Name: Mesure parallèle dexpression Circadian Clock génique et la sécrétion dhormones dans des cultures de cellules humaines primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez une méthode de bioluminescence circadienne pour étudier la sécrétion hormonale dans les îlots pancréatiques humains et les myotubes primaires. Cette technique permet le suivi en temps réel des rythmes cellulaires et leur impact métabolique.

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Nous sommes reconnaissants à nos collègues de l&#39;Université de Genève: Jacques Philippe pour des commentaires constructifs sur ce travail, Ueli Schibler pour une aide précieuse au développement du système de perifusion et d&#39;inspiration scientifique, André Liani pour avoir conçu la conception, la fabrication et la mise en service de le système de perfusion, société Lesa-Technology LTD pour l&#39;assistance dans le système perifusion et le développement de logiciels Drip-biolumicorder, George Severi d&#39;assistance avec les expériences de périfusion, Ursula Loizides-Mangold pour la lecture critique du manuscrit, et Anne-Marie Makhlouf pour les préparations de lentivirus ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon et Hubert Vidal (INSERM, Lyon) pour la préparation de myoblastes primaires humains; et Domenico Bosco et Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Hôpital Universitaire de Genève) pour fournir des îlots humains. Ce travail a été financé par le n ° national suisse Science Foundation Grant 31003A_146475 / 1, le Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande verser Diabète de la Recherche, Fondation Bo Hjelt, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny, et la Société Académique de Genève (CD).

