Name: Une méthode pour lARN de mesure N 6 -methyladenosine Modifications dans les cellules et de tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Apprenez une technique de northern blotting modifiée pour détecter les modifications m6A dans l'ARN de tissus de souris. Cette méthode permet d'étudier l'épigénétique de l'ARN avec une séparation efficace des ARN.

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C.Y.W. a reçu le soutien de l’Institut national de recherche en santé (NHRI-EX101-9925SC), du Conseil national des sciences (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) et de l’Hôpital Chang Gung Memorial (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 et CMRPG3C1763).

NOTE: Le m d&#39;ARN total 6 Un niveau comprend l&#39; ARNr, l&#39; ARNm, et d&#39; autres petits ARN. Depuis l&#39; ARN ribosomal a abondant m 6 modifications A, la mesure de m 6 niveaux A devront tenir compte de ce fait. 1. Isolement de l&#39;ARN <ol><li> En utilisant la solution ribonucléase de décontamination (pulvérisée sur des serviettes en papier), essuyez les pipettes et les surfaces de laboratoire de banc. serviettes en papier humides avec de l&#39;eau sans nucléase et essuyez pipettes et des surfaces de laboratoire de banc à nouveau. </li><li> Extraction d&#39;ARN <ol><li> Isolement de l&#39;ARN total <ol><li> En utilisant un agitateur suspendu, d&#39; homogénéisation de 50 à 100 mg de tissu ou de 5-10 x 10 6 cellules dans 1 ml de solution d&#39;isolement d&#39;ARN maintenu à 4 ° C. NOTE: Plus le tissu (100-150 mg) peuvent être nécessaires pour des échantillons de tissu adipeux de souris en raison des concentrations d&#39;ARN inférieures qui y sont. Les échantillons proviennent de coeur de la souris, le foie, le muscle squelettique, du poumon, du cerveau, et les macrophages ont été employées précédemment 4. </li><li> Danscubate homogénats d&#39;échantillons pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 100 ul de 1-bromo-3-chloropropane (PCA) pour 1 ml d&#39;échantillon d&#39;homogénat. Agiter les tubes vigoureusement pendant 15 s et procéder à isoler l&#39; ARN total selon les instructions du fabricant 24. </li></ol></li><li> Polyadénylé de purification d&#39;ARNm de l&#39;ARN total isolé <ol><li> Purifier ARNm polyadénylés à l&#39;aide de kits ou protocoles disponibles. <ol><li> Bien agiter pour remettre en suspension chacune des solutions suivantes: solution de liaison, oligo (dT) des billes de polystyrène, et une solution de lavage 2x. Assurez-vous que l&#39;oligo (dT) Perles réchauffer à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Transférer 120 pi de solution d&#39;élution par préparation dans un tube et on chauffe à 70 ° C dans un bloc chauffant. </li><li> Pipeter jusqu&#39;à 500 pg d&#39;ARN total dans un tube de microcentrifugation. Avec de l&#39;eau sans nucléase, ajuster le volume à 250 pi. </li><li> Ajouter 250 pi de solution de liaison 2x à l&#39;ARN total ainsirésolu- et brièvement vortex pour mélanger le contenu. </li><li> Ajouter 15 ul d&#39;oligo (dT) et des billes vortex pour mélanger à fond. </li><li> Laisser incuber le mélange à 70 ° C pendant 3 min. </li><li> Retirer l&#39;échantillon du bloc de chauffage et le laisser reposer à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Centrifuger à 15000 g pendant 2 min. </li><li> Retirez délicatement le surnageant, laissant environ 50 pi. </li><li> Ajouter 500 pi de solution de lavage pour resuspendre le culot par pipetage. </li><li> Pipeter la suspension dans un tube ensemble filtre rotatif / collection. </li><li> Centrifuger à 15000 g pendant 2 min. Retirer la colonne du tube collecteur et jeter l&#39;écoulement. Retour à la colonne du tube de collecte. </li><li> Pipette 500 pi de solution de lavage sur le filtre de spin. </li><li> Centrifugeuse à 15.000 x g pendant 2 min. </li><li> Transférer le filtre rotatif dans un tube de collection fraîche. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul de solution d&#39;élution chaufféà 70 ° C sur le centre du filtre rotatif. </li><li> Incuber pendant 2-5 min à 70 ° C. Centrifuger à 15000 g pendant 1 min. </li><li> Pipeter une 50 ul supplémentaires de solution d&#39;élution chauffé à 70 ° C sur le centre du filtre rotatif. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> Ajouter 100 pg / ml de glycogène, 0,1 volume de 3 M de tampon d&#39;acétate de sodium (pH 5,2) et 2,5 volumes d&#39;éthanol absolu. Précipiter nuit à -80 ° C. </li><li> Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 25 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. </li><li> Laver le culot avec 1 ml d&#39;éthanol à 75%. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirez délicatement l&#39;éthanol. </li><li> Sec à l&#39;air pendant 3-5 min. