Name: Enlèvement de Drosophila Muscle Tissue de Fillets larvaires pour immunofluorescence Analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Apprenez à retirer le tissu musculaire de larves de Drosophila pour améliorer l'immunofluorescence des neurones dendritiques et des cellules épidermiques. Cette méthode optimise le rapport signal/bruit et permet la microscopie à super-résolution.

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Nous remercions Gary Laïevski pour des discussions utiles sur la microscopie. Ce travail a été financé par le NIH accorde R01GM061107 et R01GM067758 à ERG

Remarque: La procédure de destitution musculaire (Figure 1) est une modification des méthodes décrites précédemment pour la préparation des filets larvaires. Les étapes qui précèdent et suivent le retrait du muscle sont décrites brièvement et le lecteur est renvoyé aux travaux antérieurs 10, 11 pour des descriptions plus détaillées. 1. Disséquer Larve dans une solution saline froide <ol><li> Préparer une dilution de travail de solution saline froide HL3.1 15 ou Ca 2+ froid -free HL3.1 saline 11 (tableau 1). Placez la larve dans un plat en élastomère de silicone avec juste assez de solution saline froide pour couvrir le fond du plat. REMARQUE: Voir Discussion concernant le choix d&#39;une solution saline. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1x HL3.1 solution saline (pH 7,2) </td></tr><tr><td> 5 mM de HEPES </td></tr><tr><td> 70 mM de NaCl, </td></tr><tr&gt; <td> 5 mM KCI </td></tr><tr><td> 1,5 mM de CaCl2 (omettre de Ca 2+ solution saline -free) </td></tr><tr><td> 4 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> 10 mM NaHCO 3 </td></tr><tr><td> mM tréhalose 5 </td></tr><tr><td> 115 mM de saccharose, </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Filtre stériliser et conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> imite Composition insectes hémolymphe: Note </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Composition de Cold Saline. <ol start="2"><li> Positionner la larve à la face ventrale. La surface ventrale de la larve peut être identifiée par les ceintures abdominales et dentical la face dorsale par les principaux tubes trachéaux larvaires course d&#39;avant en arrière. Étirez la larve dans le sens antéro-postérieur et la broche de la tête et la queue à unélastomère silicone disséquant plat utilisant des broches d&#39;insectes. Utilisez des ciseaux fins de dissection pour couper le long de la ligne médiane ventrale, en commençant à une extrémité et en progressant vers l&#39;autre. NOTE: Cette orientation préserve le cluster dorsal couramment étudié des neurones DA. </li><li> Après la larve est découpée, épingler les quatre coins de la boîte de dissection, comme si l&#39;ouverture d&#39;un livre. Utilisez une pince pour saisir et retirer les organes internes, y compris le système nerveux central, de l&#39;intestin et de la trachée. Ajustez les broches d&#39;insectes de sorte que le filet est tendu mais pas au maximum étiré. NOTE: Les muscles sont ancrés à la paroi du corps au niveau des limites segmentaires. Bien que les muscles couvrent la majeure partie de la paroi du corps, ils sont absents dans une région étroite à proximité de la ligne médiane dorsale. </li></ol> 2. Muscle Removal <ol><li> Repérez la ligne médiane dorsale de la larve, où le tissu musculaire est absent. Positionner une pince à broche unique de telle sorte qu&#39;il puisse être inséré sous le tissu musculaire dans la plate orientation possible. </li><li> À partir dela ligne médiane dorsale, près de la limite antérieure du segment, faites glisser soigneusement la griffe de pince entre le muscle et de l&#39;épiderme, en prenant soin de réduire au minimum le contact entre la pince et de l&#39;épiderme. </li><li> Tirez la pince vers le haut pour briser l&#39;attachement du muscle à la paroi du corps à un point d&#39;ancrage. Répétez ce processus pour l&#39;hémi-segment (s) d&#39;intérêts restants. NOTE: Ce protocole permet d&#39;optimiser la préservation de la partie postérieure de chaque champ dendritique des neurones da. Afin de préserver la partie antérieure du champ dendrites, il est préférable d&#39;insérer la pince griffe à l&#39;extrémité postérieure de chaque segment. </li><li> Re-ajuster les broches d&#39;insectes tels que le filet larvaire est au maximum tendue dans toutes les directions. </li><li> Fixer le filet alors qu&#39;il est encore cloué au plat de dissection en utilisant le froid, fraîchement préparé formaldéhyde 4% dans du PBS pendant 25 min. </li><li> Rinçage 5 fois dans du PBS. </li><li> Utilisez une pince pour tirer précieusement le tissu musculaire à partir des points d&#39;ancrage restants, en prenant soin de minimiser contact avec l&#39;épiderme. </li><li> Détacher et retirer le filet du plat de dissection à un tube de 1,5 ml. Effectuer toutes les lessives, le blocage, et des étapes ultérieures immunofluorescence de coloration, comme décrit précédemment 11. </li></ol> 3. Monter le larvaire Fillet <ol><li> Tout d&#39;abord enlever la tête et la queue en utilisant des ciseaux fins de dissection afin de rendre l&#39;échantillon le plus plat possible. Monter le filet sur une lamelle en antifade milieu de montage avec la surface intérieure du filet face à la lamelle. </li><li> Placez une lame de microscope sur la lamelle et appuyez doucement pour disperser le milieu de montage. Retournez la lame de microscope sur et sceller la lamelle sur la lame à l&#39;aide de vernis à ongles. Les diapositives peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins un mois. </li></ol>

