Name: En utilisant le composé déthylène de libération, lacide 2-chloroéthylphosphonique, comme un outil pour étudier la réponse de léthylène chez les bactéries (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez une méthode sécurisée pour étudier la réponse bactérienne à l'éthylène en utilisant l'acide 2-chloroéthylphosphonique (CEPA). Cette technique permet de produire de l'éthylène in situ sans manipulation de gaz dangereux.

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Les auteurs remercient le Dr Dario Bonetta pour la fourniture de graines d’Arabidopsis thaliana et pour l’assistance technique concernant le test à triple réponse, ainsi que Simone Quaranta pour son aide avec FT-IR. Ces travaux ont été soutenus par une subvention à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG-DG) à JLS, une bourse d’études supérieures de l’Ontario (BEO) à RVA et une bourse d’études supérieures Queen Elizabeth II en sciences et technologie (QEII-GSST) à AJV.

1. Produits chimiques <ol><li> Préparer une solution mM CEPA 500 (144,49 g / mol) et une solution comprenant à la fois du NaCl 500 mM (58,44 g / mol) et 500 mM de NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) dans acidifiée (pH 2,5) de l&#39;eau ultra-pure ou HCl 0,1N. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex jusqu&#39;à ce que les solutions sont claires. </li><li> Diluer en série (10x) les solutions 500 mM dans le même solvant pour obtenir 5 mM et des stocks 50 mM. </li><li> Préparer une solution 10 mM de 1-aminocyclopropane-carboxylique (ACC; 101,1 g / mol) dans de l&#39;eau ultra-pure. </li><li> Filtre-stériliser les solutions mères et aliquotes stocker à -20 ° C. </li><li> Filtre-stériliser cellulase. aliquotes Conserver à 4 ° C. </li></ol> 2. Vérification de production d&#39;éthylène de 2-chloroéthylphosphonique Acid Décomposition: Assay Triple Response <ol><li> Surface-stériliser Arabidopsis thaliana Seeds Ecotype Columbia Utilisation de la vapeur en phase Méthode: ATTENTION: L&#39;étape suivante produit toxic chlore gazeux. Effectuer la stérilisation des semences dans une hotte. <ol><li> Procurez-vous un contenant hermétique assez profond pour accueillir un bécher en verre de 250 ml pour la stérilisation des semences et le placer dans une hotte. </li><li> Ajouter A. thaliana graines à un tube à centrifuger et placer le tube dans un rack. Placer la grille contenant le tube ouvert dans le récipient hermétique. Note: Ne pas remplir des tubes individuels plus de la moitié plein pour permettre au gaz de chlore de pénétrer les graines inférieures. </li><li> Placez un bécher de 250 ml contenant 100 ml d&#39;eau de Javel commerciale dans le récipient hermétique. ajouter avec précaution 3 ml d&#39;HCl concentré à l&#39;eau de Javel et sceller immédiatement le récipient avec son couvercle. ATTENTION: Bleach et HCl réagissent pour produire du chlore gazeux toxique qui agit à la surface-stériliser les graines. </li><li> Incuber les graines en présence de chlore gazeux pendant 4 heures dans la hotte. Remarque: plus longs temps de stérilisation réduisent l&#39;efficacité de la germination. </li><li> Après stérilisation, laisser le cgaz hlorine pour évacuer dans la hotte pendant au moins 1 h puis sceller le tube de microcentrifugation. Laissez l&#39;eau de Javel et le mélange HCl dans la hotte pendant au moins 24 heures avant de les jeter. Remarque: les graines stérilisées peuvent être conservés à température ambiante pour une utilisation immédiate. </li><li> Gardez les graines à 4 ° C pour le stockage à long terme. Apportez des graines à la température ambiante avant d&#39;ouvrir le tube de microcentrifugation pour éviter la condensation. graines de magasin dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Préparer des plaques d&#39;agar dans 4-secteur des boîtes de Pétri (90 x 15 mm): <ol><li> Préparer 110 ml de milieu de croissance pour A. thaliana plants: 1x Murashige et Skoog (MS) d&#39; un milieu de base 15 (4,33 g / L) contenant 1% (p / v) de saccharose et 0,8% (p / v) d&#39; agar - agar. Ajuster le milieu MS à pH 6 avec NaOH. </li><li> Préparer 100 ml de milieu de croissance bactérienne pour la décomposition CEPA: Schramm et Hestrin (SH) milieu 16 contenant 1,5% (p / v) d&#39; agar - agar. Ajuster le milieu SH à un pH de 7 avec NaOH. </li><li> Stériliser médias par autoclavage et Temper dans un bain d&#39;eau C 55 °. </li><li> Une fois que la gélose MS a trempé, ajouter 40 ml dans un flacon stérile. Pour préparer le milieu de croissance témoin positif pour R. thaliana semis, complètent les 40 ml aliquote de gélose MS avec 40 pl de mM ACC 10 pour obtenir une concentration finale de 10 uM ACC. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu aux quadrants appropriés des plats sectorisées Petri (figure 1) et laisser la gélose se solidifier. Préparer toutes les plaques en trois exemplaires. Remarque: la LCPE ne sont pas ajoutés au milieu de croissance jusqu&#39;à ce que plus tard dans le protocole. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Figure 1:. Mise en place de plaques d&#39; agar utilisés pour le dosage de la triple réponse à la LCPE Un schéma illustre les quadrants spécifiques pour le contrôle négatif (A), le contrôle positif (B), et les plaques expérimentales (C). Ce chiffre a été modifié depuis Augimeri et Strap 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="3"><li> Stratify A. thaliana Seeds pour assurer Germination synchrone: <ol><li> Ajouter environ cinquante A. thaliana graines sur chaque quadrant contenant de la gélose MS ou MS + ACC. Veiller à graines sont réparties uniformément pour faciliter le retrait et l&#39;analyse des semis. </li><li> Incuber les plaques contenant des graines dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant 3-4 jours. </li></ol></li><li> Décomposer LCPE sur Milieu de croissance bactérienne (SH) et effectuer Triple Response Assay: <ol><li> Après stratification, exposer les graines à la lumière fluorescente pendant 2 heures. </li><li> Étaler 10 pi de la LCPE mM solution mère 500 sur les quadrants des plaques expérimentales contenant de la gélose SH (pH 7; Figure 1) pour obtenir une concentration finale de la LCPEde 1 mM. </li><li> Sceller les plaques avec un film de laboratoire et couvrir de papier pour créer un environnement sombre pour les graines. </li><li> Germer des graines par incubation des plaques dans l&#39;obscurité à 23 ° C pendant 3 jours avec le côté agar vers le bas. Remarque: Les plaques peuvent être empilés, mais les contrôles négatifs doivent être placés sur le fond depuis l&#39;éthylène est plus léger que l&#39;air. </li></ol></li><li> Analyser Triple Response Assay données: <ol><li> Avec des pinces de flamme stérilisée, retirer les semis simples à partir d&#39;une plaque correspondant à chaque traitement et vue sous une dissection ou d&#39;un microscope numérique USB. Assurer le fond des plants sont alignés et photographie. </li><li> Retirer 30 plants de chaque quadrant (60 plants par répétition biologique et 180 plants par traitement). Aligner sur une surface avec un fond noir et la photographie avec une règle. </li><li> Mesurer la longueur de l&#39; hypocotyle (mm) de plants répliqués en utilisant le logiciel ImageJ 17. Réglez l&#39;échelle en cliquant et en faisant glisser le * Droit *Outil pour sélectionner une longueur de 10 mm. Sélectionnez &quot;Scale Set&quot; sous l&#39;onglet &quot;Analyser&quot; et régler la distance connue à 10. Utilisation de l&#39;outil * segmenté *, cliquez et faites glisser pour sélectionner la longueur de l&#39;hypocotyle et appuyez sur M pour mesurer la distance. Comparez les moyens de répétitions biologiques à l&#39;aide d&#39;une ANOVA à une voie avec un test de comparaison multiple de Tukey. Les différences sont considérées comme significatives si p &lt;0,05. </li></ol></li></ol> 3. Analyse du pH tout au long de la croissance bactérienne <ol><li> Cultivez et Quantifier Komagataeibacter Cultures xylinus Starter en Triplicate: <ol><li> Inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. Incuber les cultures à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu&#39;à ce qu&#39;une DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h). </li><li> Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). 5 ml stérile à 0,85% (p / v) de NaCll de solution, se laver les cellules deux fois et remettre en suspension le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace. </li><li> Quantifier cellules à l&#39;aide d&#39;une chambre de comptage de Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Inoculer des cultures pour l&#39;analyse du pH: <ol><li> Ajouter 150 ml de bouillon SH (pH 7), additionné de 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration à douze flacons de 500 ml avec des opercules. Inoculer flacons avec K. xylinus cultures starter à une concentration de 10 5 cellules / ml. En utilisant les trois cultures de départ, préparer trois répétitions