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;eau sans nucléase pour dissoudre le culot. </li><li> Conserver à -70 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> ARN Qualification et quantification <ol><li> À l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre, déterminer la concentration d&#39;ARN par Notlng l&#39;absorbance à 260 nm et 280 nm. Le rapport A 260 / A 280 devrait être de 1,8 à 2,2. </li><li> Vérifier la qualité de l&#39; échantillon d&#39;ARN en utilisant 0,8% de gel d&#39; agarose électrophorèse 25. NOTE: L&#39;ARN total eucaryote intact devrait montrer intenses bandes 28S et 18S. Le rapport de 28S par rapport 18S intensité de la bande pour une bonne préparation de l&#39;ARN est ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. Gel Electrophoresis et le transfert REMARQUE: Les protocoles de préparation de tampon sont donnés dans le tableau 1. <ol><li> Préparation du gel de formaldehyde (1%) <ol><li> Rincer tout l&#39;équipement d&#39;électrophorèse avec de diéthyle (DEPC) l&#39;eau. </li><li> Faire fondre 2,5 g d&#39;agarose dans 215 ml d&#39;eau DEPC complètement dans un four à micro-ondes. </li><li> Ajouter 12,5 ml de 10x 3- (N- morpholino) propanesulfonique (MOPS) tampon et 22,5 ml de 37% de formaldéhyde. </li><li> Verser dans l&#39;appareil d&#39;électrophorèse avec un peigne à une épaisseur de 1,5 mm. </li><li> Éliminer les bulles ou pousser tourlet sur les bords du gel avec un peigne propre. </li><li> Permettre au gel de se solidifier à la température ambiante. </li></ol></li><li> La préparation des échantillons <ol><li> Mélanger 1-10 ug de l&#39;ARN total et 11,3 ul de tampon d&#39;échantillon. </li><li> Mélanger 2 pg du marqueur d&#39;ARN (1 pg / pl) 11,3 pi de tampon d&#39;échantillon. </li><li> Ajouter de l&#39;eau sans nuclease à partir des échantillons 2.2.1 et 2.2.2 à un volume total de 16 ul. </li><li> Chauffer à 60 ° C pendant 5 min, puis refroidir sur la glace. </li><li> Mélanger 16 ul de l&#39;échantillon à partir 2.2.3 avec 4 pi de colorant de suivi, qui contient 0,1 pg / pl de bromure d&#39;éthidium sur la glace. ATTENTION: Le bromure d&#39;éthidium est peut-être tératogène et toxique en cas d&#39;inhalation. Lire le bromure d&#39;éthidium fiche de sécurité. </li></ol></li><li> Electrophorèse <ol><li> Ajouter 200 ml de 10x MOPS tampon à 1.800 ml de ddH 2 O pour faire un tampon de migration MOPS 1x. </li><li> Utilisez le tampon en cours d&#39;exécution 1x MOPS pour rincer les puits du gel. </li><li> Pre-run til gel à 20 V pendant 5 min. </li><li> Charger les échantillons d&#39;ARN dans les puits du gel. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter exposition à la lumière. Exécutez à 35 V pendant environ 17 h (pendant la nuit) </li><li> Examiner et photographier le gel sous une lumière UV. </li></ol></li><li> Transfert <ol><li> Couper le gel pour éliminer la portion inutilisée. </li><li> Préparer 500 ml de 10 x tampon SSC (250 ml de tampon 20x SSC et 250 ml d&#39;eau DEPC). </li><li> Laver le gel deux fois avec un tampon 10x SSC pendant 20 minutes avec agitation à 50 tours par minute. </li><li> Couper 1 filtre feuille de papier assez grand pour servir de document de mèche, qui absorbe un tampon de transfert à partir du plateau de transfert (Figure 1). </li><li> Couper 4 morceaux de papier filtre à la même taille que le gel. </li><li> Découper une feuille de membrane en nylon chargée positivement à la même taille que le gel. </li><li> Marquer une encoche sur le gel et la membrane en tant que marqueur pour assurer l&#39;orientation correcte. </li><li> Faire tremper la membrane dans un tampon SSC 2x pendant 15 min. </li><li> Verser 500 ml d&#39;of 10x SSC tampon dans le bac de transfert. </li><li> Poser la grande feuille de papier filtre sur la plaque de verre et le papier filtre humide avec un tampon de transfert. </li><li> Etaler les bulles avec une pipette. </li><li> Faire tremper 2 morceaux de papier filtre pré-découpé dans un tampon de transfert et les placer sur le centre du papier filtre de l&#39;étape 2.4.5. Retirez toutes les bulles. </li><li> Poser le côté supérieur de gel sur le papier filtre. </li><li> Poser la membrane sur le dessus du gel. Aligner les encoches du gel et la membrane. </li><li> Placer 2 morceaux de papier filtre pré-coupe sur le dessus de la membrane et le papier filtre avec un tampon de transfert humide. </li><li> Retirez toutes les bulles entre les couches. </li><li> Appliquer un film plastique autour du gel pour assurer que les serviettes seulement absorbent le tampon qui passe à travers le gel et la membrane. </li><li> Empilez les serviettes en papier sur le dessus du papier filtre. </li><li> Placer une plaque de verre surdimensionné sur le dessus des serviettes. </li><li> Placer un poids sur le dessus de la pile. </li><li>Maintenir pendant une nuit pour permettre à l&#39;ARN de transférer du gel vers la membrane. </li></ol></li></ol> 3. Détection de la N 6 -methyladenosine <ol><li> Membrane Réticulation <ol><li> Gardez la membrane humide dans un tampon 2x SSC. </li><li> Placez 2 feuilles de papier filtre immergé avec 10x tampon SSC en réticulant UV. </li><li> Placer la membrane sur le dessus du papier-filtre, le côté de l&#39;ARN adsorbé vers le haut. </li><li> Sélectionnez &quot;mode autocrosslink&quot; (120.000 pJ) et appuyez sur le bouton &quot;Démarrer&quot; pour lancer l&#39;irradiation. </li><li> Examiner la membrane et le gel avec un gel UV image receveur pour confirmer le transfert de l&#39;ARN du gel à la membrane. </li></ol></li><li> immunotransfert <ol><li> Bloquer la membrane dans 5% de lait dégraissé dans une solution salée tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST), un tampon à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Laver trois fois avec du tampon TBST pendant 15 min. </li><li> Incuber la membrane pendant une nuit à 6 m A (&lt;em&gt; N 6 -methyladenosine) solution d&#39;anticorps (1: tampon TBST de lait non gras 1000 dans 5%) à 4 ° C. </li><li> Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min. </li><li> Incuber la membrane dans la solution d&#39;âne conjugué à HRP anti-lapin d&#39;anticorps (1: 2000 dans du tampon TBST de lait non gras à 5%) pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min. </li><li> Appliquer le substrat de chimioluminescence