Déclaration éthique: Manipulations inclus dans ce protocole ont été approuvés par le comité d&#39; éthique de l&#39;hôpital universitaire de Genève et par l&#39;éthique Comité SUD EST IV (Accord 12/111) 19. Les îlots humains ont été isolés à partir de pancréas de donneurs multi-organes de mort cérébrale dans le Centre de transplantation Islet à l&#39;hôpital universitaire de Genève (Suisse) , comme décrit par nous dans les références 16,18, ou obtenu à partir d&#39; une source commerciale. 1. Préparation de la culture cellulaire primaire <ol><li> Isolement îlots pancréatiques humaines, Dissociation et Culture NOTE: Enduire chaque tube embout en plastique ou d&#39;une pipette avec Connaught Research Laboratories médicale (CMRL) afin d&#39;éviter les îlots ou les cellules des îlots de coller à la surface en plastique, qui peut conduire à une perte importante de matériel cellulaire moyen. <ol><li> Un jour avant l&#39;îlot dissociation cellulaire ajouter 1 ml de matrice extracellulaire laminine-5-riche (dérivé de 804G cellules comme descrilit en référence 29) par 3,5 cm plat. Avant étalement des cellules, aspirez la matrice et laver la vaisselle 3 fois avec de l&#39;eau bi-distillée stérile. Laisser le plat sécher sous la hotte à flux laminaire pendant 5 min. </li><li> A l&#39;intérieur de l&#39;armoire à flux laminaire, distribuer les îlots obtenus avec un milieu CMRL dans 15 tube (s) ml. Centrifuger à 272 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension le culot dans 1 ml d&#39;un tampon phosphate stérile une solution saline de Dulbecco (DPBS) préchauffée à 37 ° C sans calcium et magnésium. Centrifuger à 272 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de DPBS. </li><li> Pour compter le nombre total d&#39;îlots, pipettes 10 ul de la 1 ml suspension d&#39;îlots dans un nouveau 3,5 cm plat. Comptez le nombre d&#39;îlots dans la chute de 10 pi sous le microscope et de cette calculer le nombre total d&#39;îlots dans la suspension d&#39;îlots 1 ml. Ajouter 14 ml de DPBS et centrifuger la suspension cellulaire à une plustemps à 272 xg pendant 5 min. </li><li> Pour îlot cellulaire dissociation, aspirer le surnageant et ajouter 1 ml de solution de détachement cellulaire pour un maximum de 1000 équivalents d&#39;îlots (IEQ). Placer le tube dans un bain d&#39;eau à 37 ° C et mélanger délicatement les îlots par pipetage de haut en bas plusieurs fois par minute, pendant 6-10 min. REMARQUE: Pour vérifier la qualité de la digestion, pipeter une baisse de 2 pi de suspension sur une lame de verre et vérifier sous le microscope que toutes les cellules sont bien séparées, et qu&#39;aucun doublets ou amas de cellules sont restées. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 14 ml de milieu CMRL froid avec des suppléments (10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 1% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% de pénicilline-streptomycine (P / S), 1% de gentamycine, 1 pyruvate de sodium%). Centrifuger à 425 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et ajouter 15 ml de milieu CMRL au culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension le culot dans un petit volume de milieu CMRL avec des suppléments. Comptez le nombre de cellules au microscope en utilisant un hemocytocompteur, ajuster le volume CMRL afin d&#39;obtenir une concentration cellulaire de 650 ~ 000 cellules / ml. </li><li> Pipeter 3 gouttes séparées de 100 ul de chaque suspension cellulaire dispersée obtenue dans l&#39;étape 1.1.8 dans une boîte de 3,5 cm de pré-revêtu avec la laminine. NOTE: Les cellules attachent au plat dans environ 24 heures. </li><li> Incuber les cellules (figure 1A) dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C dans une chambre humide. Changer le support de la cellule tombe tous les 2-3 jours par aspiration 100 pi de chaque goutte et le remplacer par le même volume de milieu frais. </li></ol></li><li> Primary Human myoblastes Culture et Différenciation en myotubes <ol><li> La biopsie tissulaire, l&#39;isolement des cellules satellites et la culture des myoblastes Note: Des biopsies musculaires ont été obtenus à partir du groupe d&#39;Etienne Lefai (INSERM, Lyon, France) 19. <ol><li> Purifier myoblastes squelettiques primaires selon la procédure décrite précédemment 30. </li></ol></li><li> Différencier pmyoblastes humains rimaires en myotubes <ol><li> Prendre une fiole (1 x 10 6 cellules) de myoblastes humains stockés dans de l&#39; azote liquide et décongeler rapidement les cellules en plaçant le flacon pendant 30 secondes à 1 minute dans un bain-marie à 37 ° C sous agitation. </li><li> les cellules pipeter (1 ml) dans 24 ml de milieu de culture composé de HAM F-10 supplémenté avec 20% de FBS, 1% P / S, 0,5% et 0,2% de gentamycine amphotéricine B </li><li> Centrifugeuse 5 min à 150 x g. </li><li> Éliminer les cellules et remettre en suspension le surnageant avec 15 ml de milieu de croissance frais par 2,5 x 10 5 cellules. </li><li> Plate au moins 2,5 x 10 5 cellules par F75 flacon adhérentes. Maintenir les myoblastes dans un incubateur de cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Une fois que les cellules atteignent 60-80% de confluence, dissocie les cellules avec trypsine-EDTA 0,05% pendant 1-2 min et les plaque dans 2 ml de milieu de croissance sur adhérentes 3,5 cm des boîtes de Petri. </li><li> Après avoir atteint la confluence, éliminer le milieu de croissance. </li><li> Démarrez le proto de différenciationcol de myoblastes humains dans des myotubes en les cultivant dans 2 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 1 g / L de glucose, 2% de FBS, 1% P / S, 0,5% de gentamicine et 0,2% de l&#39;amphotéricine B (milieu de différenciation) dans un incubateur de cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. Changer le milieu tous les 2 à 3 jours. NOTE: Les myotubes sont généralement formées dans les 7-10 jours. </li><li> Contrôler la différenciation des cellules des muscles sous le microscope (figure 2A) , en observant la fusion de myoblastes en myotubes 19 polynucléaires. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. petits ARN interférents (siRNA) Transfection <ol><li> siRNA Transfection de cellules d&#39;îlots humains NOTE: Le protocole de transfection est réalisée dans des gouttes de 100 ul sur le lendemain après dissociation cellulaire (étapes 1.1.1-1.1.10). <ol><li> Aspirer 100 ul de milieu CMRL de chaque goutte et le remplacer par le même volume de sans sérum milieu essentiel minimal (MEM) 2 havant la transfection par pipetage. </li><li> Préparer un mélange à base de MEM-réactif de transfection et 50 nM d&#39;ARNsi cible (SICLOCK) ou 50 nM de ciblage non siControl selon les instructions du fabricant. <ol><li> Pour un plat avec 3 gouttes préparer deux tubes de 1,5 ml avec 200 pi de MEM chacun. </li><li> Ajouter à l&#39;un de ces tubes 4 ul de réactif de transfection. </li><li> Ajouter au second tube 1 pi de la solution de siRNA appropriée du stock (20 uM). </li><li> Agiter ces deux tubes lentement sur l&#39;agitateur orbital pendant 5 min, puis mélanger le contenu des tubes ensemble et agiter pendant 20 min plus. </li></ol></li><li> Aspirer 100 pi de MEM de chaque goutte et le remplacer par le même volume de mélange de transfection obtenu à l&#39;étape précédente par pipetage. </li><li> Remplacer la solution de transfection avec un milieu CMRL après 4 heures d&#39;incubation à 37 ° C. Répétez les étapes 2.1.1-2.1.3 le jour suivant pour la cellule re-transfection. </li></ol></li><li> siRNA Transfection des myotubes humaines <ol><li> Avant la transfection, remplacer le milieu (voir l&#39;étape 1.2.2.8) avec 2 ml de milieu de différenciation frais par 3,5 cm boîte de Pétri. </li><li> Dans un tube de 1,5 ml stérile, de préparer un mélange de 20 nM de siRNA (siControl ou SICLOCK), ce qui correspond à 2,4 ul d&#39;une solution 20 uM d&#39;ARNsi, et 12 pi de réactif de transfection dilué dans 100 ul de milieu de différenciation. Incuber la solution à température ambiante pendant 15 min sous agitation douce. </li><li> Cellules transfecter avec 114,4 pi du mélange siRNA par 3,5 cm de Pétri cellules plat et placer dans un incubateur de culture de tissus à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures. </li></ol></li></ol> 3. continue à long terme circadien bioluminescence Enregistrement réalisé en parallèle avec l&#39;évaluation de la sécrétion d&#39;hormones dans les cellules vivantes primaires humaines <ol><li> Présentation de circadiens Reporters bioluminescence dans des cellules primaires humaines parLentiviral transduction NOTE: Toutes les procédures avec des particules lentiviraux doivent être effectuées dans un niveau de biosécurité 2 installation de prendre des précautions supplémentaires pour le travail avec des agents qui présentent un risque potentiel modéré