Mesure parallèle d'expression Circadian Clock génique et la sécrétion d'hormones dans des cultures de cellules humaines primaires
11 novembre 2016
Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.
L’objectif global de cette procédure est l’évaluation parallèle de la bioluminescence circadienne et de l’activité sécrétoire de cellules endocrines primaires humaines cultivées et synchronisées in vitro. Cette méthode peut aider à étudier le modèle temporel de la sécrétion cellulaire et comment elle peut être régulée par des horloges circadiennes autonomes cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de surveiller l’activité des luciférines circadiennes en tant que rapporteur et de collecter simultanément le milieu d’écoulement pour mesurer les niveaux d’hormones et de myokines sécrétées. Pour introduire des rapporteurs de bioluminescence circadienne dans les cellules primaires par transduction lentivirale, transférez d’abord les boîtes de Pétri de 3,5 cm contenant des myoblastes humains à 30 % à 50 % de confluence dans une armoire à flux laminaire. Remplacez le milieu de myoblaste humain par 2 mL de milieu de croissance. Ensuite, transduisez la culture cellulaire primaire en pipetant une solution de lentivirus dans la boîte pour obtenir une multiplicité d’infection égale à trois. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire. Changez de support le lendemain. Pour réaliser une synchronisation in vitro, ajoutez 10 micromolaires d’activateur de l’adénylyl cyclase dans 2 mL de milieu par boîte de Pétri de 3,5 cm contenant les cellules primaires préalablement transfectées. Incuber les cellules pendant 60 minutes à 37
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Aperçu
Cette étude décrit des méthodes permettant de surveiller la bioluminescence circadienne en parallèle avec l'activité sécrétoire de cellules insulaires humaines et de myotubes primaires. L'approche implique une livraison génique par lentivirus d'un rapporteur luciférase du rythme circadien, suivie d'une synchronisation in vitro et d'une perfusion cellulaire continue pour la collecte du milieu.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Chronobiologie
Contexte
- Les rythmes circadiens jouent un rôle crucial dans les fonctions cellulaires.
- La surveillance de la bioluminescence peut fournir des informations sur l'activité cellulaire.
- Les cellules des îlots humains sont essentielles à la sécrétion d'insuline.
- Les myotubes primaires sont importants pour l'étude de la physiologie musculaire.
Objectif de l'étude
- Étudier la relation entre les rythmes circadiens et l'activité sécrétoire.
- Développer une méthode de surveillance en temps réel des fonctions cellulaires.
- Approfondir la compréhension des processus métaboliques dans les cellules humaines.
Méthodes utilisées
- Délivrance génique par lentivirus pour l'expression d'un rapporteur luciférase.
- Synchronisation in vitro des cultures cellulaires.
- Perfusion continue pour la collecte de milieu.
- Mesure de la bioluminescence pour évaluer les rythmes circadiens.
Résultats principaux
- Surveillance réussie de la bioluminescence circadienne dans les cellules des îlots humains.
- Mise en évidence de l'activité sécrétoire des myotubes primaires.
- Mise en place d'une méthode fiable pour l'étude des rythmes cellulaires.
- Apport de connaissances sur l'interaction entre la biologie circadienne et la fonction cellulaire.
Conclusions
- l'étude propose une approche novatrice pour surveiller les activités cellulaires en temps réel.
- les résultats contribuent à la compréhension des influences circadiennes sur le métabolisme.
- applications potentielles dans la recherche sur le diabète et la physiologie musculaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mesure parallèle de l'expression des gènes de l'horloge circadienne et de la sécrétion hormonale dans des cultures primaires de cellules humaines permet une interrogation directe de la régulation temporelle dans les systèmes endocriniens et musculaires humains. Cette approche renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en reliant les oscillateurs moléculaires circadiens aux produits fonctionnels de sécrétion. L'intégration de ces mesures au stade de la découverte soutient l'avancement ajusté au risque des programmes métaboliques et de chronobiologie à travers l'ensemble du portefeuille.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une détection mécanistique des risques en corrélant l'activité des gènes horloges avec la sécrétion d'hormones et de myokines dans des cellules humaines primaires.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en perturbant les gènes horloges essentiels et en quantifiant les effets sécrétoires en aval.
- Facilite une prédiction fiable du choix des voies pour les cibles métaboliques et endocriniennes.
Développement de criblages et de tests
- Établit des systèmes cellulaires primaires validés et synchronisés pour un développement robuste de tests.
- Fournit des lectures quantitatives et résolues dans le temps de l'expression génique et de l'activité sécrétoire.
- Permet une évaluation reproductible des effets de perturbations chimiques ou génétiques sur les fonctions régulées par l'horloge circadienne.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro avec la physiologie humaine pertinente pour la maladie en utilisant des cellules primaires d'îlots et musculaires.
- Permet la découverte de biomarqueurs translationnels en associant la perturbation de l'horloge moléculaire à des phénotypes fonctionnels de sécrétion.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique dans la recherche en métabolisme et en chronobiologie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode établit un lien entre la phase initiale de découverte et la recherche préclinique en permettant la vérification d'hypothèses sur la régulation circadienne dans des cellules primaires humaines, soutenant ainsi la validation des cibles et la continuité translationnelle.
- Découverte en biologie : Permet de tester directement la fonction des gènes circadiens et leur impact sur les voies de sécrétion.
- Écrantage : Fournit des modèles cellulaires primaires synchronisés et prêts à être utilisés dans des tests, avec des résultats quantitatifs pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Génère des données de bioluminescence et de sécrétion résolues dans le temps, permettant des comparaisons statistiques solides entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la perturbation de l'horloge moléculaire et des phénotypes sécrétoires pertinents pour les maladies dans des cellules humaines.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable pour évaluer la régulation circadienne dans divers types cellulaires primaires et cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de mesure à long terme et en parallèle dans les cellules humaines primaires.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en associant les résultats moléculaires et fonctionnels dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des programmes en métabolisme et en chronobiologie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en transduction lentivirale, en culture de cellules primaires et en mesure de la bioluminescence.
- Requiert un accès à des systèmes de périfusion synchronisés et à des dosages sensibles d'hormones ou de myokines.
- Exige une standardisation interéquipes pour la collecte reproductible de données cinétiques.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les types cellulaires primaires ou les paramètres sécrétoires étudiés.
- La stabilité du capteur rapporteur en culture prolongée doit être validée pour chaque application.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
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Title
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Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