amélioré (0,125 ml par cm2 de membrane). </li><li> Capturez la chimioluminescence avec les réglages optimaux de l&#39;imageur numérique, selon les instructions du fabricant 26. </li></ol></li><li> m 6 A Quantification <ol><li> Mesurer la m 6 Une intensité de chimioluminescence par rapport à l&#39; aide du logiciel ImageJ. <ol><li> Dans le menu du logiciel ImageJ, sélectionnez l&#39;option &quot;Fichier&quot; pour ouvrir le fichier pertinent. </li><li> Sélectionnez l&#39;outil &quot;Rectangle&quot; de ImageJ et dessiner un cadre autourles signaux. </li><li> Si l&#39; ARN ribosomal est pas l&#39;objet des expériences, d&#39; éviter les 18S et 28S ribosomal RNA m 6 bandes A pour le calcul. </li><li> Cliquez sur &quot;Command&quot; et &quot;1&quot; pour confirmer la voie sélectionnée. </li><li> Appuyez sur &quot;commande&quot; et &quot;3&quot; pour afficher le tracé sélectionné. </li><li> Cliquez sur l&#39;outil &quot;Straight&quot; et tracer des lignes pour séparer la zone segmentée. </li><li> Cliquez sur l&#39;outil &quot;baguette&quot; pour enregistrer les mesures. </li><li> Exporter les données. </li><li> Normaliser les niveaux de m 6 A avec l&#39;ARN ribosomal 18S bande à partir de la coloration au bromure d&#39;éthidium. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+16S+ribosomal+RNA+gene+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+ribosomal+RNA+for+mosquito+gut+metagenomic+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-Northern+Blotting%3A+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).</li>
<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les modifications de l’ARN jouent un rôle important dans la fonction cellulaire et la physiologie. La compréhension actuelle de la régulation, de la fonction et de l’homéostasie de ces modifications est encore en cours d’exploration et d’expansion8. Par conséquent, une méthode précise et de référence pour évaluer les modifications de l’ARN est nécessaire. La méthode de transfert de Northern modifiée permet une quantification précise des modifications de l’ARN et une délimitation claire des modifications dans divers ARN. Bien que la méthode nécessite au moins 3 jours, elle peut être normalisée et peut être utilisée dans divers modèles expérimentaux. De plus, avec différents anticorps, il peut détecter différentes modifications de l’ARN27.
Il est important de séparer les différents ARN lors de l’analyse des modifications de l’ARN. L’ARN ribosomique représente une grande partie de la quantité totale d’ARN28,29. Les résultats de l’analyse des modifications de l’ARN uniquement dans l’ARN total représenteront principalement les changements de l’ARNr. La méthylation et d’autres modifications de l’ARNr pourraient potentiellement masquer les changements dans d’autres ARN. Avec la procédure de séparation sur gel, les modifications de l’ARNm et d’autres petits ARN peuvent être analysées avec plus de précision.
La cartographie à l’échelle du transcriptome avec immunoprécipitation et séquençage de m6A fournit un aperçu détaillé de la modification de chaque type d’ARN22. Il fournit des informations sur les ARN spécifiques et une résolution d’environ 80-120 pb. Bien que m6A-Seq puisse comparer les modifications entre différentes conditions expérimentales, le choix d’étalons et de contrôles appropriés pour de telles expériences est difficile18. L’immunoprécipitation est difficile à reproduire, donnant souvent des variations importantes entre les répétitions. De plus, m6A-Seq nécessite la fragmentation des échantillons d’ARN avant l’immunoprécipitation et le séquençage30. Le processus de fragmentation pourrait potentiellement induire des influences indues sur les modifications de l’ARN d’origine. Si l’expérience n’a pas besoin de l’information du gène spécifique mais nécessite des conditions différentes pour la comparaison, la méthode actuelle offre une meilleure visualisation et un meilleur contrôle pour diverses configurations expérimentales. 
La modification de l’ARN est une étape importante dans la régulation du contrôle transcriptionnel31. Cependant, l’homéostasie et les mécanismes de régulation de diverses modifications de l’ARN dans divers domaines physiologiques ne sont pas encore clairs. À l’aide de la méthode actuelle de transfert du Nord modifié, différentes modifications de l’ARN peuvent être quantifiées et comparées. De plus, les changements et les régulations des modifications de l’ARN peuvent être étudiés plus en détail. À l’avenir, il pourrait également être possible de combiner les données expérimentales du transfert du Nord classique et des protocoles modifiés du transfert du Nord, ce qui permettrait de mieux comprendre la biologie de l’ARN.
Le facteur le plus important qui détermine le succès du protocole de transfert de Northern modifié est l’intégrité de l’échantillon d’ARN. Les ARN présentant une certaine quantité de dégradation peuvent donner de bons résultats de transfert de Northern classique, mais cela pourrait avoir un impact significatif sur les résultats de transfert de Northern modifiés. Les modifications de l’ARN dans différents tissus ou lignées cellulaires peuvent également varier considérablement. Il est important de tester les charges d’échantillons d’ARN appropriées pour différents tissus avant d’effectuer les expériences finales.
Comme les procédures de transfert ont traditionnellement été nommées d’après le Dr Southern et différentes directions géographiques, nous proposons le nom de transfert « nord-est » pour la technique actuelle.

