Perturbations de circulation miARN dans le syndrome du côlon irritable détectée en utilisant un multiplexée à haut débit Gene Expression Plate-forme
30 novembre 2016
Nous décrivons l’utilisation d’une plateforme d’expression génique multiplexée à haut débit qui quantifie l’expression génique en codant à barres et en comptant les molécules dans les substrats biologiques sans avoir besoin d’amplification. Nous avons utilisé la plateforme pour quantifier l’expression des microARN (miARN) dans le sang total chez des sujets avec et sans syndrome du côlon irritable.
L'objectif général de ce protocole de quantification multiplexe des acides nucléiques est de quantifier numériquement l'expression des microARN dans le sang total. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude des troubles digestifs. Elle facilite l'identification des mécanismes moléculaires dysrégulés et des signatures de biomarqueurs, tels que les microARN.
Le principal avantage de cette technique est que la quantification des microARN ne repose pas sur une amplification. Cette technologie dénombre numériquement les cibles moléculaires et est largement automatisée. Pour purifier l'ARN total, décongelez et incubez les échantillons de sang total prélevés et congelés auparavant pendant deux heures.
Utilisez un rotor à godets oscillants pour centrifuger les tubes à 5 000 ×g pendant dix minutes à température ambiante. Ensuite, retirez les surnageants en les versant ou en les pipetant soigneusement dans un tube de déchets, en prenant soin de ne pas perturber le culot. Ajoutez quatre millilitres d'eau sans RNase au culot.
Refermez hermétiquement le bouchon et vortexez jusqu'à ce que le culot soit complètement dissous. Ensuite, centrifugez à nouveau le tube et retirez le surnageant. Puis, ajoutez 350 microlitres de tampon BM1 au culot et vortexez jusqu'à ce que le culot soit visiblement dissous.
Ensuite, transférez l'échantillon dans un tube de traitement de deux millilitres pour l'extraction automatisée d'ARN total. À l'aide d'un kit d'extraction d'ARN disponible dans le commerce, effectuez une purification automatisée de l'ARN intracellulaire, incluant les microARN, à partir de l'échantillon de sang total, en chargeant dans le système robotique d'extraction d'ARN les embouts de pipette préchargés, les tubes de centrifugation, les tampons et les réactifs fournis dans le kit de purification d'ARN. Dans le menu de sélection des protocoles, choisissez le protocole Blood miRNA PartA et démarrez l'analyse.
Effectuez l'extraction de l'ARN et conservez les échantillons conformément au protocole écrit. Préparez les échantillons de micro-ARN en utilisant d'abord de l'eau exempte de RNase pour normaliser 12 échantillons d'ARN à 33 nanogrammes par microlitre. À l'aide d'eau exempte de nucléase, préparez une dilution au 1/500 des contrôles de micro-ARN fournis dans le kit d'analyse, et maintenez-les sur glace.
Ensuite, préparez le mélange maître d'hybridation en combinant 13 microlitres de tampon d'hybridation, 26 microlitres du réactif micro R-tag et 6,5 microlitres des contrôles de microARN. Ajoutez 3,5 microlitres du mélange maître d'hybridation dans chacun des 12 tubes en bande de 0,2 millilitre, puis ajoutez 3 microlitres de l'échantillon d'ARN. Agitez doucement les tubes pour mélanger, centrifugez-les à 2000 ×g à l'aide d'une microcentrifugeuse miniaturisée sur banc, puis placez les tubes dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant.
Ensuite, préparez un mélange maître de ligature en combinant trois microlitres du tampon de ligature et 19,5 microlitres de PEG. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres du mélange maître de ligature à chacune des réactions. Après avoir homogénéisé et centrifugé brièvement les tubes, replacez-les dans le thermocycleur à 48 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, ajoutez un microlitre de ligase directement dans chaque échantillon toujours placé dans le bloc du thermocycleur, puis incubez les tubes selon le programme suivant. Mélangez délicatement et centrifugez brièvement les tubes, puis ajoutez un microlitre d'enzyme de purification de la ligation à chaque échantillon. Incubez ensuite les tubes dans le thermocycleur comme indiqué ici.
Après l'incubation, ajouter 40 microlitres d'eau exempte de RNase aux échantillons avant de les mélanger et de les centrifuger. Pour réaliser l'hybridation des microARN, décongeler les jeux de sondes rapporteur et de capture fournis sur de la glace, puis les centrifuger. Ajouter 130 microlitres de tampon d'hybridation au jeu de code rapporteur 2 et mélanger pour préparer le mélange maître d'hybridation.
Dans 12 nouveaux tubes en bande de 0,2 millilitre, ajouter 20 microlitres du mélange maître d'hybridation. Dénaturez les échantillons de microARN préparés juste avant à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-les sur de la glace. Ensuite, ajoutez 5 microlitres des échantillons de microARN dans chacun des tubes en bande contenant le mélange maître d'hybridation.