<ol><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li>
<li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111(2011).</li>
<li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC%2C+NANCHUNG%2C+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ici , un protocole est décrit pour le retrait manuel du tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole modifie précédemment décrit les techniques de dissection larvaires 10,11. Après la larve est disséquée dans un plat en élastomère de silicone, la ligne médiane dorsale est située. Une pince à broche unique, dans son orientation la plus plane possible, est soigneusement inséré entre le tissu musculaire et l&#39;épiderme, à proximité de la ligne médiane dorsale. Les pinces son...

Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile fournissent un excellent modèle pour l&#39; étude du développement neuronal en raison de leur susceptibilité à la manipulation génétique et la facilité avec laquelle ils peuvent être visualisés. Ces neurones sensoriels ont joué un rôle dans l&#39;identification de nombreuses voies qui contrôlent dendrites morphogenèse 1-3. Quatre classes de neurones DA (classe I - IV) innervent l&#39;épiderme larvaire. Ces neurones se trouvent entre la membrane basale et l&#39;épiderme, avec leurs dendrites formant matrices bidimensionnelles en grande partie à 4,5. Sur les quatre classes, la classe IV neurones DA ont les tonnelles plus fortement ramifiée et, comme les neurones sensoriels d&#39;autres animaux, l&#39;élaboration de ces tonnelles exige des facteurs intrinsèques, ainsi que des indices de tissus voisins, en particulier l&#39;épiderme, pour leur développement 6-9 . Les études pour déterminer la façon dont ces neurones et fait extra-neuronalSOR avantage de contrôler la morphogenèse dendritique de la capacité à détecter l&#39; expression de la protéine in situ par immunofluorescence. La cuticule externe de la larve est impénétrable aux anticorps, mais cet obstacle est facilement surmontée par la préparation des filets larvaires grâce à des méthodes de dissection bien établies 10,11. Cependant, le tissu musculaire de la paroi du corps qui se trouve juste à l&#39;intérieur de la membrane de sous-sol présente de nombreux défis à la visualisation des neurones DA et des cellules de l&#39;épiderme. D&#39;abord, le tissu musculaire, qui tapisse la plupart de la paroi du corps, obscurcit considérablement des signaux fluorescents provenant d&#39;un tissu neuronal ou épidermique. Ceci réduit considérablement le rapport signal sur bruit dans l&#39;échantillon. D&#39;autre part, de nombreuses protéines pertinentes peuvent être exprimées dans le tissu musculaire, ainsi que dans les neurones ou de l&#39;épiderme. Ce signal de fluorescence dérivées du muscle est susceptible d&#39;obscurcir davantage la détection d&#39;un signal de fluorescence provenant du neurone ou de l&#39;épiderme. Enfin, les progrès dans les technologies de microscopie pasl&#39; imagerie d&#39; un permis poids d&#39;échantillons à une résolution de sous-diffraction et peut être particulièrement utile pour discerner la localisation de protéines qui sont exprimées dans les neurones et les cellules épidermiques entourant 12,13. Cependant, l&#39;imagerie par microscopie de super-résolution bénéficie d&#39;un signal fort par rapport au bruit et à proximité de l&#39;échantillon à la lamelle. En plus de réduire le rapport signal à bruit, les larves de la paroi du corps muscle distances neurones DA de la lamelle couvre-objet, ce qui limite la résolution de l&#39;image améliorée qui peut être obtenue avec des procédés de microscopie de super-résolution. En plus de difficultés pour l&#39;analyse d&#39;immunofluorescence, le tissu musculaire présente une barrière à l&#39;enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels dans la paroi du corps de la larve. Son retrait profite donc la manipulation neurophysiologique des neurones sensoriels 14. Voici une méthode pour l&#39; extraction manuelle du Drosophila tissu musculaire larvaire est décrite. Nous démontrons que notre protocole permites immunofluorescence imagerie des protéines qui sont autrement obscurcie par le tissu musculaire, améliore le rapport signal sur bruit pour la visualisation de la classe IV neurones DA, et permet l&#39;utilisation de super-résolution microscopique afin de mieux discriminer les relations spatiales des protéines et des structures cellulaires en neurones DA et l&#39;épiderme.

