Name: Caractérisation des complexes multi-unité de protéine MxA humaine utilisant dénaturant non-Gel-électrophorèse polyacrylamide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'électrophorèse non dénaturante pour analyser l'état oligomérique de la protéine MxA dans des lysats cellulaires humains sans purification préalable.

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Ce travail a été financé par une subvention du Fonds national suisse de la recherche scientifique (Bourse n° 31003A_143834) à JP.

NOTE: Ce protocole est basé sur la non-dénaturant PAGE protocole précédemment publié 12. Dans cette étude, l&#39;état oligomérique de la protéine MxA a été évaluée en utilisant soit des cellules Vero ou des cellules surexprimant MXA A549 IFN-a stimulée endogène exprimant MXA. Le protocole décrit ci-dessous peut être utilisé pour analyser l&#39;état d&#39;une quelconque protéine oligomérique en plus MXA. Cependant, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire. 1. Préparation de lysat cellulaire pour les non-dénaturant PAGE NOTE: Pour analyser l&#39;état oligomérique de la protéine MxA humaine dans des cellules Vero ou A549, 1,0 x 10 6 cellules ont été récoltées. En fonction du type cellulaire ou l&#39;abondance de la protéine à analyser, le nombre de cellules doit être ajustée. Il est également important de protéger le tampon de lyse de l&#39;exposition à la lumière, dès que l&#39;iodoacétamide sensible à la lumière est ajouté. <ol><li> Graine de 0,3 x 10 6 A549 ou Vero cellules par puits dans6 bien-plats. Gardez les cellules dans 2 ml de milieu de croissance par puits (voir le tableau 1). Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Récolter les cellules par lavage avec 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) et séparer par addition de 0,5 ml de 0,25% de trypsine-acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), 1x solution pendant environ 5 min à température ambiante. </li><li> Dès que les cellules se détachent de la boîte, ajouter du milieu 0,5 ml de croissance et mélanger délicatement par pipetage de haut en bas. </li><li> Transférer les cellules de chaque puits dans un tube de 2 ml et le culot de les utiliser une centrifugeuse de dessus de table (5000 xg, 4 ° C, 5 min). </li><li> Retirez délicatement le surnageant par pipetage sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1 ml glacé par pipetage soigneusement la suspension cellulaire vers le haut et vers le bas. </li><li> cellules à granules dans une centrifugeuse de table (5000 xg, 4 ° C, 5 min). </li><li> Retirez délicatement le surnageant par pipetage wiThoout détacher le culot cellulaire. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 pi de tampon de lyse glacé (voir le tableau 1) par pipetage de haut en bas et de mettre sur la glace. </li><li> Immédiatement, protéger lysat de la lumière, en recouvrant les tubes en utilisant une feuille d&#39;étain et incuber pendant 30 minutes sur la glace. REMARQUE: Après incubation pendant 30 minutes sur de la glace, il est plus indispensable de protéger le lysat provenant de l&#39;exposition lumineuse, étant donné que la protection des groupes thiol libres est irréversible. </li><li> Retirer les débris cellulaires par centrifugation dans une centrifugeuse de paillasse pré-refroidie (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). </li><li> Equilibrer les colonnes de dialyse dans un tampon de dialyse (tableau 1) dans la chambre froide à 4 ° C pendant 20 minutes au cours de l&#39;étape de centrifugation. Utilisez une colonne avec un poids moléculaire de coupure de 10.000. <ol><li> Fixez les colonnes à une bouée flottante et les mettre dans un bécher rempli avec un tampon de dialyse. Pour assurer une agitation douce, utiliser un agitateur magnétique. Ne touchez pas la membrane. NOTE: Dialyssont des colonnes peuvent être achetés ou préparés à partir de tubes de 1,5 ml selon le protocole décrit par 19 Fiala et coll. </li></ol></li><li> Supprimer les colonnes de la mémoire tampon de dialyse et la bouée flottante. Transférer les lysats clarifiés dans la colonne de dialyse préparé par pipetage sans toucher la membrane. Fixez les colonnes à une bouée flottante et les remettre dans le bécher rempli avec un tampon de dialyse. </li><li> Dialyser le lysat dans un bécher contenant un tampon de dialyse glacée (tableau 1) pendant au moins 4 heures (ou de préférence la nuit) à 4 ° C , tout en agitant soigneusement à l&#39; aide d&#39; un agitateur magnétique. Utiliser un tampon d&#39;au moins 100 ml de dialyse pour un lysat de 200 ul. </li><li> Transférer l&#39;échantillon dialysé dans un tube de 1,5 ml. Retirer précipités par centrifugation dans une centrifugeuse de dessus de table (13 000 xg, 4 ° C, 20 min). Pour empêcher la dissociation de la protéine oligomérique complexes continuent avec le protocole (section 2) immédiatement après la dialyse. Ne pas congelerles lysats préparés. </li></ol> 2. Electrophorèse REMARQUE: L&#39; électrophorèse a été réalisée comme décrit précédemment avec des modifications 22. Dans le protocole décrit ci-dessous, des gels de gradient préfabriqués ont été utilisés (4-15% gradient). En variante, les gels peuvent être préparés au laboratoire. Il est très important d&#39;exclure tout agent dénaturant tel que le SDS pour empêcher la dissociation des complexes de protéines oligomériques. Le temps de l&#39;électrophorèse a été optimisé pour les différents états oligomériques de la protéine MxA humaine. Cependant, elle peut varier pour d&#39;autres protéines, en fonction de la taille du complexe oligomérique, ainsi que l&#39;intervalle de séparation qui est censée être réalisée pour analyser le complexe. Par conséquent, la durée optimale de l&#39;électrophorèse doit être déterminée de manière empirique. Pour une résolution optimale des oligomères à analyser le courant ne doit pas dépasser 25 mA. <ol><li> Assembler le gel PAGE non dénaturante dans la chambre de gel. Remplissez til chambre intérieure et extérieure avec un tampon de course pré-refroidie (tableau 1). </li><li> Pré-exécuter le gel avec un tampon de course prérefroidi à 25 mA par gel pendant 15 min dans la chambre froide à 4 ° C. </li><li> Mélanger 15 ul de lysats préparés ci - dessus avec 5 pi de tampon d&#39;échantillon 4X (tableau 1). Ne pas faire bouillir l&#39;échantillon. </li><li> Chargez 15 ul d&#39;échantillon et un étalon de protéine native de choix sur le gel. Exécutez le gel à 25 mA pendant 4 heures dans la chambre froide à 4 ° C. Remarque: Pour des analyses semi-quantitatives, un protocole de quantification des protéines (par exemple un Bradford Protein Assay 23) peut être réalisée afin d&#39;assurer le chargement des quantités égales de protéine totale par voie. </li></ol> 3. Western Blot NOTE: Décrite ci-dessous est le protocole d&#39;un système de western blot humide. Toute membrane buvard peut être utilisé. Activer le fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans les membranes 100% de methanol avant d&#39;équilibration dans buf buvardfer. La technique de western blot semi-sec peut être utilisé alternativement, mais doit être optimisé pour les grands complexes oligomériques. <ol><li> Démonter le gel et le transfert avec précaution dans du tampon SDS (tableau 1). </li><li> Incuber pendant 10 min à température ambiante en agitant doucement. </li><li> Préparer 2 éponges, 4 feuilles de papier filtre de cellulose et une membrane de transfert par gel. Faites - les tremper dans buvard tampon (tableau 1). </li><li> Assembler le sandwich comme suit (de bas en haut): 1 éponge, 2 cellulose feuilles de papier filtre, membrane, gel, 2 cellulose feuilles de papier filtre, 1 éponge. </li><li> Mettez le sandwich dans le réservoir buvard. Assurez-vous que la membrane fait face au pôle positif tandis que le gel fait face au pôle négatif. </li><li> Remplir le réservoir buvard avec un tampon buvard pré-réfrigérés. </li><li> Éponger à 90 mA pendant une nuit à 4 ° C pour obtenir les meilleurs résultats de transfert de protéines. </li><li> Démonter le sandwich et de visualiser la norme de protéine par incubation de la membrane dans PoncLa solution eau de 5 min à température ambiante. </li><li> Destain la membrane par précaution lavage du Ponceau S avec de l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à ce que vous pouvez voir clairement les bandes de la norme de la protéine. </li><li> Marquer les bandes de la protéine de référence à l&#39;aide d&#39;un stylo. NOTE: résiduelle Ponceau S peut interférer avec l&#39;immunocoloration. Pour éviter cela, la membrane peut être décoloré en outre par une incubation dans du NaOH 0,1 M pendant 1 min, puis lavage avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Bloquer la membrane avec un tampon de blocage (voir le tableau 1) pendant au moins 1 h à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Visualiser la protéine (s) d&#39;intérêt par immunocoloration en utilisant des anticorps dirigés contre la protéine à analyser. REMARQUE: La protéine MxA humaine a été visualisée en utilisant l&#39;anticorps polyclonal de lapin spécifique pour Mx1 humain dilué à 1: 1000 dans un tampon bloquant (tableau 1). La solution d&#39;anticorps a été mis à incuber pendant une nuit à 4 ° C. En variante, l&#39;anticorps monoclonal anti-MXA anticorps (clone 143) peut être utilisé (données non présentées) 24. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous décrivons une méthode simple qui permet la détermination rapide de l&#39;état oligomérique des protéines exprimées dans des cellules de mammifères par PAGE non dénaturante suivie d&#39;une analyse par transfert de Western. L&#39;avantage majeur de cette approche est que l&#39;état oligomérique d&#39;une protéine donnée peut être déterminée à partir de lysats de cellules entières sans purification protéique préalable. Cela peut être important pour des protéines qui oligomériser ou exercent leur fonction en asso...