biologiques par traitement. </li><li> cultures Supplément avec 300 pi des solutions de stock mM CESP 5, 50, ou 500 pour obtenir des concentrations finales de CESP de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Compléter les cultures témoins non traitées avec 300 ul de solvant utilisé pour dissoudre CEPA. </li><li> Sceller les fioles en collant étroitement les opercules des flacons et incuber les cultures pendant 14 jours à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute. </li></ol></li><li> Chaque jour, asépticaretirer lly échantillons de 5 ml de chacune des cellules du ballon et de granulés par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Transfert surnageants dans un tube propre et mesurer le pH de chaque répétition biologique en utilisant un pH-mètre. </li><li> Analyser les données temps-cours en traçant le pH moyen des répétitions biologiques. Remarque: il est important que le pH de la culture ne tombe pas au-dessous de 3,5; un pH de culture de 5 réduit de manière significative l&#39;éthylène libération de la LCPE, et un pH inférieur à 3,5 inhibe complètement l&#39;éthylène libération. </li><li> Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH 2 PO 4 en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement. </li></ol> 4. Colony Morphologie <ol><li> Cultivez K. Cultures xylinus Démarreur à Triplicate: <ol><li> Inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. incubales cultures TE à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu&#39;à une DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h). </li><li> Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Avec 5 ml de solution saline stérile, laver les cellules, puis remettre en suspension le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace. </li></ol></li><li> 24 préparer des plaques d&#39;agar contenant 25 ml de SH (pH 7) avec des moyennes de 1,5% (p / v) d&#39;agar. </li><li> Une fois que solidification de la gélose, étaler 50 pi de 5, 50, et 500 mM de CESP solutions mères sur l&#39;agar pour obtenir des concentrations finales de CESP de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Mettre en place des plaques témoins non traités et de solvants, qui consistent en aucune modification et d&#39;étalement de 50 ul du solvant utilisé pour dissoudre les composés d&#39;essai. </li><li> Plaques Streak pour des colonies isolées avec une boucle complète (~ 5 pi) de K. culture starter xylinus et les sceller avec un film de paraffine. Inoculer toutes les plaques en triple. Incuber les plaques pendant cinq jours à 30 ° C. </li><li> Photcolonies de ographie à un grossissement de 20x en utilisant un microscope numérique USB et d&#39;évaluer qualitativement coloniale morphologie et la production de cellulose sur un milieu solide. Remarque: La cellulose se présente comme une substance trouble le long du bord de la colonie. </li><li> Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH 2 PO 4 en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement. </li></ol> 5. Essais des pellicules <ol><li> Cultivez et Quantifier K. Cultures xylinus Démarreur à Triplicate: <ol><li> En trois exemplaires, inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. Incuber les cultures à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu&#39;à ce qu&#39;une DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h). </li><li> Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Avec 5 ml de solution saline stérile, laver tcellules il deux fois et remettre le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace. </li><li> Quantifier cellules à l&#39;aide d&#39;une chambre de comptage de Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Préparer Maître Mixes pour inoculer 24 puits Plaques: <ol><li> Supplément 60 ml de milieu SH (pH 7) avec 120 pi du 5, 50, et 500 actions mM de CESP pour obtenir des concentrations finales de la LCPE de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Compléter un autre 60 ml de milieu SH (pH 7) avec 120 ul de solvant utilisé pour dissoudre CEPA. Vortex pour mélanger. </li><li> Divisez par 60 ml de la LCPE milieu contenant en quatre 14 ml aliquotes. Inoculer trois des 14 ml aliquotes avec répétitions biologiques de culture de départ à une concentration de 10 5 cellules / ml. Garder les tubes avec des cellules sur la glace pour empêcher la production de cellulose. Remarque: Le restant 14 ml aliquote sera utilisé pour les puits témoins stériles. </li></ol></li><li> Inoculer Plaques 