Les modifications dynamiques et réversibles de l’ARN jouent un rôle important dans l’homéostasie de l’ARN. Il y a quarante ans, les modifications de la N6-méthyladénosine (m6A) se sont révélées abondantes dans les transcriptomes eucaryotes1. Ils ont diverses fonctions dans l’ARN messager (ARNm), l’ARN ribosomique (ARNr), le petit ARN nucléolaire, l’ARN de transfert et le microARN2. Les modifications m6A de l’ARNm influencent leur épissage3, leur traduction4, leur dégradation5 et leur localisation2. De plus, ils affectent la biogenèse des ribosomes et la fonction des microARN6. La conservation évolutive des modifications m6A de l’ARN est notée chez les bactéries unicellulaires chez les humains multicellulaires7. La délimitation des rôles des modifications de m6A fait actuellement l’objet d’une exploration approfondie. On s’attend à ce que ces efforts fournissent de nouvelles informations sur le contrôle de la transcription. Des études récentes révèlent que d’autres modifications chimiques de l’ARNm8 jouent également un rôle essentiel dans le métabolisme de l’ARN. 
Les rythmes circadiens9, la pluripotence des cellules souches10, le métabolisme des triglycérides4, la fibrose11, l’obésité12 et la dépression majeure13 sont quelques exemples de processus où les modifications de m6A sont connues pour contrôler les résultats. De nombreux transcrits de gènes de l’horloge circadienne ont m6A sites14. La modulation de la méthylase ou de la déméthylase m6provoque des changements de la période circadienne15. Mettl3, une transférase m6A, est un régulateur de la pluripotence des cellules souches. Une carence en Mettl3 entraîne une létalité embryonnaire précoce et un amorçage aberrant de la lignée au stadepost-implantatoire 10. Une carence en masse grasse et en obésité (FTO), une m6A déméthylase, dans les adipocytes affecte la mobilisation des acides gras et le poids corporel par la régulation post-transcriptionnelle d’Angptl44. Ces études révèlent que m6A contrôle non seulement le traitement de l’ARNm, mais joue également un rôle essentiel dans le développement embryologique et la physiopathologie. La fonction des modifications m6A a des implications pour les considérations thérapeutiques à l’avenir.
Plusieurs méthodes sont disponibles pour mesurer les modifications m6A de l’ARN16-18. Traditionnellement, la chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sont utilisées pour étudier la distribution de m6A dans plusieurs ARN19,20. La spectrométrie de masse est un outil sensible pour la détection des modifications de m6A dans l’ARN. Cependant, l’ARN doit être excisé par la RNase en fragments courts avant d’être analysé par spectrométrie de masse21. L’immunoprécipitation et le séquençage de l’ARN-méthyle (m6A-Seq)22 immunoprécipitent les ARN fragmentés avec des anticorps spécifiques de m6A et effectuent un séquençage parallèle de l’ARN. Cette méthode génère des paysages m6A à l’échelle du transcriptome. La cartographie à haute résolution de la réticulation et de l’immunoprécipitation à résolution nucléotidique individuelle de m6A (miCLIP) cartographie davantage les modifications de m6A à une résolution de23 pour un seul nucléotide. Les deux méthodes fournissent des détails sur la modification de m6A sur l’ensemble du transcriptome, avec des informations spécifiques sur les gènes. Cependant, les quantifications et la normalisation dans les deux méthodes sont difficiles si les expériences nécessitent la comparaison de plusieurs conditions. De plus, les fragmentations de l’ARN pour m6A-Seq modifient la structure originale de l’ARN, ce qui peut affecter les niveaux natifs de m6A. Pour détecter les modifications globales de l’ARN m6A et leurs changements dans différentes conditions expérimentales, nous rapportons une méthode qui utilise un protocole de transfert de Northern modifié. Cette méthode résout l’ARN en fonction de son poids moléculaire, en utilisant l’électrophorèsesur gel 18. Cette procédure permet une meilleure normalisation et quantification des expériences impliquant plusieurs conditions ou échantillons. Il fournit également des informations spécifiques sur la modification de m6A pour différents ARN, qu’il s’agisse d’ARNr, d’ARNm ou de microARN.