La structure quaternaire d&#39;une protéine joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires. Les voies de signalisation, l&#39; expression des gènes, et l&#39; enzyme activation / désactivation tous comptent sur le bon assemblage des complexes protéiques 1-4. Ce procédé également connu sous le nom d&#39;homo- ou d&#39;hétéro-oligomérisation est due à la liaison covalente irréversible ou des interactions protéine-protéine électrostatique et hydrophobe réversibles. Oligomérisation non seulement de diversifier les différents processus cellulaires sans augmenter la taille du génome, mais fournit également une stratégie de protéines pour construire des complexes stables qui sont plus résistantes envers une dénaturation et une dégradation 5. Défauts dans oligomérisation ont un impact sur la fonction des protéines et peuvent conduire au développement de maladies. Par exemple, l&#39;enzyme phénylalanine hydroxylase forme un complexe tétramérique. Des mutations dans le complexe protéique peuvent affaiblir la formation du tétramère et conduire à la phénylcétonurie , la maladie 6. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La protéine MxA humain est un interféron (IFN) induite par la protéine antivirale effecteur exerçant une large activité antivirale contre divers ARN, ainsi que des virus à ADN à 7. Il appartient à la superfamille des grandes GTPases dynamine-like et a la capacité de former de grandes structures oligomériques in vitro 8. L&#39; oligomérisation a été proposé de protéger contre une dégradation rapide MXA 9,10. En dépit des efforts intenses par de nombreux groupes de recherche, le mécanisme moléculaire d&#39;action reste largement insaisissable et le rôle de l&#39;état d&#39;oligomérisation de MXA pour sa fonction antivirale est en débat 9,11,12. À cet égard, Gao et ses collègues ont proposé un modèle où MxA exerce son activité antivirale en interagissant avec des nucléoprotéines virales sous forme de grandes structures oligomériques 11 annulaires. Cependant, plus récemment, nous avons démontré que les dimères MxA présentent une activité antivirale et d&#39; interagir avec la nucléoprotéine du virus grippal A 12. Belon sur la structure cristalline de la MXA, Gao et ses collaborateurs ont identifié plusieurs résidus d&#39;acides aminés dans les régions d&#39;interface qui sont essentielles pour son oligomérisation in vitro et sa fonction antiviral 11,13. Par conséquent, afin d&#39;élucider ce qui oligomérique état de MXA exerce une activité antivirale, nous avons cherché à établir un protocole simple de déterminer rapidement l&#39;état oligmeric de mutants d&#39;interface MxA exprimées dans les cellules humaines, ainsi que endogènes MxA exprimé après IFNa stimulation. Bien qu&#39;il existe de nombreuses techniques qui sont couramment utilisés pour étudier l&#39;interaction entre les protéines telles que la protéine split-Green Fluorescent (split-GFP) complémentation test 14, la résonance plasmonique de surface 15 et Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) 16, ils ne fournissent pas l&#39;information de la stoechiométrie exacte d&#39;un complexe protéique oligomère. Pour enquêter sur cet aspect particulier, des techniques telles quela diffusion multi-angle de la lumière (MALS) 17 et ultracentrifugation analytique 18 sont très utiles. Habituellement, les protéines analysées en utilisant ces procédés sont des protéines purifiées. procédés d&#39;oligomérisation peuvent également dépendre d&#39;autres facteurs cellulaires. Si ces facteurs sont inconnus, l&#39;analyse est plus difficile. En outre, certaines protéines sont difficiles à exprimer dans E. coli et à purifier. Par conséquent, ces méthodes ne sont pas le choix optimal pour analyser la protéine oligomérisation dans l&#39;environnement cellulaire. En outre, ces techniques nécessitent des instruments coûteux qui ne sont pas facilement disponibles. Non-électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE), la chromatographie d&#39;exclusion stérique ou la reticulation chimique suivie par le dodécylsulfate de sodium classique (SDS) -PAGE sont des outils utiles pour la caractérisation de la formation d&#39;oligomères à partir de lysats de cellules 2,19,20. Ces méthodes ne nécessitent pas d&#39;équipement spécialisé et peuvent être facilement performed dans un laboratoire standard. Nous avons d&#39;abord évalué différents protocoles de reticulation chimiques qui invariante conduit à l&#39;agrégation et la précipitation des MXA non spécifique. Par conséquent, nous avons ensuite testé les protocoles PAGE non dénaturants. Comme non-dénaturant PAGE exclut l&#39;utilisation de SDS, la migration des protéines dépend de leur charge native. PAGE Blue-native utilise Coomassie G250 bleu brillant pour charger des protéines avec une charge globale négative, similaire à SDS, mais ne dénature pas la protéine 21. Malheureusement, le bleu brillant de Coomassie précipite en présence de sels élevées et des cations divalents (par exemple Mg 2+) qui sont souvent inclus dans les tampons de lyse. Selon les tampons utilisés, il peut être difficile d&#39;analyser l&#39;échantillon sans autre optimisation des mesures qui pourraient avoir un effet sur le complexe protéique oligomérique. Nous présentons ici un protocole simple basé sur une méthode publiée précédemment 22 pour déterminer oligomérisationprotéine humaine MxA provenant de lysats cellulaires en utilisant non-dénaturant PAGE.