pour le personnel et l&#39;environnement. <ol><li> Préparer des particules de lentivirus reporter par co-transfection du vecteur d&#39;intérêt pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc ou pLV156-Per2-dLuc (appelé Bmal1-luc et Per2-luc, respectivement) plasmide 31 avec les vecteurs lentiviraux pMD2G et psPAX dans des cellules 293T en utilisant la méthode de polyéthylènimine (pour la procédure détaillée , voir référence 16). </li><li> Titrer les particules lentiviraux obtenus (détails sur le titrage peuvent être obtenus à http://lentilab.unige.ch/). Pour d&#39; autres expériences, utiliser les lentivirus avec des titres allant de 10 4 à 10 5 unités de transduction [TU / ul]. </li><li> La place des plats avec des cellules d&#39;îlots humains ou myoblastes humains (à 30-50% de confluence) à l&#39;intérieur de la cabine à flux laminaireet et remplacer le milieu avec 2 ml de milieu frais supplémenté CMRL (voir étape 1.1.7) ou milieu de croissance (voir l&#39;étape 1.2.2.2), respectivement. </li><li> Calculer la multiplicité d&#39;infection (MOI) ( à savoir les particules infectieuses (unités de transduction) / nombre de cellules). </li><li> Transduire la culture de cellules primaires en pipetant une solution lentivirus à l&#39;antenne afin d&#39;obtenir une MOI = 3 (par exemple, pour 65 000 cellules attachées ajoute 3 ul de la solution de virus avec un titre de 6,5 x 10 4-100 goutte ul de milieu). </li><li> Incuber une nuit dans un incubateur de culture tissulaire. Changer le milieu le lendemain. REMARQUE: transduire des cellules d&#39;îlots humains au moins 4 jours avant l&#39;enregistrement de bioluminescence afin d&#39;obtenir une expression suffisante de la construction de rapporteur. Myoblastes sont transduits au cours de la phase d&#39;expansion, puis cultivées jusqu&#39;à la confluence, puis différenciées en myotubes. </li></ol></li><li> In Vitro Synchronisation des cellules primaires humaines <ol> &lt;li&gt; Ajouter 10 uM de adénylcyclase activateur dans 2 ml de milieu par 3,5 cm de Pétri plat contenant les cellules primaires précédemment transduites à l&#39;étape 3.1.5. </li><li> Incuber pendant 60 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Changer le milieu contenant l&#39;activateur de l&#39;adényl cyclase avec 2,5 ml du milieu d&#39;enregistrement contenant 100 pM de luciférine. Remarque: Pour des cellules d&#39;îlots humains utilisent CMRL supplémenté avec 10% de FBS, 1% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 1% de gentamycine; pour les myotubes humains utilisent le rouge de phénol - DMEM exempt de 1 g / L de glucose supplémenté avec 2% de FBS, 2% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 0,5% et 0,2% de gentamycine amphotéricine B </li></ol></li></ol> 4. Évaluation parallèle de Circadian bioluminescence Enregistrement et Hormone Profils Sécrétion dans les cellules Synchronized humain sécrétoire primaire <ol><li> Configuration à long terme de périfusion Constant et bioluminescence Enregistrement pour les cellules primaires humaines. NOTE: Lorsque les aboutissants de travailide la hotte à flux laminaire, nettoyer toutes les surfaces de contact et de limiter l&#39;exposition des cultures ou du milieu à l&#39;air pour éviter toute contamination. <ol><li> Pour préparer le milieu de périfusion, ajouter 100 pM de luciférine dans le milieu. Remarque: Pour des cellules d&#39;îlots humains utilisent CMRL supplémenté avec 10% de FBS, 1% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 1% de gentamycine; pour les myotubes humains utilisent le rouge de phénol - DMEM exempt de 1 g / L de glucose supplémenté avec 2% de FBS, 2% de L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 0,5% et 0,2% de gentamycine amphotéricine B </li><li> A l&#39;intérieur de l&#39;armoire à flux laminaire, ouvrir les 3,5 cm plats contenant les cultures transduites, transfectées et synchronisés primaires cellulaires (cellules ou îlots myotubes) comme décrit ci-dessus. Insérer bouchons métalliques stériles (développés en interne) (figure 1B2) dans les plats cm 3.5 qui sont équipées avec du silicone afflux / tubes d&#39;efflux de liaison (Figure 1B1 / B5). </li><li> Placez les plats sur la plate-forme de mesure dans le 37 ° C light étanche incubateur. Fixer les plats à la plate - forme en utilisant un adaptateur vissable (figure 1B3). Insérez les tubes afflux / efflux du système perifusion dans les tubes de silicone appropriés du bouchon (Figure 1B1 / B5) et régler la vitesse de la pompe à un débit de ~ 0,5 ml de milieu par 1 h. </li><li> Ouvrez le logiciel Drip-biolumicorder développé en interne qui enregistre les signaux provenant du tube photomultiplicateur (PMT) détecteur. Choisissez le répertoire où les données seront stockées et commencent bioluminescence continue l&#39;enregistrement de chaque plat en cliquant sur le bouton «Démarrer». REMARQUE: Vous pouvez également le logiciel Drip-biolumicorder, d&#39; autres programmes (par exemple LumiCycle), peuvent être utilisés pour enregistrer des signaux provenant du détecteur PMT. </li><li> Placez 6 puits des plaques de culture de tissus stériles dans la zone de collecte sur la glace. </li><li> Ouvrez le logiciel de commande qui commande la synchronisation du commutateur automatique entre les puits de collecte. Mettre en place le temps window de milieu collection (s). Commencez la collecte du milieu d&#39;écoulement toutes les 4 h (14,400 sec; ~ 2 ml par point de temps) en cliquant sur l&#39;icône &quot;run&quot;. </li><li> Transfert et mesurer le moyen de sortie de chaque collection bien dans 2 ml tubes stériles par pipetage. Maintenir les tubes dans un congélateur à -20 ° C avant de commencer l&#39;étape suivante. Répétez les étapes 4.1.5-4.1.6 toutes les 24 h. </li><li> Arrêtez l&#39;enregistrement de bioluminescence et le débit moyen en cliquant sur l&#39;icône «stop» sur le logiciel correspondant. Retirez les bouchons métalliques et aspirer le milieu résiduel de la vaisselle. </li><li> Afin de normaliser les valeurs de protéines sécrétées obtenues dans des expériences différentes, soit d&#39; extraire l&#39; ADN ( la normalisation par la teneur en ADN génomique pour les myotubes 19) ou ajouter 1 ml de tampon de lyse acide-éthanol ( la normalisation par la teneur totale en hormone à des cellules d&#39;îlots 18) à la vaisselle. </li></ol></li></ol> 5. Mesurer les niveaux hormonaux et Islet MYOKINE dans le OutflowMoyen Obtenu par périfusion continu de cellules endocrines primaires humaines <ol><li> Insuline <ol><li> Quantifier les niveaux d&#39;insuline basale dans le milieu d&#39;écoulement de points de temps recueillies en utilisant une insuline enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit humain en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Normaliser les données sur le volume total du fluide recueilli dans chaque puits et la teneur en insuline totale, extraite à partir des cellules traitées à l&#39; acide de l&#39; éthanol , à la fin de l&#39;expérience (étape 4.1.9) 18. </li></ol></li><li> Interleukine-6 ​​(IL-6) <ol><li> Quantifier basale d&#39;IL-6 dans le milieu d&#39;écoulement de points de temps recueillies en utilisant un kit IL-6 humaine ELISA suivant les instructions du fabricant. </li><li> Normaliser les données sur le volume total du fluide recueilli dans chaque puits et la teneur en ADN génomique, à la fin de l&#39;expérience (étape 4.1.9). </li></ol></li></ol> 6. circadiens Analyses Dataset pour Bioluminescence et Hormone Profils Sécrétion <ol><li> L&#39;analyse par bioluminescence <ol><li> Analyser le profil de bioluminescence en utilisant le logiciel fourni 19. </li></ol></li><li> L&#39;analyse du cycle JTK <ol><li> Analyser les profils de sécrétion d&#39;hormones et d&#39;enregistrement des résultats de bioluminescence en utilisant l&#39;algorithme de 32 JTK_CYCLE. </li><li> Régler la largeur de la période circadienne à 20-24 h. NOTE: Dans le cas où les conditions expérimentales ont été enregistrées en parallèle, une analyse statistique apparié peut être effectuée pour comparer les expériences. </li></ol></li><li> Analyse CosinorJ <ol><li> Vous pouvez également analyser la sécrétion de l&#39; hormone et les profils de bioluminescence circadiens en utilisant le logiciel CosinorJ 28. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les paramètres expérimentaux décrits ici sont composés de livraison lentiviral de reporters de bioluminescence circadiens dans des cellules primaires humaines en culture, suivie par une synchronisation ultérieure in vitro et l&#39; enregistrement continu de bioluminescence pendant plusieurs jours, et l&#39; analyse parallèle de la sécrétion d&#39; hormones par les mêmes cellules. Ils représentent une approche efficace pour explorer les mécanismes moléculaires et les aspects fonctionnels des horloges circadienne...