<table><tbody><tr><td>Solution RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>Protocole 1.1</td></tr><tr><td>TRI Solution réactive</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td><td>Protocole 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-chloropropane (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Protocole 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>Protocole 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Protocole 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>Protocole 1.2.2.1</td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>Protocole 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>Protocole 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>Protocole 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Protocole 2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td><td>A426</td><td>Protocole 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Protocole 2.1.3</td></tr><tr><td>37 % formaldéhyde Solution</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Protocole 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, sel disodique</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>Protocole 2.1.3 10x MOPS</td></tr><tr><td>buffer formamide</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Protocole 2.2.1</td></tr><tr><td>ARN Millennium Marker</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>Protocole 2.2.2</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Protocole 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>Protocole 2.2.5 colorant de suivi</td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>Protocole 2.2.5 colorant de suivi</td></tr><tr><td>Xylène Cyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Protocole 2.2.5 colorant de suivi</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium dihydraté</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Protocole 2.4.2 20x Tampon SSC</td></tr><tr><td>Citrate trisodique</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Protocole 2.4.2 20x Tampon SSC</td></tr><tr><td>Hybond Blotting Paper</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN6101M</td><td>Protocol 2.4.4</td></tr><tr><td>Membrane GE Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td>Protocol 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>Protocol 3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>Technologie ANT</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protocole 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-méthyladénosine)</td><td>Synaptic Systems</td><td>202003</td><td>Protocol 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-lied whole Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protocol 3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>Protocol 3.2.8</td></tr></tbody></table>