<table><tbody><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Unités de dialyse, 10K MWCO, 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Pré-équilibrage dans le tampon de dialyse (si l’élimination du glycérol est souhaitée) Peut être fabriqué par vous-même selon Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash ; 15 % Mini-PROTEAN TGX Gels protéiques préfabriqués, 10 puits,</td> <td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>Pré-exécuté dans le tampon de fonctionnement pour ajuster le système de tampon</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sans EDTA</td><td>Roche&nbsp ;</td><td>11836170001</td><td>utiliser 1 comprimé par flacon de 50 ml</td></tr><tr><td>de PBS, pH 7,4 et 500 ml de solution Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>TOXIC portez des gants et protégez les yeux</td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard&nbsp ; 50 &nbsp ; l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>charge 5 & micro ; l/well</td></tr><tr><td>A549 cellules</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>Croissance dans un milieu de croissance (voir Tableau 1)</td></tr><tr><td>Cellules</td><td>Vero ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>Croissance dans un milieu de croissance (voir Tableau 1)</td></tr><tr><td>anti-Mx1</td><td>Anticorps Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>Utilisation à une dilution de 1:1 000</td></tr><tr><td>ECL Anticorps entiers anti-IgG de lapin, de raifort lié à la peroxydase (à partir de âne)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Utilisation à une dilution de 1:10 000</td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA (1x)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide &nbsp ; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>stock&nbsp ; 100 mM</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen&nbsp ; Streptocoque 100 x&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 100ml&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x Stock, 100 ml&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin, dialysé , US Origine 500 ml Gibco Lot :42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre en cellulose</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF blot&nbsp ; membrane</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>fluorure de sodium (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sans EDTA</td><td>Roche&nbsp ;</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 10 % solution</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>orthovanadate de sodium (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946 ;-Glycérophospate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Lait en poudre</td><td>Migros/Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dodécyle de sodium (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation des complexes multi-unité de protéine mxa humaine utilisant dénaturant non-gel-électrophorèse polyacrylamide