<table><tbody><tr><td>Pince à épiler Dumont #5</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Micro ciseaux, 8 cm, droite, lames de 5 mm, pointes de 0,1 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’élastomère de silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>pour la dissection de plaques</td></tr><tr><td>Épingles à insectes Austerlitz, 0,1 mm</td><td>Outils de science fine</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse Fostec 8375</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage anti-décoloration</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>pour la microscopie confocale</td></tr><tr><td>Prolong Diamond monteur anti-décoloration</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>pour la microscopie à éclairage structuré</td></tr><tr><td>Micro verre de couverture, 22 x 22 mm, n° 1,5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Coracle de souris</td><td>Études sur le développement Banque d’hybridomes</td><td>C615.16</td><td>surnageant, dilué 1:50</td></tr><tr><td>Antidisques de souris anticorps grand Études</td><td>sur le développement Banque d’hybridomes</td><td>4F3</td><td>surnageant, dilué 1:50</td></tr><tr><td>Lapin anticorps anti-dsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>dilué 1:1 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 568 conjugué</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>dilué 1:1 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris de chèvre, Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>dilué 1:500</td></tr></tbody></table>

enlèvement de<em&gt; drosophila</em&gt; muscle tissue de fillets larvaires pour immunofluorescence analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile sont un modèle populaire pour les mécanismes de la morphogenèse neuronale enquête. Neurones Da se développent dans la communication avec les cellules de l&#39; épiderme , ils innervent et donc leurs avantages de l&#39; analyse de la visualisation in situ des deux protéines neuronal et épidermique exprimées par immunofluorescence. Les méthodes traditionnelles de préparation des filets larvaires pour les expériences d&#39;immunofluorescence laissent intact le tissu musculaire qui couvre la majeure partie de la paroi du corps, présentant plusieurs défis à l&#39;imagerie des protéines neuronales et épidermiques. Nous décrivons ici un procédé pour éliminer le tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole permet l&#39;imagerie des protéines qui sont autrement occulté par le tissu musculaire, améliore le rapport signal à bruit, et facilite l&#39;utilisation de nanoscope pour étudier da développement des neurones.

Nous démontrons l&#39;utilité de la procédure de retrait des muscles pour améliorer le rapport signal sur bruit dans des expériences d&#39;immunofluorescence pour co-visualiser les protéines cloisonnées de jonction Coracle (Cora) et disques-large (DLG) ainsi que des neurones da classe IV marquées avec le marqueur membranaire CD4- tdTomato. Cora a déjà été utilisé pour identifier les secteurs où da dendrites neuronales sont entourées par des cellules de l&#39;...

Des études de la morphogenèse neuronale utilisant la drosophile arborisation dendritique larvaire (da) neurones bénéficient de la visualisation in situ des protéines neuronales et épidermiques par immunofluorescence. Nous décrivons un procédé qui permet d&#39;améliorer l&#39;analyse par immunofluorescence des neurones DA et des cellules épidermiques entourant en retirant le tissu musculaire de la paroi du corps de la larve.

