. Traitement des Ilots avec COI-chargées ou contrôle PLGA Microsphères &lt;/ P&gt; <ol><li> Pour chaque puits à traiter avec des microsphères chargées COI, préparer des milieux d&#39;essai en diluant la 10 ng / ul des microsphères COI remis en suspension avec un support pré-essai à un volume final de 100 pl et une concentration finale prédéterminée. REMARQUE: La concentration finale optimale de la protéine variera pour chaque CI utilisée pour cet essai. Idéalement, une gamme de concentrations finales sont testées. </li><li> Pour chaque puits à être utilisé en tant que témoin, préparer des milieux d&#39;essai de contrôle par dilution remis en suspension les microsphères de PLGA de commande générées à l&#39;étape 5.2 avec le même volume de dilution pour diluer les microsphères chargées CI à l&#39;étape 6.1. NOTE: Islets traités avec les médias d&#39;essai de contrôle servira de témoin négatif pour permettre la détection de tout effet les microsphères vides peuvent avoir sur les résultats expérimentaux. </li><li> enlever soigneusement 100 ul de milieu de culture d&#39;îlots de chaque puits avec une micropipette de sorte qu&#39;aucun îlots sont délogés des puits. Ajouter délicatement 100 μl de milieu d&#39;essai ou 100 pi de milieu d&#39;essai témoin à chaque puits. </li><li> Incuber îlots à 37 ° C sous une atmosphère de 95% d&#39; air et 5% de CO 2 pendant trois jours. </li></ol> 7. Dispersion Islets quel sur Microscope Slides <ol><li> Après trois jours, utiliser une micropipette pour enlever soigneusement et jeter les médias d&#39;essai de tous les puits afin de ne pas déloger les îlots. Ajouter délicatement 200 ul de PBS à des îlots pour les laver des médias d&#39;essai. Retirez délicatement et jeter PBS avec une micropipette et laver délicatement îlots à nouveau avec un 200 pi supplémentaires PBS. </li><li> Retirer et jeter PBS avec une micropipette et ajouter 100 ul de 0,025% de trypsine, solution 2 mM EDTA. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Pipet îlots dans la solution de trypsine-EDTA monter et descendre toutes les 2 min jusqu&#39;à ce que les îlots sont confirmées visuellement pour être dispersés dans des cellules individuelles (à noter que certains petits amas de cellules peuvent encore être présentes) à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. Transférer la totalité du volume de chaque puits individuelly dans des tubes de microcentrifugation labeled-. </li><li> Ajouter 400 ul de milieu de culture d&#39;îlots à chaque microtube pour arrêter la cellule de dissociation induite par la trypsine. </li><li> Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 100 x g à 4 ° C pour sédimenter les cellules des îlots au fond des tubes de microcentrifugation. </li><li> Retirez délicatement le surnageant à l&#39;aide d&#39;une micropipette, et remettre le culot dans 200 milieux de culture d&#39;îlots ul frais. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cyto-centrifugeuse, centrifugeuse dissociée îlots à 140 xg pendant 3 min sur des lames de microscope chargées. </li><li> Air slides sec à la température ambiante pendant 10 min, puis dessiner une boîte autour des îlots dissociées avec un marqueur hydrophobe. </li><li> Fixer les cellules avec 75 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) à température ambiante pendant 10 min. Retirer 4% PFA et laver en douceur les cellules dans 75 ul de PBS deux fois. Après lavage, on perméabiliser les cellules avec 75 pi de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min. Ensuite, laver les cellules avec 75 pi de PBS. Attention: PFA est connu pour être allergéniques, cancérigènes et toxiques. </li></ol&gt; 8. immunofluorescence Étiquetage des dissociées Islets pour l&#39;insuline et la prolifération des cellules Marker, Ki67 <ol><li> Préparer une chambre humide en plaçant deux serviettes en papier mouillées dans le fond d&#39;une boîte de glissement capacité de microscope 100 coulissant. </li><li> Placer les lames plates vers le bas (cellules vers le haut) dans la chambre humide. Préparer des échantillons pour l&#39;étiquetage par l&#39;aspiration du PBS à partir de l&#39;étape de lavage