une méthode pour l&#39;arn de mesure<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modifications dans les cellules et de tissus

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-méthyladénosine (m6A) les modifications de l’ARN sont diverses et omniprésentes chez les eucaryotes. Ils sont présents dans l’ARNm, l’ARNr, l’ARNt et le microARN. Des études récentes ont révélé que ces modifications réversibles de l’ARN affectent l’épissage, la traduction, la dégradation et la localisation de l’ARN. De multiples processus physiologiques, tels que les rythmes circadiens, la pluripotence des cellules souches, la fibrose, le métabolisme des triglycérides et l’obésité sont également contrôlés par des modifications m6A. L’immunoprécipitation/séquençage, la spectrométrie de masse et le transfert de Northern modifié sont quelques-unes des méthodes couramment utilisées pour mesurer les modifications de m6A. Nous présentons ici une technique de transfert nord-est pour mesurer les modifications de m6A. Le protocole actuel offre une bonne séparation granulométrique de l’ARN, une meilleure adaptation et une meilleure normalisation pour divers modèles expérimentaux, et une délimitation claire des modifications de m6A dans diverses sources d’ARN. Bien que les modifications de m6A soient connues pour avoir un impact crucial sur la physiologie humaine en ce qui concerne les rythmes circadiens et l’obésité, leurs rôles dans d’autres états (patho)physiologiques ne sont pas clairs. Par conséquent, les recherches sur les modifications de m6A ont d’immenses possibilités de fournir des informations clés sur la physiologie moléculaire.

Après 14 jours en phase circadienne de lumière-obscurité normale, les souris de type sauvage ont été placés dans l&#39;obscurité constante. Les ARN du foie ont été prélevés à des intervalles de 4 h et étudiés avec Northern Blot modifiée. La méthylation des ARNr, d&#39; ARNm et de petits ARN ont été clairement détectée (figure 2). La comparaison entre les différents moments circadiens (CT) peut être calculé avec précision le niveau ARNr 18S. Il était robuste oscillation circadienne de m 6 niveaux A à ARNr, l&#39; ARNm, et les petits ARN. Afin d&#39;éviter l&#39;interférence avancé par un ARNr, un ARN polyadénylés peuvent être purifiés comme à l&#39;étape 1.2.2. Après purification, le rARN peut être largement éliminé pour permettre une meilleure visualisation des autres ARN (figure 3). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figure 1: Montage de l&#39;unité de transfert de blot. L&#39;unité de transfert capillaire pour buvard l&#39;ARN sur la membrane est représentée. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> Figure 2: le rythme circadien des m 6 niveaux A à C57BL / 6J. Cette figure montre la m 6 Un transfert de l&#39; ARN total à partir de foies de souris de type sauvage a sacrifié le premier jour de la phase sombre sombre après 14 jours d&#39;une phase de lumière-obscurité normale à 4 heures d&#39; intervalle. La quantification a été effectuée en utilisant les 6 m Une différence de densité d&#39;image entre rARN 18S et 28S. M 6 Une abondance a été étalonnée par rapport à la bande 18S du gel de formaldehyde au fond.et = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> Figure 3: m 6a blots avec ou sans ARNr. M représentant 6 A blot de l&#39; ARN total et de l&#39; ARN polyadénylé à partir de foies de souris de type sauvage sont présentées. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> tampon 10x MOPS (pH 7,0, protéger de la lumière) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41.85 </td><td> g </td><td> 0,2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> L&#39;acétate de sodium </td><td> 4.1 </td><td> g </td><td>0,05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, le sel de disodium </td><td> 3.7 </td><td> g </td><td> 0,01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> l&#39;eau DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> On agite à la température ambiante </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> tampon de SSC 20x (pH 7,0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Chlorure de sodium </td><td> 175,3 </td><td> g </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Citrate trisodique </td><td> 88,3 </td><td> g </td><td> 0,3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> l&#39;eau DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> Agiter à la température ambiante, puis l&#39;autoclave </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Dye Suivi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> tampon 10x MOPS </td><td> 500 </td><td> ul </td><td> 1 fois </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0,75 </td><td> g </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> bleu de bromophénol </td><td> 0,01 </td><td> g </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Xylène Cyanol </td><td> 0,01 </td><td> g </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> l&#39;eau DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 5 </td><td> mL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Conserver à -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> l&#39;eau DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Diluer ratio à 1: 1.000 de DEPC dans ddH 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Agiter pendant une nuit à température ambiante, puis l&#39;autoclave </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> tampon d&#39;échantillon (abri de la lumière) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> tampon 10x MOPS </td><td> 200 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% de formaldéhyde </td><td> 270 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> formamide </td><td> 660 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Conserver à -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> Tableau 1: Tampons et solutions.