24 puits: <ol><li> Testez chaque traitement dans sa propre assiette avec trois rangées de répétitions et biologiquesune rangée de témoins stériles (Figure 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Figure 2:. Flow-diagramme illustrant le protocole utilisé pour le dosage de la pellicule et de l&#39; analyse Stock LCPE supplémenté milieu SH pH 7 (60 ml) est aliquoté pour trois inoculations réplicats biologiques distincts et un contrôle stérile (14 ml chacun). Ces cultures sont ensuite aliquotées en six répétitions techniques (2 ml) dans une plaque de 24 puits, puis scellés avec un film de paraffine. Après incubation pendant 7 jours à 30 ° C, pellicules sont récoltées et caractérisées par la détermination du poids humide, l&#39; épaisseur, le poids sec, et la cristallinité par FT-IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Utilisation du mélange maître de 14 ml, ajouter 2 ml dans each de six puits d&#39;une plaque de 24 puits stérile. Remplissez les trois répétitions biologiques et le contrôle stérile (Figure 2). Répétez l&#39;opération pour chaque traitement. </li><li> plaques d&#39;étanchéité avec un film de paraffine et incuber statiquement pendant 7 jours à 30 ° C. </li></ol><ol start="4"><li> Récolte et mesure Pellicle poids humide, épaisseur, poids sec (Cellulose Yield) et Cristallinité (figure 2): <ol><li> Enfoncer un côté de la pellicule pour élever le bord de la pellicule adverse et enlever les pellicules individuelles avec une pince. Tout en conservant l&#39;adhérence, placez-les sur du papier absorbant frais pour 3 sec pour éliminer le milieu excès avant la pesée pour déterminer leurs poids humides. </li><li> Alignez pellicules adjacentes à une règle et une photographie du côté à l&#39;aide d&#39;un appareil photo numérique haute résolution. </li><li> En utilisant le logiciel ImageJ 17, mesurer l&#39; épaisseur de la pellicule sur l&#39;épaule gauche, l&#39; épaule droite et au centre de chaque pellicule. En moyenne toutes les répétitions techniques pour chaque Replicat biologiquee. </li><li> transférer individuellement les pellicules dans les puits d&#39;une plaque à 6 puits. Traiter les pellicules avec 12 ml de NaOH 0,1 N à 80 ° C pendant 20 minutes pour lyser les cellules. </li><li> Retirez le NaOH et neutraliser les pellicules en lavant avec de l&#39;eau ultra-pure pendant 24 heures avec agitation. Changez l&#39;eau toutes les 6 heures. Remarque: Les pellicules doivent être blancs à l&#39;issue de l&#39;étape de lavage. </li><li> La place sur tapis pellicules de silicium et sèche à 50 ° C pendant 48 heures à poids constant. Une fois sec, retirer du tapis et de mesurer le poids des pelliculaires sur une échelle analytique pour déterminer le rendement de cellulose bactérienne. </li><li> Analyser pelliculaire cristallinité à l&#39; aide de transformée de Fourier par spectroscopie infrarouge (FT-IR) en utilisant 32 balayages et une résolution de 4 cm -1 dans la plage de 4000 à 650 cm -1. Calculer l&#39;indice de cristallinité, CI (IR), en utilisant A 1437 / A 895; le rapport d&#39;absorbance de la bande &quot;cristallin&quot; et &quot;amorphe bande&quot; 18 comme décrit précédemment. </li></ol&gt; </li><li> Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH 2 PO 4 en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement. </li><li> Analyser Pellicle données: <ol><li> Calculer pelliculaire hydratation en déterminant la différence entre le poids humide de la pellicule et le poids sec. </li><li> La moyenne des valeurs de toutes les répétitions techniques pour obtenir une valeur unique pour chaque répétition biologique pour l&#39;analyse statistique. Comparez les traitements à l&#39;aide d&#39;une ANOVA à une voie avec un test de comparaison multiple de Tukey. Les différences sont significatives si p &lt;0,05. </li><li> Normaliser les données que le pour cent des témoins non traités et tracer les moyens de réplicats biologiques. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes décrites ici décrivent la production in situ de l&#39; éthylène à partir CEPA pour l&#39;étude de la réponse à l&#39;éthylène bactérien en utilisant l&#39;organisme modèle, K. xylinus. Cette méthode est très utile que l&#39; éthylène peut être produit en complétant tout milieu aqueux qui présente un pH supérieur à 3,5 à 10,11 CEPA niant la nécessité d&#39;éthylène gazeux pur ou de l&#39; équipement de laboratoire spécialisé. Ce procédé ne se limite pas à l&#39;étude des effets d...