précédente à l&#39;aide d&#39;une micropipette et en ajoutant 75 pi de solution de blocage (5% normal d&#39;âne sérum (PDN) dans du PBS) dans chaque glissière pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps aux spécimens. Incuber les lames dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Solution doucement blocage aspirât à l&#39;aide d&#39;une micropipette et d&#39;ajouter 75 ul de solution d&#39;anticorps primaire contenant de Guinée porc anticorps anti-Ki67 anti-insuline et de lapin, dilué à 1 pg / ml dans 5% PDN dans du PBS. Incubation à température ambiante pendant 1 heure. REMARQUE: Les autres marqueurs de prolifération cellulaire comprennent la prolifération cellulaire antigène nucléaire (PCNA) et phosphohistone H3 (PH3), </li><li> Aspirer doucement la solution d&#39;anticorps primaire à l&#39;aide d&#39;une micropipette et rincer les cellules avec 75 pi de PBS. Aspirer PBS en utilisant une micro-pipette et rincer les cellules à deux reprises, chaque fois avec 75 ul de PBS. Incuber chaque échantillon avec 75 ul de l&#39;anti-cochon Guinée Cy5 et un anticorps secondaire anti-lapin de l&#39;anticorps secondaire Cy3 dilué à 2 pg / ml dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante. NOTE: Ne pas utiliser des anticorps secondaires marqués avec le même ou spectralement chevauchement fluorophore qui a déjà été utilisé pour marquer les microsphères. </li><li> une solution d&#39;anticorps secondaire aspirât à l&#39;aide d&#39;une micropipette et incuber dans 75 ul de 300 nM DAPI dans du PBS pendant 3 min à température ambiante. Aspirer DAPI en utilisant une micropipette et rincer à l&#39;eau désionisée pendant 5 min. </li><li> Aspirer doucement l&#39;eau à partir d&#39;échantillons à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Repérer une goutte (environ 100 pi) de solution de montage à séchage rapide contenant antifade réactif sur une lamelle de verre. Inversez le côté microscope de l&#39;échantillon de glisser vers le bas, onto la solution de montage. Appuyez doucement sur la lamelle contre la diapositive à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette pour éliminer les bulles et essuyer l&#39;excès de liquide avec un tissu de nettoyage doux. Laisser sécher les lamelles nuit à TA. </li></ol> Acquisition et analyse 9. image <ol><li> Utilisez un microscope à épifluorescence avec un appareil photo ci-jointe pour l&#39;acquisition d&#39;images. Pour chaque fluorophore, déterminer le temps optimal d&#39;exposition (typiquement 20 msec pour DAPI, 40 - 80 msec pour l&#39;insuline, et 250 msec pour Ki67). Assurez paramètres d&#39;acquisition d&#39;image sont égales pour tous les échantillons. </li><li> Pour chaque échantillon, comptez manuellement 3.000 cellules productrices d&#39;insuline positive et de ceux compter combien sont aussi Ki67 positifs. Comptez seulement les cellules productrices d&#39;insuline positives qui ont un noyau bien défini et clairement visible. Calculer le pourcentage de prolifération des cellules ß pour chaque échantillon en divisant le nombre de cellules Ki67-positives / insuline-positif par le nombre total de cellules productrices d&#39;insuline positive et en multipliant par 100. </li><li> Après déterminer le pourcentage de prolifération des cellules ß pour chaque échantillon, déterminer si une différence statistiquement significative dans la prolifération des cellules β existe entre le contrôle et les échantillons expérimentaux en analysant les résultats d&#39;une ANOVA à sens unique en utilisant le logiciel statistique disponible dans le commerce. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;étude de la prolifération β-cellulaire dans la culture est généralement entravée par plusieurs difficultés. Tout d&#39;abord, les lignées cellulaires immortalisées-β sont caractérisés par des degrés de prolifération que ce qu&#39;on trouve dans les cellules ß des îlots endogènes vivants supérieurs. En outre, ces lignées cellulaires immortalisées manquent de l&#39;architecture normale critique pour la fonction β-cellulaire normale. Ces deux faits font qu&#39;il est difficile de déterminer si les résultats obtenus e...