Le système de chronométrage circadien (du latin &quot;Circa diem&quot;) a vu le jour dans tous les organismes sensibles à la lumière, comme un mécanisme d&#39; adaptation à la rotation de la Terre. Chez les mammifères, elle est organisée de façon hiérarchique, qui englobe l&#39;horloge centrale, qui est située dans le noyau suprachiasmatique de l&#39;hypothalamus ventrale et périphérique (ou esclave) qui sont des oscillateurs fonctionnant dans différents organes. En outre, ces oscillateurs autonomes auto-entretenues cellules sont fonctionnelles dans presque toutes les cellules du corps 1. Signaux photiques représentent un signal de synchronisation dominant (Zeitgeber) pour les neurones du RCS, alors que les signaux neuronaux et humorale émanant du SCN réinitialiser les horloges périphériques. En addition des rythmes de repos-activité, qui poussent dans les cycles d&#39;alimentation à jeun tour, sont d&#39; autres synchroniseurs pour horloges périphériques 2. D&#39;après les connaissances actuelles, la composition moléculaire de l&#39;horloge de base est basée sur la transcription et traducboucles de rétroaction tions, qui sont conservées entre les organismes. Cela comprend les activateurs de transcription BMAL1 et CLOCK, qui activent ensemble la transcription des gènes négatifs noyau horloge PER et CRY. Des niveaux élevés de PER et de protéines CRY inhibent leur propre transcription par l&#39;inhibition du complexe / CLOCK BMAL1. Une boucle auxiliaire se compose des récepteurs nucléaires REV-Erbs et reurs, qui régulent également la transcription de BMAL1 et CLOCK. En outre, les événements post - traductionnelles , y compris la phosphorylation, sumoylation, acétylation, O-GlcNAcylation, la dégradation et l&#39; entrée nucléaire des protéines noyau d&#39;horloge représentent une couche supplémentaire de régulation important dans l&#39; établissement du cycle d&#39;oscillation 24 h 3. L&#39;accumulation des données provient des études dans des modèles de rongeurs et met en évidence le rôle critique du système circadien dans la coordination des fonctions métaboliques et endocriniens 4-5. Un certain nombre de large-échelle de l&#39; analyse du transcriptome suggèrent que l&#39; alimentation - cycles de jeûne jouent un rôle central dans la synchronisation des oscillateurs périphériques 6-8. En accord avec ces études, l&#39; analyse métabolomique et lipidomiques chez les rongeurs et les humains ont révélé qu&#39;un grand nombre de métabolites osciller dans les tissus, le plasma et la salive d&#39;une manière circadien 9-11. Fait important, la plupart des hormones présentent des rythmes circadiens dans 5,12-13 de sang. En outre, les horloges circadiennes de l&#39;hormone correspondante produisant des tissus périphériques pourraient réguler la sécrétion d&#39;hormones localement. Oscillateurs circadiens cellulaires autonomes ont été décrits dans les rongeurs et les cellules des îlots pancréatiques humains 14-16. Ces oscillateurs jouent un rôle essentiel dans la régulation de l&#39;îlot transcriptome du pancréas et de la fonction 15,17-18. En outre, la sécrétion Myokine par myotubes squelettiques humains a été démontré récemment pour présenter un modèle circadien, qui est régulée par oscillato cellulaire autonomers opératoires dans ces cellules 19. Plusieurs approches pour l&#39; étude des rythmes circadiens chez les humains in vivo ont été largement utilisés. Par exemple, la mélatonine plasmatique ou les niveaux de cortisol, ainsi que thoracique température de surface de la peau (revue dans les références 3,20) ont été étudiés pour évaluer horloges circadiennes endogènes. Bien que ces méthodes permettent d&#39; étudier les oscillations circadiennes systémiques in vivo, ils sont loin de fournir une évaluation fiable des rythmes circadiens autonomes libres fonctionnant dans différents organes et tissus. Néanmoins, une telle dissection de la régulation systémique serait un outil indispensable pour la compréhension de l&#39;effet spécifique des horloges moléculaires intracellulaires sur la fonction de ces cellules. Par conséquent, un effort important a été entrepris pour développer des approches fiables pour l&#39; étude des horloges humaines dans des cellules cultivées immortalisées ou primaires synchronisées in vitro. Surtout, il a été démontré quecaractéristiques d&#39;horloge mesurées dans des cellules de fibroblastes primaires de peau en culture reflètent étroitement les propriétés d&#39;horloge individuelles de l&#39;ensemble de l&#39; organisme 21. Le développement des reporters circadiens fluorescents et bioluminescentes a considérablement avancé cette approche 22-27. En outre, l&#39; étude des horloges de cellules primaires qui sont dérivées de différents organes périphériques permet l&#39;étude des propriétés moléculaires des horloges spécifiques de tissus humains 3,5,16,19-20,28. Ainsi, l&#39; évaluation des horloges circadiennes dans explants in vitro ou les cellules primaires synchronisées, en utilisant les journalistes bioluminescentes, représente une méthode très utile pour étudier la composition moléculaire des horloges périphériques humaines et leur impact sur le fonctionnement des organes. Dans cet article, nous présenterons des protocoles détaillés pour l&#39; évaluation de l&#39; expression du gène circadien dans les cellules des îlots pancréatiques primaires et les muscles squelettiques humains synchronisés in vitro, ainsi que l&#39;impact de l&#39; horloge cellulaire autonomela perturbation de la fonction de sécrétion de ces cellules.