Programmez le thermocycleur à 65 degrés Celsius, à une température calculée selon un volume de 30 microlitres, et réglez le couvercle chauffant sur la durée « Forever » afin qu'il ne redescende pas à 4 degrés Celsius à la fin du cycle. Ajoutez 5 microlitres du jeu de sondes de capture dans chaque tube, puis mélangez. Ensuite, après une brève centrifugation, placez immédiatement les tubes dans le thermocycleur à 65 degrés Celsius.
Incuber les échantillons pendant au moins 12 heures, et pas plus de 30 heures. Préparer la station en réchauffant d'abord la cartouche et les plaques à température ambiante. Ensuite, centrifuger les plaques.
Pour charger la station de préparation, ouvrez la porte de la station et placez les plaques de réactifs, la cartouche, les embouts de pipette, les échantillons préparés dans des tubes en bande de 0,2 millilitre, ainsi que deux tubes en bande vides de 0,2 millilitre à 12 puits, aux emplacements appropriés du robot. Retirez les bouchons des tubes en bande et le couvercle de la plaque de réactifs. Ensuite, fermez la porte de la station de préparation et lancez le dosage approprié depuis le panneau de contrôle.
Pour visualiser et compter les codes à barres des complexes tripartites immobilisés et orientés, retirez la cartouche de la station de préparation, scellez-la à l’aide du couvercle fourni, puis placez-la dans l’analyseur numérique dans un emplacement disponible. Utilisez l’écran tactile pour créer un fichier de définition de cartouche, ou CDF. Assurez-vous que le fichier de bibliothèque de rapporteur approprié est attribué à chaque échantillon dans le CDF.
Une fois l'analyse terminée, téléchargez les fichiers de données à partir de l'analyseur numérique à l'aide d'une clé USB ou par courrier électronique, avant de traiter et d'analyser les données conformément au protocole de contrôle qualité et d'analyse associé. Le système d'analyse de plateforme d'expression génique réduit le bruit technique grâce à son caractère hautement automatisé, et la chimie unique qu'il utilise produit des données d'expression génique de haute précision. Les réplicats techniques présentés ici démontrent la forte reproductibilité possible dans la quantification de l'expression des microARN endogènes et viraux.
Grâce à cette méthode, les microARN codés par des virus et les microARN humains endogènes qui présentent un écart par rapport à l'expression attendue, définie par les participants sains à l'étude, peuvent être identifiés comme des cibles d'intérêt dans le SII. La précision et la sensibilité de la méthode permettent de détecter des perturbations parmi les cibles faiblement exprimées, et des perturbations subtiles peuvent également être observées de manière fiable. Ces figures montrent certaines des perturbations observées dans les microARN circulants chez les patients atteints de SII et ses sous-types, par rapport aux témoins sains.
Les deux microARN les plus significativement et différemment augmentés chez les participants atteints du SCI sont présentés ici. Les courbes de ce tracé en violon indiquent la fréquence des décomptes pour le miR-150. Les barres verticales représentent le premier et le troisième quartile, et le carré rouge indique le décompte médian.
Après cette procédure, des tests personnalisés plus ciblés, basés sur la même technologie, peuvent être réalisés afin de valider des signatures de biomarqueurs dans des cohortes plus importantes et d'explorer les associations essentielles entre ARN et protéines. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche biomédicale pour concevoir rapidement, avec précision et exactitude, des panels de biomarqueurs diagnostiques pour les maladies.
Aperçu
Cet article présente une plateforme multiplexe à haut débit pour l'expression génique, conçue pour quantifier l'expression des microARN dans des échantillons de sang total. La méthode permet une mesure précise sans amplification, ce qui la rend adaptée à l'étude de pathologies telles que le syndrome du côlon irritable.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Analyse de l'expression génique
- Quantification des microARN
- Recherche sur les troubles digestifs
Contexte
- Les microARN jouent un rôle crucial dans la régulation des gènes.
- Comprendre leur expression peut fournir des informations sur diverses maladies.
- Les méthodes actuelles s'appuient souvent sur l'amplification, ce qui peut introduire des variations.
- Cette étude vise à surmonter ces limitations grâce à une approche novatrice.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de quantification numérique des microARN dans le sang.
- Identifier les mécanismes moléculaires dysrégulés dans le syndrome du côlon irritable.
- Établir des signatures de biomarqueurs pour les troubles digestifs.
Méthodes utilisées
- Extraction automatisée de l'ARN à partir d'échantillons de sang total.
- Préparation d'échantillons de microARN à l'aide de réactifs spécifiques.
- Hybridation et procédés de ligature pour la détection des microARN.
- Analyse numérique des données d'expression génique à l'aide d'une plateforme spécialisée.