L&#39;éthylène oléfine (C 2 H 4) a d&#39; abord été découvert comme une hormone végétale en 1901 quand il a été observé que les semis de pois, cultivés dans un laboratoire qui utilise des lampes à gaz de charbon, présentaient une morphologie anormale dans laquelle les tiges (hypocotyles) étaient plus courtes, plus épais et courbé latéralement par rapport aux semis de pois normaux; un phénotype appelé plus tard , le 1,2 triple réponse. Des études ultérieures ont démontré que l&#39; éthylène est une phytohormone vitale qui régule de nombreux processus de développement tels que la croissance, la réponse au stress, la maturation des fruits et de la sénescence 3. Arabidopsis thaliana, un organisme modèle pour la recherche en biologie végétale, a été bien étudiée en ce qui concerne sa réponse à l&#39; éthylène. Mutants de réponse Plusieurs d&#39;éthylène ont été isolés en exploitant le phénotype triple réponse observée dans l&#39; obscurité-adulte A. semis thaliana en présence d&#39;éthylène 1,4,5. Le précurseur biosynthétique pour la production d&#39;éthylène dans les plantes est 1-aacide minocyclopropane carboxylique (ACC) 6 et est couramment utilisé pour le dosage de la triple réponse pour augmenter la production endogène d&#39;éthylène qui conduit à la triple réponse 1,4,5 phénotype. Bien que la réponse à l&#39;éthylène est largement étudié dans les plantes, l&#39;effet de l&#39;éthylène exogène sur les bactéries est largement sous-étudiée en dépit de l&#39;étroite association de bactéries avec des plantes. Une étude a rapporté que certaines souches de Pseudomonas peuvent survivre à l&#39; aide d&#39; éthylène en tant que source unique de carbone et d&#39; énergie 7. Cependant, seules deux études ont démontré que les bactéries réagissent à l&#39;éthylène. La première étude a montré que les souches de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida et P. syringae étaient chimiotactique envers l&#39; éthylène en utilisant un essai de bouchon d&#39; agarose dans lequel l&#39; agarose fondu a été mélangé avec un tampon de chimiotaxie éthylène pur équilibrée avec du gaz 8. Cependant, à notre connaissance, il n&#39;y a pas eu de further rapports en utilisant de l&#39;éthylène gazeux pur pour caractériser la réponse d&#39;éthylène bactérienne, probablement en raison de la difficulté de manipulation des gaz dans le laboratoire sans matériel spécialisé. Le deuxième rapport de la réponse à l&#39;éthylène bactérienne a démontré que l&#39; éthylène a augmenté la production de cellulose bactérienne et l&#39; expression des gènes influencés dans la bactérie de fruits associée, Komagataeibacter (anciennement Gluconacetobacter) xylinus 9. Dans ce cas, le composé libérant de l&#39; éthylène, l&#39; acide 2-chloréthylphosphonique (CEPA) a été utilisé pour produire de l&#39; éthylène in situ dans le milieu de croissance bactérienne, en évitant la nécessité d&#39;éthylène gazeux pur ou d&#39;un équipement spécialisé. LCPE produit de l&#39; éthylène à un rapport 1: 1 molaire pH supérieur à 3,5 10,11 à travers, une réaction de premier ordre catalysée par une base 12-14. La dégradation de la LCPE est positivement corrélée avec le pH et la température 13,14 et les résultats dans la production d&#39;éthylène, le chlorure et le phosphate. CEPA offre aux chercheurs intéressés à étudier les réponses bactériennes à l&#39;éthylène avec une alternative pratique à l&#39;éthylène gazeux. L&#39;objectif global des protocoles suivants est de fournir une méthode simple et efficace pour étudier la réponse d&#39;éthylène bactérienne et comprend la validation des niveaux physiologiquement pertinents de la production d&#39;éthylène de la LCPE décomposition dans un milieu de croissance bactérienne, l&#39;analyse de la culture pH pour assurer la LCPE décomposition ne soit pas compromise pendant la croissance bactérienne, et l&#39;évaluation de l&#39;effet de l&#39;éthylène sur la morphologie et le phénotype bactérien. Nous démontrons ces protocoles utilisant K. xylinus Toutefois, ces protocoles peut être adapté pour étudier la réponse de l&#39; éthylène dans d&#39; autres bactéries en utilisant le milieu de croissance approprié et analyse le phénotype.