<table><tbody><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>Pour la digestion par biopsie musculaire</td></tr><tr><td>DPBS pas de calcium pas de magnésium</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>HAM F-10</td><td>Invitrogen</td><td>41550-021</td><td>Pour la culture de myoblastes</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270</td><td>Complément au milieu de culture</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781-100</td><td>Complément au milieu de culture</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Axone&nbsp ;</td><td>A1492.0001</td><td>Complément au milieu de culture</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-026</td><td>Amphotéricine B, complément au milieu de culture</td></tr><tr><td>DMEM 1g/L de glucose + Na pyruvate + glutamax&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>21885-025</td><td>Pour la culture de myotubes</td></tr><tr><td>DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>11880-028</td><td>Support d’enregistrement pour LumiCycle</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-028</td><td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide, complément au milieu d’enregistrement</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>Solution de détachement cellulaire, pour la dissociation des cellules des îlots</td></tr><tr><td>CMRL</td><td>Gibco</td><td>21530-027</td><td>Milieu de culture pour cellules d’îlots pancréatiques</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td>Complément au milieu de culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube conique en polypropylène haute clarté</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>F75 Flacon</td><td>BD Falcon 353136</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm Boîte de Pétri</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Foskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td>Activateur d’adénylyl cyclase, utilisé pour la synchronisation</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Prolume LTD</td><td>260150</td><td>Complément au support d’enregistrement</td></tr><tr><td>OptiMEM&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Sans sérum Minimal Essential Medium (MEM) utilisé pour la transfection de cellules d’îlots pancréatiques humains</td></tr><tr><td>Réactif de lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>HiPerFect Réactif</td> de <td>transfection</td><td>Qiagen</td><td>301705</td></tr><tr><td>ON-TARGET plus siCLOCK smartpool&nbsp ;</td><td>Dharmacon</td><td>L-008212-00</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGET plus siRNA #1 non ciblé (siControl)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-01</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de mouchoirs&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Pour l’extraction d’ADN de myotubes</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Pour l’extraction d’ARN de myotubes</td></tr><tr><td>QIAshredder&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Pour l’extraction de l’ARN des myotubes</td></tr><tr><td>Tubes collecteurs de 2 ml</td><td>Axygen</td><td>311-10-051</td><td>Pour collecter le milieu avec la périfusion Plaque de</td></tr><tr><td>culture tissulaire, 6 puits</td><td>BD Falcon&nbsp ;</td><td>353046</td><td>Pour prélever le milieu avec le kit de périfusion</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>Pour l’extraction de l’ARN des îlots de Langerhans</td></tr><tr><td>Humain IL-6 Kit ELISA instantané&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>88-7066-22</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’insuline humaine Mercodia</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-01</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique, min,37 %,p.a.</td><td>Acros organics</td><td>124630010</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon de lyse (375 ml Éthanol + 7,5 % HCl + 117,5 % H2O)</td></tr><tr><td>Éthanol (>99,8 %)</td><td>Fluka Analytical</td><td>02860-1L</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon de lyse (375 ml Éthanol + 7,5 % HCl + 117,5 % H2O)</td></tr><tr><td>Îlots humains pour la recherche</td><td>Prodo Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>VWR</td><td>1112A</td><td>&nbsp ; à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Tissu culture hood</td><td>Faster&nbsp ;</td><td>SafeFastElite</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture de tissu</td><td>Heraeus</td><td>HeraCell 150</td><td>5 % CO2 à 37 &deg ; C, pas d’eau grâce à l’installation LumiCycle</td></tr><tr><td>Incubateur de culture Tissu</td><td>Heraeus</td><td>HeraCell 150</td><td>5 % CO2 à 37 &deg ; C, pas d’eau grâce à l’installation LumiCycle</td></tr><tr><td>Tissu culture incubateur</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hera Cell 150i</td><td>5 % CO2 à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Heidolph Instruments</td><td>Unimax 1010</td><td>Pour l’agitation du mélange de siRNA</td></tr><tr><td>LumiCycle</td><td>Actimetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel LumiCycle</td><td>Actimetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CosinorJ</td><td>logiciel EPFL</td><td></td><td>Disponible gratuitement sur : http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/</td></tr> <tr><td>Rheodyne titan MX&nbsp ;</td><td>ERC GmbH</td><td></td><td>Logiciel de commande qui contrôle la synchronisation du changement automatique</td></tr></tbody></table>