Une méthode Northern Blot modifiée pour mesurer N6- -methyladenosine (m 6 a) des modifications dans l&#39; ARN est décrite. La méthode actuelle peut détecter des modifications dans divers ARNs et des contrôles en vertu de divers modèles expérimentaux.

Une méthode pour l&#39;ARN de mesure<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modifications dans les cellules et de tissus

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

L'objectif général de la technique de northern blot modifiée est de mesurer les modifications de N6-méthyladénosine, ou n6A, dans l'ARN et de détecter ces modifications dans divers types d'ARN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le rôle de l'épigénétique de l'ARN, notamment les modifications par la N6-méthyladénosine. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à assurer une séparation efficace des ARN, une meilleure standardisation des plans expérimentaux et une délimitation claire des modifications n6A dans les ARN.Cette méthode peut fournir des informations sur les modifications de n6A dans l'ARN et peut également être appliquée à d'autres modifications de l'ARN en utilisant des anticorps de détection différents. Pour commencer l'expérience, vaporisez une solution de décontamination contre les ribonucléases sur des essuie-tout et nettoyez les pipettes ainsi que les surfaces de la paillasse. Humidifiez ensuite les essuie-tout avec de l'eau sans nucléase et nettoyez à nouveau les pipettes et les surfaces de la paillasse.Obtenez une solution d'isolement d'ARN maintenue à quatre degrés Celsius et ajoutez un millilitre de cette solution à environ 75 milligrammes de tissu de souris. Utilisez un agitateur magnétique pour homogénéiser le tissu. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 1-bromo-3-chloropropane ou BCP par millilitre d'homogénat d'échantillon.Agiter vigoureusement les tubes pendant 15 secondes, puis procéder à l'isolement de l'ARN total. À l'aide d'un spectrophotomètre, déterminer la concentration en ARN en notant l'absorbance à 260 nanomètres et 280 nanomètres. Vérifier la qualité de l'échantillon d'ARN en réalisant une électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %.Rincez tout l'équipement d'électrophorèse avec de l'eau diéthylpyrocarbonate ou de l'eau DEPC. Mélangez 2,5 grammes d'agarose, puis 215 millilitres d'eau DEPC dans un ballon Erlenmeyer et faites fondre complètement le mélange au micro-ondes. Une fois la solution fondue, ajoutez 12,5 millilitres de tampon MOPS 10X.Et 22,5 millilitres de formaldéhyde à 37 % dans le flacon. Ensuite, verser la solution dans l'appareil d'électrophorèse muni d'un peigne de 1,5 millimètre d'épaisseur. À l'aide d'un peigne propre, repousser les bulles vers les bords du gel.Laisser le gel se solidifier à température ambiante. Ensuite, utiliser le tampon de migration MOPS 1X préparé précédemment pour rincer les puits du gel et faire une pré-électrophorèse. Charger les échantillons d'ARN dans les puits du gel, puis faire migrer le gel.Le lendemain, examiner et photographier le gel sous une lumière UV. Pour préparer le transfert, découper le gel et retirer la portion inutilisée. Préparer 500 millilitres de tampon SSC 10X (chlorure de sodium-citrate de sodium).Lavez le gel deux fois avec du tampon SSC 10X. Découpez une feuille de papier filtre suffisamment grande pour recouvrir le gel. Découpez quatre morceaux de papier filtre de la même taille que le gel.Ensuite, découpez une feuille de membrane en nylon chargée positivement à la même taille que le gel. Marquez une encoche sur le gel et sur la membrane, servant de repère pour assurer l'orientation correcte. Imbibez la membrane dans du tampon SSC 2X.Verser 500 millilitres de tampon SSC 10X dans le bac de transfert. Placer la grande feuille de papier filtre sur la plaque de verre et humidifier le papier filtre avec du tampon de transfert. Ensuite, utiliser une pipette pour éliminer les bulles d'air.Imprégnez deux morceaux de papier-filtre pré-découpés de tampon de transfert et placez-les au centre du papier-filtre. Éliminez toutes les bulles d'air. Posez ensuite le gel, côté supérieur vers le bas, sur le papier-filtre, puis placez la membrane par-dessus le gel, en veillant à aligner les encoches du gel et de la membrane.Ensuite, placez deux morceaux de papier filtre pré-découpés sur le dessus de la membrane. Éliminez toute bulle d'air entre les couches. Appliquez un film plastique autour du gel afin de s'assurer que les essuies ne s'imbibent que du tampon traversant le gel et la membrane.Ensuite, empilez des essuie-tout sur le papier filtre. Placez une plaque de verre de grande taille sur les essuie-tout et posez un poids sur le dessus de l'empilement, puis laissez l'ARN migrer du gel vers la membrane toute la nuit. Après le transfert, maintenez la membrane humide dans un tampon SSC 2X.Immerger deux feuilles de papier filtre dans du tampon SSC 10X, puis placer les feuilles dans le lieur UV. Veiller à ce que la face du membrane ayant absorbé l'ARN soit orientée vers le haut, puis poser la membrane sur les feuilles de papier filtre. Sélectionner le mode de réticulation automatique et appuyer sur le bouton de démarrage pour initier l'irradiation.Examinez la membrane et le gel à l’aide d’un capteur d’image de gel UV afin de confirmer le transfert de l’ARN du gel vers la membrane. Bloquez la membrane dans une solution de 5 % de lait écrémé dans un tampon TBST pendant une heure à température ambiante. Incubez la membrane toute la nuit dans une solution d’anticorps anti-m6A à quatre degrés Celsius.Le lendemain, laver la membrane trois fois avec du tampon TBST pendant 15 minutes. Ensuite, incuber la membrane dans la solution d'anticorps anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) de l'âne pendant une heure à température ambiante. Après une heure, laver la membrane trois fois avec du tampon TBST pendant 15 minutes.Appliquez le substrat de chimiluminescence amélioré. Capturez le signal de chimiluminescence à l’aide d’un système d’imagerie numérique. Enfin, passez à la quantification de m6A et mesurez l’intensité chimiluminescente relative de m6A à l’aide d’ImageJ. Des ARN de foie de souris ont été prélevés à des intervalles de quatre heures et analysés par la technique de northern blot modifiée.La méthylation des ARNr, des ARNm et des petits ARN a été clairement détectée. Des immunotransferts représentatifs de m6A ont été réalisés à partir d'ARN total et d'ARN total dépourvu d'ARNr provenant de foies de souris de type sauvage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est effectuée correctement.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'épigénétique de l'ARN pour explorer les impacts sur la physiologie humaine liés au rythme circadien et à l'obésité.