<table><tbody><tr><td>Acide 1-aminocyclopropane carboxylique (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Précurseur biosynthétique de l’éthylène dans les plantes</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri à 4 secteurs</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>Pour tester la triple réponse</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>Pour solidifier l’appareil</td></tr><tr><td>photo reflex Canon Rebel T1i</td><td>moyen Canon</td><td>3818B004</td><td>Pour les photos des pellicules</td></tr><tr><td>Cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Solution aqueuse</td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>Pour SH medium</td></tr><tr><td>Eau de Javel commerciale</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Eau de Javel pour la stérilisation des semences</td></tr><tr><td>HCl</td><td>concentré BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Acide chlorhydrique pour l’ajustement du pH</td></tr><tr><td>Microscope numérique USB</td><td>Enfichable</td><td>N/A</td><td>Pour les photos de colonies</td></tr><tr><td>Éthéphon (&ge ; 96%; Acide 2-chloroéthylphosphonique)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Composé libérant de l’éthylène</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Pour milieu SH</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Alphaprotéobactérie productrice de cellulose bactérienne</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>Tube de microcentrifugation de 1,7 ml</td></tr><tr><td>Murashige et Skoog (MS) basal moyen&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana milieu de croissance</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot ; 7H2O&nbsp ;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Phosphate de sodium, heptahydrate dibasique pour milieu SH</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Chlorure de sodium pour solution saline et de contrôle</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot ; H2O&nbsp ;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Phosphate de sodium, monobasique monohydraté pour solution de contrôle</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Hydroxyde de sodium pour l’ajustement du pH</td></tr><tr><td>Film de paraffine</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>Pour sceller les plaques et les flacons</td></tr><tr><td>Peptone (bactériologique)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>Pour SH medium</td></tr><tr><td>Chambre de comptage Petroff-Hausser</td><td> scientifique</td><td>3900</td><td>Chambre de comptage de cellules bactériennes</td></tr><tr><td>Filtre de stérilisation en polyéthersulfone 0.2 & micro ; m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Pour la stérilisation de la cellulase</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Saccharose pour milieu MS</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Pour milieu SH</td></tr></tbody></table>

en utilisant le composé d&#39;éthylène de libération, l&#39;acide 2-chloroéthylphosphonique, comme un outil pour étudier la réponse de l&#39;éthylène chez les bactéries

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

L’éthylène (C2H4) est une phytohormone gazeuse impliquée dans de nombreux aspects du développement des plantes, jouant un rôle dominant dans la sénescence et la maturation des fruits. L’éthylène exogène appliqué au début du développement de la plante déclenche le phénotype à triple réponse ; un hypocotyle plus court et plus épais avec un crochet apical exagéré. Malgré la relation intime entre les plantes et les bactéries, l’effet de l’éthylène exogène sur les bactéries a été largement négligé. Cela est dû en partie à la difficulté de contrôler l’éthylène gazeux au sein du laboratoire sans équipement spécialisé. L’acide 2-chloroéthylphosphonique (CEPA) est un composé qui se décompose en éthylène, en chlore et en phosphate selon un rapport molaire de 1:1:1:1 lorsqu’il est dissous dans un milieu aqueux de pH 3,5 ou plus. Nous décrivons ici l’utilisation de CEPA pour produire de l’éthylène in situ afin d’étudier la réponse de l’éthylène chez les bactéries en utilisant la bactérie productrice de cellulose Komagataeibacter xylinus comme organisme modèle. Les protocoles décrits dans le présent document comprennent à la fois la vérification de la production d’éthylène de CEPA au moyen de l’essai à triple réponse d’Arabidopsis thaliana et les effets de l’éthylène exogène sur la production de cellulose de K. xylinus, les propriétés pelliculaires et la morphologie coloniale. Ces protocoles peuvent être adaptés pour examiner l’effet de l’éthylène sur d’autres microbes à l’aide de milieux de croissance et d’analyses phénotypiques appropriés. L’utilisation de CEPA offre aux chercheurs une solution de rechange simple et efficace à l’éthylène gazeux pur pour la détermination régulière de la réponse bactérienne à l’éthylène.

Une configuration de plaque schématique pour la vérification de l&#39; éthylène libération de la LCPE dans un milieu SH (pH 7) par le test de triple réponse est représentée sur la figure 1A - C. Un organigramme illustrant le protocole pelliculaire est représenté dans la figure 2. Dark-adulte A. thaliana plants présentent le phénotype de réponse triple (hypocotyle court et plus épais avec un crochet apicale exagéré) en présence d...