mesure parallèle d&#39;expression circadian clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Les horloges circadiennes sont fonctionnelles dans tous les organismes sensibles à la lumière, ce qui permet une adaptation au monde extérieur, en anticipant les changements environnementaux quotidiennes. Des progrès considérables dans notre compréhension de la connexion étanche entre l&#39;horloge circadienne et la plupart des aspects de la physiologie ont été réalisés dans le domaine au cours de la dernière décennie. Cependant, effilocher la base moléculaire qui sous-tend la fonction de l&#39;oscillateur circadien chez l&#39;homme reste de la plus haute défi technique. Ici, nous fournissons une description détaillée d&#39;une approche expérimentale à long terme (2-5 jours) enregistrement bioluminescence et de collecte de moyen d&#39;écoulement dans les cellules primaires humaines en culture. A cet effet, nous avons transduit des cellules primaires avec un reporter de luciférase lentivirale qui est sous le contrôle d&#39;un promoteur de gène d&#39;horloge de base, ce qui permet l&#39;évaluation parallèle de la sécrétion d&#39;hormones et de bioluminescence circadien. En outre, nous décrivons les conditions pour perturber l&#39;horloge circadienne dans prcellules humaines imary en transfectant siRNA CLOCK ciblage. Nos résultats sur la régulation circadienne de la sécrétion d&#39;insuline par les îlots pancréatiques humains, et Myokine la sécrétion par les cellules musculaires squelettiques humaines, sont présentés ici pour illustrer l&#39;application de cette méthodologie. Ces paramètres peuvent être utilisés pour étudier la composition moléculaire des horloges périphériques humaines et d&#39;analyser leur impact fonctionnel sur les cellules primaires dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques.