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

La formation de complexes oligomères est une condition préalable cruciale à la structure et au bon fonctionnement de nombreuses protéines. La protéine effectrice antivirale MxA, induite par l’interféron, exerce une large activité antivirale contre de nombreux virus. MxA est une GTPase de type dynamine et a la capacité de former des structures oligomères d’ordre supérieur. Cependant, la question de savoir si l’oligomérisation de MxA est nécessaire pour son activité antivirale fait l’objet d’un débat. Nous décrivons ici un protocole simple pour évaluer l’état oligomérique de MxA exprimé de manière endogène ou ectopique dans la fraction cytoplasmique de lignées cellulaires humaines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant (PAGE) en combinaison avec l’analyse par Western blot. Une étape critique du protocole est le choix des détergents pour éviter l’agrégation et/ou la précipitation de protéines particulièrement associées aux membranes cellulaires telles que MxA, sans interférer avec son activité enzymatique. Un autre aspect crucial du protocole est la protection irréversible des groupes thiols libres des résidus de cystéine par l’iodoacétamide pour empêcher les interactions artificielles de la protéine. Ce protocole est adapté à une évaluation simple de l’état oligomérique de MxA et permet en outre une corrélation directe de l’activité antivirale des mutants d’interface MxA avec leurs états oligomères respectifs.

Utilisation non-dénaturant PAGE, nous avons analysé l&#39;état oligomérique de type sauvage humaine MXA, les dimères mutants d&#39;interface MXA (R640A) et MXA (L617D), ainsi que le mutant d&#39;interface monomère MXA (M527D) à partir de lysats cellulaires 12. Les cellules ont été lysées dans un tampon contenant 1% d&#39; octylphénoxypolyéthoxyéthanol (NP-40) et iodoacétamide pour assurer la solubilisation et la protection des groupes thiol libres protéine (voir figure 1). Comme décrit précéd...

Cet article décrit un protocole simple et rapide pour évaluer l’état oligomérique de la protéine GTPase MxA de type dynamine à partir de lysats de cellules humaines en utilisant une combinaison de PAGE non dénaturante et d’analyse par western blot.

Caractérisation des complexes multi-unité de protéine MxA humaine utilisant dénaturant non-Gel-électrophorèse polyacrylamide