les cellules ß pancréatiques sont les seules cellules productrices d&#39;insuline dans le corps et sont essentiels pour maintenir l&#39;homéostasie du glucose sanguin. Bien que les individus en bonne santé ont une masse β-cellulaire suffisante et fonctionnent pour réguler correctement la glycémie, les personnes atteintes de diabète sont caractérisées par la masse β-cellulaire insuffisante et / ou de la fonction 1,2. Il a été proposé que l&#39; induction de la prolifération des cellules β peut finalement augmenter la masse β-cellulaire et de rétablir l&#39; homéostase du glucose chez les personnes atteintes de diabète 3. Toutefois, l&#39;évaluation et la validation des β-cellulaires composés prolifératives potentiels dans les îlots intacts est nécessaire avant des traitements efficaces peuvent être développées. La transplantation d&#39;îlots humains cadavériques dans les individus atteints de diabète restaure le sang homéostasie du glucose pendant un certain temps, mais la disponibilité et le succès de cette procédure expérimentale est entravée par un manque d&#39;îlots humains disponibles pour la transplantation et par la mort des cellules ß dans les îlots arrièreer greffe 4. Même avec la découverte de facteurs qui induisent la multiplication des cellules productrices d&#39;insuline, un défi majeur existe encore dans la prestation de ces facteurs à des sites pertinents in vivo. Une stratégie pour une délivrance locale prolongée de composés β-proliférative cellulaire est l&#39;acide poly (lactique-co-glycolique) (PLGA). PLGA a une histoire d&#39;utilisation dans la FDA a approuvé des produits d&#39;administration de médicaments en raison de son haut niveau de sécurité, la biodégradabilité et la cinétique de libération prolongée 5. Plus précisément, le PLGA est un copolymère de lactide et de glycolide qui se dégrade par hydrolyse avec de l&#39; eau , soit in vivo ou dans une culture en acide lactique et acide glycolique, qui sont des métabolites présents naturellement dans l&#39;organisme. Le composé de médicament encapsulé peut être libéré dans l&#39;environnement à la fois par diffusion et / ou des mécanismes de libération dégradation contrôlée. Encapsulage de CI procure une protection contre la dégradation enzymatique, à améliorer la biodisponibilité du réactif par rapport à unencapsulated COI 5. Nous suggérons que les microsphères de PLGA peuvent être utilisées pour administrer les composés candidats à des îlots intacts dans la culture, et finalement in vivo. Tester l&#39;efficacité de PLGA pour administrer des mitogenes de cellules β d&#39;îlots ex vivo est essentiel avant que les protocoles de transplantation sont explorées. À l&#39;heure actuelle, il n&#39;y a pas de technique pour mesurer la prolifération des cellules β chez les animaux vivants. Des expériences visant à évaluer l&#39; efficacité des composés prolifératives potentiels in vivo nécessitent donc l&#39; administration de ces composés aux animaux vivants, à la dissection ultérieure et le traitement des pancreata pour immunomarquage. Ces protocoles sont coûteux et laborieux, et exigent le composé à être administrés par voie systémique, sans aucune garantie qu&#39;ils atteindront les îlots. A l&#39;inverse, plusieurs lignées cellulaires immortalisées-β sont disponibles pour l&#39;étude des cellules productrices d&#39;insuline dans la culture, mais ces lignées cellulaires manquent de l&#39;architecture de l&#39;îlot et environment trouvée dans les organismes vivants 6. Β-lignes cellulaires immortalisées sont également caractérisés comme ayant un degré beaucoup plus élevé de la réplication de cellules ß endogène in vivo, ce qui complique l&#39; analyse des composés qui induisent la prolifération. Dans cette étude, nous décrivons un protocole qui utilise des îlots intacts isolés à partir de souris adultes. Contrairement aux lignes β-cellulaires, îlots intacts conservent l&#39;architecture d&#39;îlots normal. De même, contrairement aux expériences menées in vivo, l&#39; administration des composés prolifératifs directement à îlots intacts de culture réduit de manière significative la quantité de réactifs nécessaire pour mesurer avec précision la prolifération des cellules β. L&#39;étude actuelle utilise PLGA pour administrer un conflit d&#39;intérêts, dans cet exemple, le facteur de croissance du tissu humain recombinant (rhCTGF). La méthode décrite ici confère un avantage significatif sur l&#39;administration du composé brut à des îlots de culture, car elle permet une libération continue du composé dans emédias électroniques. En particulier, ce test peut être modifié pour administrer une grande variété de protéines et d&#39;anticorps d&#39;intérêt pour les îlots intacts. Effets sur d&#39;autres types de cellules endocrines, y compris les cellules alpha, peuvent également être analysées.