Évaluation de l&#39;Islet Hormone Sécrétion avec Parallel Circadian bioluminescence Enregistrement à partir de cellules Perifused îlots humains Après avoir fourni une première caractérisation moléculaire de l&#39;horloge circadienne, fonctionnant dans des cellules d&#39;îlots humains 16, nous avons pour but d&#39;étudier l&#39;impact de la perturbation de l&#39; horloge sur la fonction des îlots et la transcription ...

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer simultanément la bioluminescence circadienne et l'activité sécrétoire de cellules endocrines primaires humaines cultivées et synchronisées in vitro. Cette méthode permet d'étudier le profil temporel de la sécrétion cellulaire et la manière dont il peut être régulé par des horloges circadiennes autonomes au niveau cellulaire. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à surveiller l'activité rapporteur de la luciférine circadienne tout en collectant simultanément le milieu de perfusion afin de mesurer les concentrations d'hormones et de myokines sécrétées. Pour introduire des rapporteurs de bioluminescence circadienne dans les cellules primaires par transduction lentivirale, commencez par transférer les boîtes de Pétri de 3,5 cm contenant des myoblastes humains présentant une confluence de 30 à 50 % dans une hotte à flux laminaire. Remplacez le milieu des myoblastes humains par 2 mL de milieu de croissance. Ensuite, transduisez la culture cellulaire primaire en ajoutant, à l’aide d’une pipette, une solution de lentivirus dans la boîte de Pétri afin d’obtenir une multiplicité d'infection égale à trois. Incubez les cellules toute la nuit dans une incubateur pour culture cellulaire. Changez le milieu le jour suivant. Pour assurer la synchronisation in vitro, ajoutez 10 micromoles d'activateur de l'adénylyl cyclase dans 2 mL de milieu par boîte de Pétri de 3,5 cm contenant les cellules primaires préalablement transfectées. Incubez les cellules pendant 60 minutes à 37