Les protocoles décrits dans le présent document facilitent l’étude pratique des réponses bactériennes de l’éthylène en utilisant l’acide 2-chloroéthylphosphonique (CEPA). L’éthylène est produit in situ par la décomposition de CEPA dans un milieu de croissance bactérienne aqueux, ce qui permet de contourner l’exigence d’éthylène gazeux pur.

En utilisant le composé d&#39;éthylène de libération, l&#39;acide 2-chloroéthylphosphonique, comme un outil pour étudier la réponse de l&#39;éthylène chez les bactéries

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode simple et sûre pour l'étude de la réponse bactérienne à l'éthylène. Cette méthode permettra de répondre à des questions clés concernant les interactions plante-microbe, telles que le rôle joué par l'éthylène dans l'adhésion bactérienne et la colonisation des plantes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite aucun équipement spécialisé et qu'elle est beaucoup plus sûre que la manipulation de l'éthylène gazeux en laboratoire.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la manière dont la production de cellulose bactérienne est affectée par l'éthylène, elle peut également être appliquée à d'autres micro-organismes associés aux plantes pour l'étude in vitro du rôle des processus médiés par l'éthylène dans la colonisation des plantes. En préparation, préparez 100 millilitres de milieu de croissance pour les plantules d'Arabidopsis et 100 millilitres de milieu de croissance bactérien pour la décomposition du CEPA. Une fois que le milieu pour Arabidopsis a refroidi, répartissez 40 millilitres dans un flacon stérile et complétez l'aliquote avec 40 microlitres d'ACC à 10 millimolaire.Chargez maintenant les quadrants de la boîte avec cinq millilitres de milieu et laissez la gélose durcir. Des quadrants opposés de toutes les boîtes contiennent un milieu de croissance bactérienne et un milieu pour arabidopsis. Utilisez trois configurations différentes de milieux.Le traitement CEPA aura lieu ultérieurement dans le protocole. Préparez chaque configuration de plaque en triple exemplaire. Une fois que l'agar a refroidi, répartissez uniformément environ 50 graines sur chaque quadrant du milieu arabidopsis.Ensuite, incuber les boîtes au noir à quatre degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Par la suite, après l'incubation des graines, les exposer à une lumière fluorescente pendant deux heures. Puis, déposer 10 microlitres de la solution mère de CEPA à 500 millimolaire sur l'agar bactérien d'une configuration de boîte.La concentration finale de CEPA dans l'agar sera de un millimolaire. Scellez maintenant toutes les plaques avec du film de laboratoire et enveloppez-les dans du papier d'aluminium. Ensuite, placez les plaques dans un environnement sombre à 23 degrés Celsius, côté agar vers le bas, et laissez-les incuber pendant trois jours afin de faire germer les graines.Une fois les graines germées, utilisez une pince stérilisée à la flamme pour prélever les plantules correspondant à chaque traitement. Sélectionnez 30 plantules dans chaque quadrant, soit un total de 180 par traitement. Prenez des images des plantules au microscope stéréoscopique ou à l’aide d’un appareil photo numérique haute résolution, sur fond noir et avec une règle comme référence d’échelle.Ensuite, mesurez la longueur de l'hypocote à l'aide du logiciel ImageJ. À l'aide de l'outil droit, mesurez 10 millimètres et sélectionnez « Définir l'échelle » dans l'onglet Analyser pour régler l'échelle. Puis, utilisez l'outil segmenté situé sous l'outil de ligne droite pour mesurer chaque hypocote et appuyez sur M pour calculer leurs longueurs.Le test de la pellicule est un outil d'analyse standard pour la production de cellulose bactérienne. L'analyse du pH et de la morphologie est décrite en détail dans le protocole sex. En préparation, récoltez les cellules à partir de cultures initiatrices en triple exemplaire et quantifiez les cellules à l'aide d'une chambre de comptage Petroff-Hauser.Ensuite, préparez quatre mélanges maîtres de milieu contenant différentes concentrations de CEPA. Pour chaque mélange maître, aliquotez 60 millilitres de milieu SH à pH 7 et ajoutez 120 microlitres de solution mère de CEPA à 0, 5, 50 ou 500 millimolaire afin d'obtenir des concentrations finales de CEPA respectivement de 0, 0,1, 0,1 ou 1,0 millimolaire. Mélangez ces milieux en agitant doucement les flacons.Un ensemble de milieux est nécessaire pour chacun des prélèvements