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Acide carboxylique, ester succinimidylique, isomère 6</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>Pour l’étiquetage des conflits d’intérêts avec le fluorophore</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Pour dissoudre le fluorophore à l’étape 1</td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage-10 jetables</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Colonne de dessalage utilisée à l’étape 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, poly(D,L-lactide-co-glycolide), terminaison ester, poids moléculaire 54 000 - 69 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Utilisé dans la génération de microsphères à l’étape 2</td></tr><tr><td>Poids moléculaire du poly(alcool vinylique) 89 000 - 98 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Utilisé dans la génération de microsphères à l’étape 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>Pour l’élevage des îlots de lycane</td></tr><tr><td>Dextrose anhydre</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Supplément pour milieux d’îlots pancréatiques</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotiques pour milieux d’îlots pancréatiques</td></tr><tr><td>Sérum normal de cheval</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Supplément pour milieux d’îlots de Langerhans</td></tr><tr><td>Plaque de culture de tissus à 96 puits</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Pour l’élevage d’îlots</td></tr><tr><td>Éthylène glyco-bis(2-aminoéthyléther )-N,N,N',N'-acide tétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Supplément pour milieux de pans pancréatiques</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Cytocentrifuge Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Pour la rotation de cellules sur des lames de microscope</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>Pour la rotation de cellules sur des lames de microscope</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Utilisé dans la dissociation des îlots de Langerhans</td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Pour la fixation des cellules</td></tr><tr><td>Triton&nbsp ; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>Pour la perméabilisation des cellules</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Réactifs bloquants pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Ki67</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>Pour l’immunofluorescence Ki67</td></tr><tr><td>Polyclonal Cobaye Anti-insuline</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Pour l’immunofluorescence de l’insuline</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Pour l’immunofluorescence Ki67</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>Pour l’immunofluorescence de l’insuline</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Pour la visualisation des noyaux en immunofluorescence</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Média de montage à séchage rapide</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &deg ; C 4,5 litres Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>Pour la lyophilisation des microsphères</td></tr></tbody></table>

administration soutenue de mitogenes β-cellules à intact islets souris<em&gt; ex vivo</em&gt; utilisation biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) microsphères

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Le développement de biomatériaux a augmenté de manière significative le potentiel de délivrance de médicament ciblant une variété de types de cellules et de tissus, y compris les cellules ß pancréatiques. En outre, biomatériaux particules, hydrogels et échafauds fournissent également une occasion unique pour administrer soutenue, l&#39;administration de médicaments commandable pour ß-cellules en culture et dans des modèles de tissus transplantés. Ces technologies permettent l&#39;étude des facteurs de prolifération des cellules β candidat en utilisant des îlots intacts et un système de translation correspondant. En outre, la détermination de l&#39;efficacité et la faisabilité des facteurs candidats pour stimuler la prolifération des cellules β dans un système de culture est essentielle avant de passer à des modèles in vivo. Nous décrivons ici une méthode de co-culture des îlots de souris intactes avec un composé biodégradable d&#39;intérêt (COI) de poly chargé en (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) microsphères dans le but d&#39;évaluer les effets de durable in situ la libération oLes facteurs mitogenes f sur la prolifération des cellules β. Cette technique décrit en détail comment générer des microsphères de PLGA contenant un chargement souhaité en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce. Bien que la technique décrite utilise le facteur humain recombinant conjonctifs de croissance du tissu conjonctif (rhCTGF) à titre d&#39;exemple, une grande variété de conflits d&#39;intérêts pourrait facilement être utilisé. En outre, ce procédé utilise des plaques à 96 puits pour réduire au minimum la quantité de réactifs nécessaires pour évaluer la prolifération des cellules β. Ce protocole peut être facilement adaptée à l&#39;utilisation de biomatériaux et d&#39;autres caractéristiques alternatives de cellules endocrines telles que la survie cellulaire et l&#39;état de différenciation.