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Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

La procédure de préparation des tranches contenant les souris adulte hypothalamique suprachiasmatique noyau (SCN), et un moyen rapide de la culture des tissus SCN dans un état de culture organotypique, sont rapportés. En outre, la mesure de l'expression de la protéine horloge oscillatoires gènes en utilisant la technologie Dynamic rapporteur de la luciférase est décrite.

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c'est à dire qu'ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d'horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l'étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

L'horloge circadienne régule environ un tiers du transcriptome Arabidopsis, mais le pourcentage de gènes qui se nourrissent de nouveau dans timekeeping reste inconnue. Ici, nous visualisons une méthode pour évaluer rapidement les phénotypes circadiens dans toute lignée mutante d'Arabidopsis en utilisant l'imagerie luminescente d'un journaliste circadien transitoirement exprimé en protoplastes.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

Luciférase génétiquement encodé est un journaliste populaire non invasif de l’expression génique. Utilisation d’une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) permet l’enregistrement longitudinal des cellules bioluminescentes sous un large éventail de conditions. Ici, nous montrons comment ALLIGATOR peut être utilisé dans le cadre de la recherche de rythmes circadiens.

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

Cette technologie nouvellement développée basés sur la fluorescence permet une surveillance à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de se déplaçant librement les souris en temps réel et à une haute résolution temporelle.

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

Ce protocole décrit une technique utilisant des splénocytes de souris pour découvrir les modèles moléculaires associés aux pathogènes qui modifient l’expression des gènes horloge moléculaire.

L’utilisation des splénocytes de souris afin d’évaluer les micro-organismes pathogènes associés un motif moléculaire Influence sur l’Expression génique horloge

Ici, nous présentons une méthode pour étudier les rythmes diurnes dans la performance suivant la catégorisation précise des participants dans les groupes circadiens de phénotype basé sur le questionnaire de chronotype de Munich, les biomarqueurs circadiens standard d’or et les mesures actigraphiques.

Phénotypage circadien humain et tests de performance diurne dans le monde réel

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Ce rapport décrit une méthode impliquant un script R dans le logiciel open source RStudio pour analyser des ensembles de données à grande échelle obtenus à partir d’expériences de séries chronologiques.

Une analyse R conviviale et puissante des ensembles de données à grande échelle

Découvrez une méthode de bioluminescence circadienne pour étudier la sécrétion hormonale dans les îlots pancréatiques humains et les myotubes primaires. Cette technique permet le suivi en temps réel des rythmes cellulaires et leur impact métabolique.

Mesure parallèle d'expression Circadian Clock génique et la sécrétion d'hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

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