Enlèvement de<em&gt; Drosophila</em&gt; Muscle Tissue de Fillets larvaires pour immunofluorescence Analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

L'objectif général de cette procédure est de retirer le tissu musculaire d'une larve de drosophile en vue d'une analyse par immunofluorescence des arborisations dendritiques larvaires ou des neurones da et du tissu épidermique. Aujourd'hui, nous allons démontrer une méthode qui améliore la visualisation des facteurs neuronaux et extraneuronaux impliqués dans la morphogenèse des dendrites. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'imagerie en immunofluorescence de protéines normalement masquées par le tissu musculaire, améliore le rapport signal sur bruit et rend possible l'utilisation de la microscopie de super-résolution.Pour commencer, ajoutez suffisamment de solution saline froide dans une boîte en élastomère de silicone pour recouvrir la surface du fond. Ajoutez la larve étudiée dans la boîte et placez-la sous le microscope stéréo. Assurez-vous d'un positionnement adéquat de l'éclairage.Positionnez la larve avec le côté ventral vers le haut, qui peut être identifié par les ceintures de denticules abdominaux. Étirez la larve dans le sens antéro-postérieur et, à l’aide d’épingles à insectes, fixez la tête et la queue au fond de la boîte. À l’aide d’une paire de ciseaux de dissection fins, incisez le long de la ligne médiane ventrale de la larve d’une extrémité à l’autre.Étaler la larve et fixer le tissu de cuticule aux quatre coins afin qu’il soit bien à plat. À l’aide de pinces, retirer les organes internes, y compris le SNC, l’intestin et la trachée. Ajuster les épingles à insectes de manière à ce que le filet soit tendu mais pas étiré au maximum.Localisez la ligne médiane dorsale de la larve, là où le tissu musculaire est absent, puis placez une branche de la pince à l'intérieur de cette limite. Faites glisser la branche entre le muscle et l'épiderme, en prenant soin de minimiser le contact avec l'épiderme. Pour limiter les dommages à l'épiderme, effectuez la dissection avec des branches aussi plates que possible, et essayez de procéder dans une solution saline contenant du calcium. Cela pourrait aider à créer un espace entre le muscle et l'épiderme.Ensuite, tirez vers le haut avec la pince pour rompre l'attachement du muscle à la paroi corporelle en un point d'ancrage. Répétez ce processus pour les segments musculaires restants d'intérêt. Réajustez les épingles fixant l'insecte afin d'étirer au maximum les filets larvaires dans toutes les directions.Pour fixer le filet, commencez par éliminer la solution saline, puis ajoutez du formaldéhyde à 4 % fraîchement préparé et refroidi dans du PBS, en quantité suffisante pour recouvrir le fond de la boîte. Incubez à température ambiante pendant 25 minutes. Rincez le filet cinq fois dans du PBS afin d'éliminer l'excès de formaldéhyde.Ensuite, utilisez une pince pour détacher soigneusement le tissu musculaire des points d'ancrage restants. Encore une fois, minimisez le contact avec l'épiderme. Enfin, retirez les épingles du filet et sortez-le du plat de dissection.Placez-le dans un tube propre de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Les étapes supplémentaires de lavage, de blocage et d'immunomarquage doivent être effectuées dans ce tube. Pour monter le filet en vue de l'imagerie, retirez l'échantillon du tube de microcentrifugeuse et positionnez-le avec la surface interne vers le bas sur une lame couvre-objet dans une goutte de PBS.Coupez la tête et la queue. Ensuite, retirez le PBS en l'absorbant avec un essuie-laboratoire. Ajoutez une goutte de milieu de montage antifade.Placez une lame de microscope sur la lamelle, puis appuyez doucement à l’aide d’un essuie-tout de laboratoire pour répartir le milieu de montage. Retournez la préparation et appliquez du vernis à ongles transparent sur chaque bord pour sceller la lamelle. Ces images de microscopie confocale montrent des expériences d’immunofluorescence visant à visualiser la protéine des jonctions septées, Coracle ou Cora, ainsi que les neurones da.Ici, des images de tissus musculaires prélevés et de tissus musculaires intacts ont été prises dans les mêmes conditions de puissance laser. Dans le tissu musculaire intact, la puissance laser a été augmentée afin de compenser l'interférence musculaire et d'obtenir une image comparable. Sur les images obtenues à partir de filets dépourvus de muscle, cora pouvait être clairement détecté aux limites des cellules épidermiques, formant des trajectoires intermittentes le long des dendrites des neurones de classe quatre da.Et délimiter le neurone, le soma. En revanche, la localisation de cora au niveau de ces domaines était à peine détectable dans les échantillons musculaires. Ici, cora était principalement visualisé dans le muscle, la trachée et les jonctions neuromusculaires, et la fluorescence provenant de ces tissus masquait la majeure partie de cora épidermique.Des échantillons ont également été observés par microscopie à illumination structurée en 3D afin de déterminer si l'élimination du muscle améliorait la visualisation à une résolution plus élevée. Là encore, les échantillons avec le muscle intact nécessitaient une visualisation avec une puissance et un temps d'exposition accrus pour compenser l'interférence musculaire. La résolution des images apparaissait plus nette dans les échantillons sans muscle, moins d'artéfacts ont été observés, et la coloration de cora des trajets des dendrites a été plus facilement résolue.Les membranes dendritiques pourraient également être mesurées à 114 nanomètres dans la condition de muscle éteint. Alors qu'elles semblent avoir une largeur de 272 nanomètres dans les filets de muscle activés. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de limiter le nombre de larves disséquées avant la fixation, afin que le temps écoulé ne dépasse pas 25 minutes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment retirer le tissu musculaire d'une larve de drosophile. Ce protocole facilitera l'analyse en immunofluorescence des neurones sensoriels larvaires et des cellules épidermiques qu'ils innervent. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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drosophile Dissection musculaire de vol indirect (IFM) de la chrysalide tardive : une méthode de prélèvement de tissus à haut débit

