Caractérisation des complexes multi-unité de protéine MxA humaine utilisant dénaturant non-Gel-électrophorèse polyacrylamide

L'objectif général de cette expérience est de déterminer le nombre de sous-unités dans des complexes protéiques homooligomériques présents dans des lysats cellulaires à l'aide d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium non dénaturant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que le statut oligomérique des protéines impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux. Le principal avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite ni la purification des complexes protéiques homooligomériques ni l'utilisation d'équipements spécialisés coûteux.

Par conséquent, il peut être réalisé dans la plupart des laboratoires. Cette expérience utilise deux types de cellules : des cellules A549 qui expriment la protéine de résistance aux myxovirus A, ou MxA, de façon endogène ; et des virocellules qui surexpriment MxA.

Ensemencer les cellules A549 et les virocellules dans des boîtes de six puits avec deux millilitres de milieu de croissance par puits. Incuber les cellules pendant la nuit dans une incubateur de culture cellulaire. Le jour suivant, récolter les cellules.

Lavez chaque puits avec un millilitre de PBS et détachez les cellules en ajoutant 0,5 millilitre de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant environ cinq minutes à température ambiante. Dès que les cellules se détachent de la boîte, ajoutez 0,5 millilitre de milieu de croissance et mélangez soigneusement par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette. Transférez les cellules de chaque puits dans un tube de deux millilitres et faites-les précipiter à l’aide d’une centrifugeuse de table.

Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette sans perturber le culot cellulaire. Lavez les cellules en ajoutant un millilitre de PBS glacé et en pipetant doucement la suspension cellulaire vers le haut et vers le bas. Culer les cellules dans une centrifugeuse de table.

Retirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette sans détacher le culot cellulaire. Ajouter 200 microlitres de tampon de lyse glacé, resuspendre les cellules en pipetant plusieurs fois de haut en bas, puis placer sur de la glace. Protéger immédiatement le lysat de la lumière en recouvrant les tubes de papier d’aluminium, car l’iodoacétamide contenu dans le tampon de lyse est sensible à la lumière.

Incuber sur de la glace pendant 30 minutes. L'utilisation d'iodoacétamide est cruciale, car elle protège de façon irréversible le groupe thiol des cystéines libres en formant une liaison thioéther et empêche l'agrégation artificielle des protéines. Ensuite, éliminer les débris cellulaires par centrifugation dans une centrifugeuse de table prérefroidie.

Pendant la centrifugation, préparez des colonnes de dialyse ayant une limite de poids moléculaire de 10 000. Fixez les colonnes de dialyse à une bouée flottante et placez-les dans un bécher rempli de tampon de dialyse prérefroidi afin d'équilibrer les colonnes. Ne touchez pas à la membrane.

Placer un agitateur magnétique dans un bécher et transférer le bécher dans la chambre froide. À l’aide de l’agitateur magnétique, assurer un brassage doux et équilibrer pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après 20 minutes, retirer les colonnes du tampon de dialyse et du flotteur.

Transférez les lysats clarifiés dans les colonnes de dialyse préparées à l’aide d’une pipette, sans toucher la membrane. Fixez les colonnes à une bouée flottante. Replacez-les dans le bécher rempli de tampon de dialyse, puis transférez le bécher dans la chambre froide.

Dialysez le lysat pendant au moins quatre heures à quatre degrés Celsius tout en remuant soigneusement à l’aide d’un agitateur magnétique, afin d’éliminer les petits métabolites et sels pouvant interférer avec l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant. Une fois la dialyse terminée, transférez chaque échantillon dialysé dans un tube de 1,5 millilitre. Éliminez les précipités par centrifugation dans une centrifugeuse de table.

L'électrophorèse doit être effectuée immédiatement après la dialyse des lysats afin d'éviter la dissociation des complexes protéiques oligomériques. Remplissez les chambres de gel intérieure et extérieure avec du tampon de migration prérefroidi. Faites pré-courir le gel de polyacrylamide non dénaturant avec du tampon de migration prérefroidi à 25 milliampères par gel pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Mélangez 15 microlitres du lysat préparé avec cinq microlitres de tampon d'échantillon 4X. Chargez une protéine standard native au choix et 15 microlitres d'échantillon sur le gel. Faites migrer le gel à 25 milliampères pendant quatre heures à quatre degrés Celsius.

Lorsque l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant est terminée, démonter le gel et le transférer soigneusement dans du tampon SDS. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante avec agitation douce. Préparer deux éponges, quatre feuilles de papier filtre en cellulose et une membrane de transfert par gel, puis les imbiber de tampon de transfert.

Assemblez le sandwich comme suit, du bas vers le haut : une éponge, deux feuilles de papier filtre en cellulose, une membrane de transfert, le gel, deux feuilles de papier filtre en cellulose et une éponge. Placez le sandwich dans la cuve de transfert, en veillant à ce que la membrane soit orientée vers le pôle positif et le gel vers le pôle négatif.

Remplissez le réservoir de transfert avec du tampon de transfert prérefroidi. Pour obtenir les meilleurs résultats de transfert des protéines, effectuez le transfert à 90 milliampères pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, démontez le sandwich.

Incubez la membrane dans la solution de Ponceau S pendant cinq minutes à température ambiante pour visualiser l'échelle de protéines. Décolorez la membrane en la plaçant dans de l'eau déionisée et en la lavant. Après avoir transféré la membrane dans un récipient, marquez les bandes de l'échelle de protéines à l'aide d'un stylo.

Bloquez la membrane avec le tampon de blocage pendant au moins une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Par la suite, les protéines d'intérêt sont visualisées par immunomarquage à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre MxA, comme décrit dans le protocole textuel. Les virocellules dépourvues de MxA endogène ont été transfectées avec MxA de type sauvage recombinant ainsi qu'avec des variantes de MxA monomérique et dimérique.

La migration de la variante recombinante de MxA à leur poids moléculaire attendu a confirmé leur état oligomérique. La protéine MxA de type sauvage exprimée de façon ectopique a migré sous forme de tétramère. Ces protéines recombinantes ont ensuite été utilisées pour évaluer l'état oligomérique de la protéine MxA humaine endogène provenant de cellules A549 stimulées par l'interféron-alpha.

Le résultat a révélé que la taille de MxA dans les lysats de cellules A549 stimulées par l'interféron-alpha correspond à un tétramère. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un jour et demi si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas congeler et décongeler les échantillons pendant toute la durée de l'expérience, car cela pourrait détruire les interactions protéiques ou provoquer des agrégations protéiques.

En outre, lorsqu'on travaille avec des réactifs sensibles à la lumière, comme l'iodoacétamide, il est important de protéger les échantillons de la lumière pendant l'étape de lyse. Après l'électrophorèse SDS-PAGE non dénaturante, d'autres méthodes comme l'extraction de protéines à partir de gel, l'activité enzymatique AsiS ou une électrophorèse en seconde dimension peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'activité enzymatique et la caractérisation de complexes hétéro-oligomériques potentiels. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la composition des complexes protéiques oligomériques dans des cellules en culture.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des lysats cellulaires à partir de cultures cellulaires afin d'étudier les protéines oligomériques par électrophorèse sur gel natif. N'oubliez pas que le travail avec l'iodoacétamide peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et de protections oculaires, doivent toujours être prises.