La figure 1 est une représentation visuelle des microsphères produites en utilisant le protocole ci - dessus. Le protocole décrit ici, on obtient des microsphères chargées rhCTGF de différentes tailles. La plus grande partie des microsphères est compris entre 1 et 10 um de diamètre, bien que certaines microsphères peuvent être plus grandes (figure 2). Si cela est souhaité, la taille de la microsphère peut être réglé et optimisé en foncti...

Ici, nous présentons une méthodologie pour générer et administrer un composé de microsphères poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) chargées d’intérêt à des îlots de souris intacts en culture, avec analyse ultérieure par immunofluorescence de la prolifération des cellules β. Cette méthode convient pour déterminer l’efficacité des mitogènes β cellules candidates.

Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser des microsphères de poly(acide lactique-co-glycolique) ou PLGA pour délivrer des composés d'intérêt à des îlots pancréatiques entiers en culture, afin d'étudier les effets de composés individuels sur la prolifération des cellules bêta pancréatiques adultes. Cette méthode peut être utilisée pour tester une variété de composés délivrés localement de manière continue à des îlots entiers. Le principal avantage de cette méthode est qu'elle peut être facilement adaptée à d'autres biomatériaux de délivrance, composés d'intérêt et tests d'aboutissement.Cette méthode présente également un potentiel pour la délivrance de composés d'intérêt en association avec le transfert adoptif d'îlots in vivo. La réalisation des microsphères de PLGA sera démontrée par Taylor Kavanaugh, étudiant diplômé de mon laboratoire. Commencez par ajouter un milligramme du composé d'intérêt marqué de manière fluorescente à 100 microlitres d'eau déionisée afin de former la première phase aqueuse.Ensuite, dissolvez 65 milligrammes de PLGA dans 750 microlitres de dichlorométhane dans un flacon scintillation, puis soumettez le mélange à une ultrasonication pendant 10 à 30 secondes à 160 watts afin de dissoudre complètement le PLGA. Cela forme la phase huileuse. Ajoutez toute la première phase aqueuse à la phase huileuse de manière goutte à goutte.Ensuite, utilisez un homogénéisateur portatif pour émulsifier la solution à 20 000 tr/min pendant 30 secondes, formant ainsi la première phase eau-huile. Ajoutez ensuite toute la première phase eau-huile goutte à goutte dans 15 millilitres de solution de PVA à 1 % et émulsifiez comme précédemment indiqué. Transférez ensuite le volume total de l'émulsion dans un ballon à fond rond de 200 millilitres et utilisez un évaporateur rotatif pour éliminer le solvant afin de générer la phase aqueuse sous une pression réduite de 635 millimètres de mercure pendant une heure.Prélevez un millilitre de la phase aqueuse dans chacun des 14 tubes de microcentrifugation, puis mettez en pellet les microsphères par centrifugation. À la fin de la centrifugation, utilisez une micropipette pour éliminer 900 microlitres de solution aqueuse de chaque tube, en prenant soin de ne pas perturber les pellets. Lavez les microsphères avec un millilitre d’eau désionisée, puis retirez soigneusement 900 microlitres du surnageant.Ensuite, ajouter 900 microlitres d'eau déionisée aux 100 microlitres restants des surnageants. Ensuite, vortexer brièvement et soniquer pour resuspendre les culots. Après avoir isolé les îlots des animaux expérimentaux d'intérêt, ensemencer 40 îlots appariés visuellement par taille dans un puits d'une plaque de culture tissulaire de 96 puits contenant 200 microlitres de milieu de culture d'îlots.Le lendemain matin, resuspendre un aliquot de microsphères dans le milieu pré-test de manière à obtenir une concentration finale du composé d'intérêt dans le tube de 10 nanogrammes par microlitre, puis soniquer les microsphères dans un bain d’eau glacée pendant 10 minutes à 160 watts avec des impulsions de 10 secondes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirer soigneusement 100 microlitres de milieu de culture d’îlots de chaque puits sans déloger les îlots, puis incuber les cultures avec 100 microlitres de milieu d’essai contenant les microsphères. Après trois jours, éliminer soigneusement le milieu d’essai de tous les puits sans perturber les îlots, puis laver doucement les îlots deux fois avec 200 microlitres de PBS.Les îlots adhèrent faiblement à une plaque de 96 puits. Il est donc essentiel de retirer délicatement le milieu et le PBS de chaque puits afin de ne pas déloger accidentellement et jeter les îlots. Après le deuxième lavage, immergez délicatement les îlots dans 100 microlitres de solution de trypsine-EDTA pendant trois minutes à température