Dans cette vidéo, les fibres nerveuses des larves de drosophile sont immergées dans un colorant FM, qui se lie aux lipides de la membrane cellulaire. La microélectrode d’aspiration et les impulsions électriques stimulent le processus d’endocytose, incorporant le colorant FM dans les vésicules endocytaires nouvellement formées. Cette méthode, qui permet de visualiser les stades présynaptiques de la neurotransmission, est utile pour étudier la fonction synaptique et la libération de...

Chargement et déchargement du colorant FM médié par des microélectrodes dans les cellules nerveuses des larves de drosophile

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Les structures adultes de la drosophile sont dérivées de structures en forme de sac appelées disques imaginaux. L’analyse de ces disques donne un aperçu de nombreux processus de développement, notamment la détermination des tissus, l’établissement des limites des compartiments, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire et la polarité cellulaire planaire. Ce protocole est utilisé pour préparer des disques imaginaux pour la microscopie optique/fluorescente.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

Le muscle de vol de Drosophila est un modèle puissant pour étudier la régulation transcriptionnelle, l'épissage alternatif, le métabolisme, et la mécanobiologie. Nous présentons un protocole pour la dissection du muscle de vol fluorescent-étiqueté des chiots vivants pour produire des échantillons fortement enrichis idéaux pour la protéomique et le séquençage profond. Ces échantillons peuvent offrir des aperçus mécanistes importants dans divers aspects du développement musculaire.

Dissection des muscles de vol de melanogaster de Drosophila pour des approches d'Omics

Ce rapport fournit une nouvelle procédure de préparation d’échantillons pour visualiser les jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile . Cette méthode est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle et est particulièrement utile pour l’analyse ultrastructurale de la jonction neuromusculaire de la drosophile .

Optimisation du processus de préparation d’échantillons pour la microscopie électronique à transmission des jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile

Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

La drosophile est un modèle puissant pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la myogenèse. Ce protocole de dissection et de préparation des hémisections du thorax permet l’analyse microscopique des muscles en vol indirect à partir des stades nymphal et adulte. Ce protocole permet l’imagerie confocale de la morphologie cellulaire, de la localisation des protéines, de la structure musculaire et de multiples autres aspects de la myogenèse.

Dissection des muscles de vol indirect de Drosophila melanogaster pour les approches microscopiques

Apprenez à retirer le tissu musculaire de larves de Drosophila pour améliorer l'immunofluorescence des neurones dendritiques et des cellules épidermiques. Cette méthode optimise le rapport signal/bruit et permet la microscopie à super-résolution.

Enlèvement de Drosophila Muscle Tissue de Fillets larvaires pour immunofluorescence Analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques (Vidéo) | JoVE Journal

Enlèvement de

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