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

L'objectif général de cette expérience est de déterminer le nombre de sous-unités dans des complexes protéiques homooligomériques présents dans des lysats cellulaires à l'aide d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium non dénaturant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que le statut oligomérique des protéines impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux. Le principal avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite ni la purification des complexes protéiques homooligomériques ni l'utilisation d'équipements spécialisés coûteux.Par conséquent, il peut être réalisé dans la plupart des laboratoires. Cette expérience utilise deux types de cellules : des cellules A549 qui expriment la protéine de résistance aux myxovirus A, ou MxA, de façon endogène ; et des virocellules qui surexpriment MxA.Ensemencer les cellules A549 et les virocellules dans des boîtes de six puits avec deux millilitres de milieu de croissance par puits. Incuber les cellules pendant la nuit dans une incubateur de culture cellulaire. Le jour suivant, récolter les cellules.Lavez chaque puits avec un millilitre de PBS et détachez les cellules en ajoutant 0,5 millilitre de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant environ cinq minutes à température ambiante. Dès que les cellules se détachent de la boîte, ajoutez 0,5 millilitre de milieu de croissance et mélangez soigneusement par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette. Transférez les cellules de chaque puits dans un tube de deux millilitres et faites-les précipiter à l’aide d’une centrifugeuse de table.Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette sans perturber le culot cellulaire. Lavez les cellules en ajoutant un millilitre de PBS glacé et en pipetant doucement la suspension cellulaire vers le haut et vers le bas. Culer les cellules dans une centrifugeuse de table.Retirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette sans détacher le culot cellulaire. Ajouter 200 microlitres de tampon de lyse glacé, resuspendre les cellules en pipetant plusieurs fois de haut en bas, puis placer sur de la glace. Protéger immédiatement le lysat de la lumière en recouvrant les tubes de papier d’aluminium, car l’iodoacétamide contenu dans le tampon de lyse est sensible à la lumière.Incuber sur de la glace pendant 30 minutes. L'utilisation d'iodoacétamide est cruciale, car elle protège de façon irréversible le groupe thiol des cystéines libres en formant une liaison thioéther et empêche l'agrégation artificielle des protéines. Ensuite, éliminer les débris cellulaires par centrifugation dans une centrifugeuse de table prérefroidie.Pendant la centrifugation, préparez des colonnes de dialyse ayant une limite de poids moléculaire de 10 000. Fixez les colonnes de dialyse à une bouée flottante et placez-les dans un bécher rempli de tampon de dialyse prérefroidi afin d'équilibrer les colonnes. Ne touchez pas à la membrane.Placer un agitateur magnétique dans un bécher et transférer le bécher dans la chambre froide. À l’aide de l’agitateur magnétique, assurer un brassage doux et équilibrer pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après 20 minutes, retirer les colonnes du tampon de dialyse et du flotteur. Transférez les lysats clarifiés dans les colonnes de dialyse préparées à l’aide d’une pipette, sans toucher la membrane. Fixez les colonnes à une bouée flottante. Replacez-les dans le bécher rempli de tampon de dialyse, puis transférez le bécher dans la chambre froide.Dialysez le lysat pendant au moins quatre heures à quatre degrés Celsius tout en remuant soigneusement à l’aide d’un agitateur magnétique, afin d’éliminer les petits métabolites et sels pouvant interférer avec l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant. Une fois la dialyse terminée, transférez chaque échantillon dialysé dans un tube de 1,5 millilitre. Éliminez les précipités par centrifugation dans une centrifugeuse de table.L'électrophorèse doit être effectuée immédiatement après la dialyse des lysats afin d'éviter la dissociation des complexes protéiques oligomériques. Remplissez les chambres de gel intérieure et extérieure avec du tampon de migration prérefroidi. Faites pré-courir le gel de polyacrylamide non dénaturant avec du tampon de migration prérefroidi à 25 milliampères par gel pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Mélangez 15 microlitres du lysat préparé avec cinq microlitres de tampon d'échantillon 4X. Chargez une protéine standard native au choix et 15 microlitres d'échantillon sur le gel. Faites migrer le gel à 25 milliampères pendant quatre heures à quatre degrés Celsius.Lorsque l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant est terminée, démonter le gel et le transférer soigneusement dans du tampon SDS. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante avec agitation douce. Préparer deux éponges, quatre feuilles de papier filtre en cellulose et une membrane de transfert par gel, puis les imbiber de tampon de transfert.Assemblez le sandwich comme suit, du bas vers le haut : une éponge, deux feuilles de papier filtre en cellulose, une membrane de transfert, le gel, deux feuilles de papier filtre en cellulose et une éponge. Placez le sandwich dans la cuve de transfert, en veillant à ce que la membrane soit orientée vers le pôle positif et le gel vers le pôle négatif.Remplissez le réservoir de transfert avec du tampon de transfert prérefroidi. Pour obtenir les meilleurs résultats de transfert des protéines, effectuez le transfert à 90 milliampères pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, démontez le sandwich.Incubez la membrane dans la solution de Ponceau S pendant cinq minutes à température ambiante pour visualiser l'échelle de protéines. Décolorez la membrane en la plaçant dans de l'eau déionisée et en la lavant. Après avoir transféré la membrane dans un récipient, marquez les bandes de l'échelle de protéines à l'aide d'un stylo.Bloquez la membrane avec le tampon de blocage pendant au moins une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Par la suite, les protéines d'intérêt sont visualisées par immunomarquage à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre MxA, comme décrit dans le protocole textuel. Les virocellules dépourvues de MxA endogène ont été transfectées avec MxA de type sauvage recombinant ainsi qu'avec des variantes de MxA monomérique et dimérique.La migration de la variante recombinante de MxA à leur poids moléculaire attendu a confirmé leur état oligomérique. La protéine MxA de type sauvage exprimée de façon ectopique a migré sous forme de tétramère. Ces protéines recombinantes ont ensuite été utilisées pour évaluer l'état oligomérique de la protéine MxA humaine endogène provenant de cellules A549 stimulées par l'interféron-alpha.Le résultat a révélé que la taille de MxA dans les lysats de cellules A549 stimulées par l'interféron-alpha correspond à un tétramère. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un jour et demi si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas congeler et décongeler les échantillons pendant toute la durée de l'expérience, car cela pourrait détruire les interactions protéiques ou provoquer des agrégations protéiques.En outre, lorsqu'on travaille avec des réactifs sensibles à la lumière, comme l'iodoacétamide, il est important de protéger les échantillons de la lumière pendant l'étape de lyse. Après l'électrophorèse SDS-PAGE non dénaturante, d'autres méthodes comme l'extraction de protéines à partir de gel, l'activité enzymatique AsiS ou une électrophorèse en seconde dimension peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'activité enzymatique et la caractérisation de complexes hétéro-oligomériques potentiels. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la composition des complexes protéiques oligomériques dans des cellules en culture.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des lysats cellulaires à partir de cultures cellulaires afin d'étudier les protéines oligomériques par électrophorèse sur gel natif. N'oubliez pas que le travail avec l'iodoacétamide peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et de protections oculaires, doivent toujours être prises.

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