ambiante, en pipetant doucement après deux minutes.Transférez le volume total de chaque puits dans des tubes microcentrifuge individuels et ajoutez 400 microlitres de milieu de culture d'îlots à chaque tube pour arrêter la dissociation. Après avoir récupéré les îlots traités par microsphères par centrifugation, utilisez une micropipette pour éliminer délicatement les surnageants et resuspendre les culots dans 200 microlitres de milieu de culture d'îlots frais. Ensuite, centrifugez les îlots dissociés sur des lames de microscope chargées à l’aide d’un cytocentrifugeur.Après séchage à l'air, dessinez une boîte autour des îlots à l’aide d’un stylo hydrophobe et fixez les cellules dans 75 µL de paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 10 minutes, suivies de deux lavages avec 75 µL de PBS. Après le deuxième lavage, perméabilisez les cellules avec 75 µL de Triton X-100 à 0,2 % dans le PBS pendant 10 minutes, puis effectuez un lavage final avec 75 µL de PBS seul. Pour immunomarquer les îlots, commencez par placer les lames côté cellules vers le haut dans une chambre humide et retirez le PBS.Ensuite, bloquez la liaison non spécifique avec 75 microlitres de sérum de âne normal à température ambiante. Après une heure, remplacez le sérum par 75 microlitres de l'anticorps primaire d'intérêt pendant une autre heure à température ambiante. À la fin de l'incubation, aspirez soigneusement la solution d'anticorps primaire et lavez les échantillons avec des lavages au PBS de 375 microlitres.Incubez ensuite les îlots avec 75 microlitres d'anticorps secondaire marqué par immunofluorescence approprié pendant une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, remplacez la solution d'anticorps secondaire par 75 microlitres de Dappy pendant trois minutes, suivis d'un rinçage de cinq minutes dans de l'eau déionisée. À la fin du lavage, déposez une goutte de 100 microlitres de solution de montage à séchage rapide contenant un réactif anti-décoloration sur un couvre-objet en verre, puis retournez une lame de microscope, côté échantillon vers le bas, sur la solution de montage.La fraction la plus importante de microsphères aura un diamètre compris entre 1 et 10 micromètres, bien que certaines microsphères puissent être plus grandes. Après la dispersion des îlots traités par microsphères intactes de PLGA et leur immunomarquage ultérieur, il est fréquent d'observer des régions de l'échantillon dépourvues de tout marquage entre les cellules, causées par des microsphères intactes qui n'ont pas été complètement éliminées lors des étapes de lavage. Après l'acquisition des images, le pourcentage de cellules positives à l'insuline et à Ki67 peut être quantifié à l'aide d'une analyse d'image par logiciel ou en comptant manuellement le nombre total de cellules marquées.Le traitement des îlots intacts par des microsphères de facteur de croissance du tissu conjonctif humain recombinant PLGA pendant trois jours, comme vient de l'être démontré, entraîne une augmentation de la prolifération des cellules bêta, ce qui montre que la protéine ne perd aucune de ses fonctions au cours de la fabrication des microsphères. Une fois maîtrisée, cette technique peut produire des résultats en moins d'une semaine si elle est correctement réalisée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que l'effet sur la prolifération des cellules bêta dans votre expérience variera selon le composé d'intérêt et les cinétiques exactes de libération des microsphères produites.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, telles que la cotransplantation de microsphères chargées en composés avec des îlots pancréatiques intacts, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, par exemple si le composé d'intérêt peut induire la prolifération des cellules bêta in vivo. Le PLGA a fait l'objet d'une utilisation antérieure dans des dispositifs et des systèmes de délivrance de médicaments approuvés par la FDA, ce qui en fait un choix judicieux pour les chercheurs et les cliniciens souhaitant délivrer un agent thérapeutique à des tissus ciblés sur une période prolongée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment produire des microsphères en PLGA chargées en composés et comment les administrer à des îlots intacts en culture.N'oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle appropriés, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

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Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris Ex Vivo Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères (Vidéo) | JoVE Journal

Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris

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