Résultats principaux
- La méthode a démontré une grande précision dans la quantification des niveaux de microARN.
- Les réplicats techniques ont montré une reproductibilité des résultats.
- Identification de microARN dont l'expression s'écarte des profils normaux.
- Des perturbations subtiles dans les cibles faiblement exprimées ont été détectées de manière fiable.
Conclusions
- La plateforme multiplex offre un outil robuste pour l'étude des microARN dans le sang.
- Elle peut contribuer à la compréhension des bases moléculaires des troubles digestifs.
- Cette approche pourrait conduire à la découverte de nouveaux biomarqueurs pour le syndrome du côlon irritable.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette plateforme multiplexée de quantification à haut débit de l'expression génique permet une quantification robuste et sans amplification des ARNmi circulants, soutenant ainsi la découverte de biomarqueurs dans les troubles digestifs tels que le syndrome du côlon irritable. En offrant une haute sensibilité et une bonne reproductibilité pour la détection de perturbations des ARNmi faiblement exprimés, cette méthode renforce la confiance dans la validation des cibles et réduit l'ambiguïté mécanistique en phase précoce de découverte. Son flux de travail automatisé et son approche par comptage numérique améliorent la standardisation et la scalabilité des tests pour les équipes pluridisciplinaires de recherche et développement.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en identifiant des miARN circulants dysrégulés comme biomarqueurs potentiels dans le syndrome de l'intestin irritable.
- Valeur opérationnelle : Soutient la dé-risquisation biologique grâce à une quantification précise et sans amplification, minimisant ainsi la variabilité technique.
- Valeur prédictive : Facilite la détection de perturbations subtiles des miARN, renforçant la confiance dans la pertinence des cibles et les décisions de triage des portefeuilles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives d'expression des ARNmi hautement reproductibles, adaptées à la standardisation des tests et au développement de panels de biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Réduit les effets liés à l'expérimentateur grâce à une préparation des échantillons et à un traitement robotisé largement automatisés, augmentant ainsi le débit et la cohérence.
- Extensibilité : Permet l'analyse multiplexée de jusqu'à 800 transcrits par réaction, permettant un criblage efficace des signatures d'ARNmi dans des cohortes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet la validation de biomarqueurs d'ARNmi circulants découverts dans des échantillons humains en vue d'investigations précliniques ultérieures.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet de corréler les variations d'expression des ARNmi avec les sous-types de maladie, contribuant ainsi à la compréhension de la physiopathologie.
- Fiabilité prédictive : Permet une détection fiable des ARNmi peu abondants, améliorant la sensibilité des biomarqueurs et réduisant le risque de faux négatifs dans les études translationnelles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant du criblage de biomarqueurs fondé sur une hypothèse à la validation d'essais, en soutenant la progression de la découverte précoce à l'identification de candidats prometteurs dans la recherche sur les troubles digestifs.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses en quantifiant les variations d'expression des miARN dans le sang total, précisant ainsi les voies moléculaires dysrégulées dans le syndrome de l'intestin irritable (IBS).
- Dépistage : Fournit des résultats quantitatifs prêts à l'analyse, avec une forte linéarité et sensibilité, facilitant l'évaluation fiable de composés ou de biomarqueurs.
- Analytique : Fournit des décomptes numériques sous forme de codes-barres et des données d'expression normalisées, permettant des comparaisons statistiques entre différentes conditions et cohortes.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes sur les miARN circulants à leur pertinence pathologique, soutenant la continuité des biomarqueurs vers la validation préclinique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable et automatisée de profilage des miARN, applicable à plusieurs domaines thérapeutiques au-delà des troubles gastro-intestinaux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant le bruit technique et en permettant la détection de variations d'expression faibles des miARN.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à l'automatisation, en minimisant les effets de lot et la variabilité entre utilisateurs.
- Valeur stratégique : Permet de mieux orienter les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données solides sur les biomarqueurs, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée dû à des cibles mal validées.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des biomarqueurs à base de miARN, fondée sur des variations d'expression reproductibles et quantifiables dans des échantillons cliniquement pertinents.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des acides nucléiques, les systèmes automatisés de manipulation liquide et l'analyse d'images numériques pour une quantification précise des miARN.
- Dépend de l'accès à des stations de préparation robotisées, à des analyseurs numériques et à des jeux de sondes fluorescentes propriétaires munis de codes-barres colorés.
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles de collecte des échantillons, de normalisation de l'ARN et d'hybridation afin d'assurer la comparabilité des données.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application du test à différents liquides biologiques ou types de tissus autres que le sang total.
- Limité par la nécessité de réactifs et d'équipements spécialisés, ce qui peut restreindre son adoption dans les contextes à ressources limitées, malgré une forte reproductibilité.