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Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN représentent une couche de régulation de la traduction sous-étudiée qui a récemment été liée à la plasticité du système nerveux central. Ici, la préparation des échantillons et l’approche de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem sont décrites pour la caractérisation simultanée de nombreuses modifications de l’ARN dans des neurones uniques.

Caractérisation des modifications de l’ARN dans des neurones uniques à l’aide de la spectrométrie de masse

Le protocole fournit des instructions pour modifier l’ARN avec du sulfate de diméthyle pour les expériences de profilage mutationnel. Il comprend le sondage in vitro et in vivo avec deux méthodes alternatives de préparation de bibliothèque.

Criblage de la structure de l’ARN avec le profilage mutationnel du sulfate de diméthyle avec séquençage in vitro et dans les cellules

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer semi-quantitativement les niveaux globaux de m⁶A en utilisant le blot de points. L’ARN total est extrait, dénaturé, taché sur une membrane en nylon, sondé avec un anticorps anti-m⁶A, et visualisé par chimiluminescence. L’intensité du signal, quantifiée par l’analyse en niveaux de gris ImageJ, reflète l’abondance relative de méthylation, offrant un flux de travail reproductible pour la recherche.

Essai par blot de points pour détecter les niveaux globaux de modification de l’ARNde la N 6-méthyladenosine

Ce protocole fournit une approche détaillée pour évaluer les niveaux de modification de m6Ad’ARN spécifique à l’aide de MeRIP-qPCR.

Test MeRIP-qPCR pour détecter les niveaux de modification m6A d’ARN spécifique dans les cellules d’ostéosarcome

Apprenez une technique de northern blotting modifiée pour détecter les modifications m6A dans l'ARN de tissus de souris. Cette méthode permet d'étudier l'épigénétique de l'ARN avec une séparation efficace des ARN.

Une méthode pour l'ARN de mesure

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