en triplicat et un quatrième ensemble est requis pour servir de témoin stérile. Ainsi, divisez chaque préparation de milieu de 60 millilitres en quatre aliquotes de 14 millilitres. Ensuite, pré-refroidissez les aliquotes de 14 millilitres avant de les inoculer avec leurs cultures initiatrices respectives afin d'obtenir une concentration finale de 100 000 cellules par millilitre.Gardez tous les tubes inoculés sur de la glace pour éviter la production de cellulose. Utilisez les 14 millilitres restants des éliquats pour les puits témoins stériles. Ensuite, à partir de chaque mélange maître de 14 millilitres, chargez des éliquats de deux millilitres dans six puits d'une plaque stérile de 24 puits, pour un total de quatre plaques chargées par culture initiale analysée.Fermer soigneusement les plaques avec un film de paraffine et les incuber statiquement pendant sept jours à 30 degrés Celsius. Pendant l'incubation, incuber en parallèle une culture liquide de 25 millilitres afin de mesurer périodiquement l'acidité du milieu. Si l'acidité tombe en dessous d'un pH de cinq, la croissance de l'organisme inhibera la décomposition du CEPA en éthylène et sera donc incompatible avec ce test.Une semaine plus tard, récoltez et mesurez le poids humide, l'épaisseur, le poids sec et la cristallinité du pellicule. Pour prélever un pellicule depuis la plaque, appuyez sur un côté du pellicule afin de soulever le bord opposé, puis saisissez-le avec une pince. En conservant la prise, déposez-le sur une serviette en papier propre pendant trois secondes pour éliminer l'excès de milieu.Ensuite, peser chaque pellicule et noter cette valeur comme le poids humide. Puis, aligner les pellicules le long d'une règle et les photographier sur le côté à l'aide d'un appareil photo numérique haute résolution. Analyser ces photos pour déterminer l'épaisseur des pellicules.Ensuite, transférez individuellement les pellicules dans les puits d'une plaque à six puits. Incubez-les avec 12 millilitres de soude 0,1 normal à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes afin de lyser les cellules. Puis, retirez la soude et neutralisez les pellicules traitées en les lavant soigneusement avec 12 millilitres d'eau ultra-pure pendant 24 heures sous agitation dans une plaque à six puits.Pendant cette incubation, changer l'eau toutes les six heures. À la fin de l'incubation, les pellicules doivent être blanches. Ensuite, placer les pellicules sur des tapis en silicone et les sécher à 50 degrés Celsius pendant 48 heures afin de les préparer pour la mesure de leur masse sèche.La cristallinité des pellicules peut être analysée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. Des jeunes plants d'Arabidopsis thaliana cultivés à l'obscurité ont présenté le phénotype de réponse triple, caractérisé par un hypocote court et épais portant un crochet apical exagéré, en présence d'ACC et en présence d'éthylène produit par la décomposition du CEPA sur milieu SH, mais pas dans des conditions non traitées. Il est clair que la longueur de l'hypocote des graines traitées était significativement inférieure à celle des témoins non traités.Ainsi, l'éthylène a été libéré à partir du CEPA dans le milieu SH à une concentration physiologiquement pertinente. Toutes les concentrations d'éthylène dérivées du CEPA ont significativement diminué le poids humide du pellicule, mais n'ont pas affecté l'épaisseur du pellicule, et toutes les concentrations d'éthylène dérivées du CEPA ont significativement augmenté le poids sec du pellicule. En outre, l'hydratation du pellicule a été réduite par toutes les concentrations d'éthylène dérivées du CEPA.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de mesurer le pH du milieu de croissance afin de s'assurer que le pH ne descende pas en dessous de cinq, pour que la dégradation du CEPA en éthylène ne soit pas inhibée. N'oubliez pas que le CEPA sous forme de poudre est extrêmement dangereux pour les membranes muqueuses. Des précautions appropriées doivent toujours être prises lors de l'exécution de ce protocole.Cette technique permettra aux chercheurs intéressés par les interactions entre bactéries et plantes d'explorer en toute sécurité les réponses médiées par l'éthylène in vitro. Cela contribuera à mieux comprendre comment les signaux végétaux régulent la colonisation et l'adhésion bactériennes. À l'heure actuelle, ce domaine de recherche a été peu étudié.

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