Une méthode pour l'ARN de mesure N 6 -methyladenosine Modifications dans les cellules et de tissus

L’objectif global de la technique de transfert de Northern modifié est de mesurer les modifications de la N6-méthyladénosine et de la N6A dans l’ARN et de détecter les modifications dans divers ARN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle de l’épigénétique de l’ARN telles que les modifications de la N6-méthyladénosine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une séparation efficace de l’ARN, une meilleure standardisation des plans expérimentaux et une délimitation claire de la modification de n6A dans les ARN.

Cette méthode peut donner un aperçu des modifications n6A de l’ARN et elle peut également être appliquée à d’autres modifications de l’ARN avec différents anticorps de détection. Pour commencer l’expérience, vaporisez une solution de décontamination à base de ribonucléase sur des serviettes en papier et essuyez les pipettes et les surfaces de la paillasse du laboratoire. Mouillez les serviettes en papier avec de l’eau exempte de nucléases et essuyez à nouveau les pipettes et les surfaces de la paillasse du laboratoire.

Obtenez une solution d’isolement d’ARN maintenue à quatre degrés Celsius et ajoutez un millilitre de solution à environ 75 milligrammes de tissu de souris. Utilisez un agitateur aérien pour homogénéiser le tissu. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 1-Bromo-3-chloropropane ou BCP par millilitre d’homogénat d’échantillon.

Agitez vigoureusement les tubes pendant 15 secondes et procédez à l’isolement total de l’ARN. À l’aide d’un spectrophotomètre, déterminez la concentration en ARN en notant l’absorbance à 260 nanomètres et 280 nanomètres. Vérifiez la qualité de l’échantillon d’ARN en effectuant une électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 %.

Rincez tout l’équipement d’électrophorèse avec de l’eau de diéthylpyrocarbonate ou de DEPC. Mélangez 2,5 grammes d’agarose, puis 215 millilitres d’eau DEPC dans un erlenmeyer et faites fondre complètement le mélange au micro-ondes. Une fois la solution fondue, ajoutez 12,5 millilitres de tampon 10X MOPS.

Et 22,5 millilitres de formaldéhyde à 37 % dans le flacon. Versez ensuite la solution dans l’appareil d’électrophorèse à l’aide d’un peigne de 1,5 millimètre d’épaisseur. À l’aide d’un peigne propre, poussez les bulles vers les bords du gel.

Laissez le gel se solidifier à température ambiante. Ensuite, utilisez le tampon de fonctionnement 1X MOPS préalablement préparé pour rincer les puits du gel et pré-exécuter le gel. Chargez les échantillons d’ARN dans les puits du gel, puis faites fonctionner le gel.

Le lendemain, examinez et photographiez le gel sous une lumière UV. Pour préparer le transfert, coupez le gel et retirez la partie inutilisée. Préparez 500 millilitres de 10X de citrate de sodium salin ou de tampon SSC.

Lavez le gel deux fois avec un tampon 10X SSC. Coupez une feuille de papier filtre assez grande pour couvrir le gel. Coupez quatre morceaux de papier filtre de la même taille que le gel.

Ensuite, coupez une feuille de membrane de nylon chargée positivement de la même taille que le gel. Marquez une encoche sur le gel et la membrane comme marqueur pour assurer la bonne orientation. Trempez la membrane dans un tampon SSC 2X.

Versez 500 millilitres de tampon 10X SSC dans le plateau de transfert. Posez la grande feuille de papier filtre sur la plaque de verre et mouillez le papier filtre avec un tampon de transfert. Ensuite, utilisez une pipette pour dérouler les bulles.

Trempez deux morceaux de papier filtre prédécoupé dans un tampon de transfert et placez-les au centre du papier filtre. Retirez toutes les bulles. Posez ensuite le gel sur le dessus sur le papier filtre et posez la membrane sur le gel, en veillant à aligner les encoches du gel et de la membrane.

Ensuite, placez deux morceaux de papier filtre prédécoupé sur la membrane. Retirez toutes les bulles entre les couches. Appliquez une pellicule plastique autour du gel pour vous assurer que les serviettes n’absorbent que le tampon passant à travers le gel et la membrane.

Empilez ensuite les serviettes en papier sur le papier filtre. Placez une plaque de verre surdimensionnée sur les serviettes et placez un poids sur le dessus de la pile et laissez l’ARN se transférer du gel à la membrane pendant la nuit. Après le transfert, maintenez la membrane humide dans un tampon SSC 2X.

Plongez deux feuilles de papier filtre avec un tampon SSC 10X, puis placez les feuilles dans l’agent de réticulation UV. Assurez-vous que la face absorbée par l’ARN est tournée vers le haut, puis placez la membrane sur le papier filtre. Sélectionnez le mode de liaison croisée automatique et appuyez sur le bouton de démarrage pour lancer l’irradiation.

Examinez la membrane et le gel à l’aide d’un capteur d’images de gel UV pour confirmer le transfert d’ARN du gel à la membrane. Bloquer la membrane dans le lait écrémé à 5 % dans un tampon TBST à température ambiante pendant une heure. Incuber la membrane pendant la nuit dans une solution d’anticorps m6A à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, lavez la membrane trois fois avec un tampon TBST pendant 15 minutes. Ensuite, incubez la membrane dans la solution d’anticorps anti-lapin d’âne conjuguée HRP pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, lavez la membrane trois fois avec un tampon TBST pendant 15 minutes.

Appliquez le substrat de chimiluminescence amélioré. Capturez la chimiluminescence à l’aide d’un imageur numérique. Enfin, passez à la quantification de m6A et mesurez l’intensité chimiluminescente relative de m6A à l’aide de l’image J.Les ARN hépatiques de souris ont été échantillonnés à des intervalles de quatre heures et étudiés avec la technique de transfert de Northern modifiée.

La méthylation des ARNr, des ARNm et des petits ARN a été clairement détectée. Des transferts représentatifs de m6A ont été effectués pour l’ARN total et sans ARNr dans le foie de souris de type sauvage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement exécutée.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique de l’ARN pour explorer les impacts sur la physiologie humaine liés au rythme circadien et à l’obésité.